Normothermic hjärtstopp och hjärt-lungräddning: en musmodell av ischemi-reperfusion skada

Summary

En kraftfull modell för perioperativ och intensivvård akut njurskada presenteras. Använda hela kroppen hypoperfusion framkallas av hjärtstillestånd är det möjligt att nästan replikera histologisk och funktionella förändringar av klinisk AKI.

Abstract

Akut njurskada (AKI) är en vanlig, mycket dödlig, komplikation av kritisk sjukdom som har en hög dödlighet ^1-4 och som oftast orsakas av hela kroppen hypoperfusion. ^5,6 Framgångsrik reproduktion av hela kroppen hypoperfusion i gnagarmodeller har varit fylld med svårigheter. ^7-9,9,10 modeller som sysselsätter fokus ischemi upprepade gånger har visat resultat som inte översätter till klinisk miljö, och större djurmodeller som möjliggör hela kroppen hypoperfusion saknar tillgång till hela verktygen av genmanipulation möjligt i musen. ^11,12 Men på senare år en musmodell av hjärtstopp och hjärt-lungräddning har framkommit som kan anpassas för att modellera AKI. ¹³ Denna modell tillförlitligt återger fysiologiska, funktionella, anatomisk och histologisk utfall observerats i kliniska AKI , snabbt repeterbart, och erbjuder alla de stora fördelarna med en mus kirurgiska modellen, bland annat tillgång till genetiska manipulativa tekniker, låg kostnad i förhållande till stora djur, och användarvänlighet. Vår grupp har utvecklat en omfattande erfarenhet av användning av denna modell för att bedöma ett antal organ-specifika resultat i AKI. ^14,15

Protocol

Alla beskrivna förfarandena bedrivs i enlighet med National Institutes of Health riktlinjer för vård och användning av djur i forskning och alla animaliska protokoll godkändes av Oregon Health & Science University Institutionella Djurvård och användning kommittén.

1. Kirurgiska Förberedelser

1. Väg musen. Det förfarande som beskrivs utförs på C57BL / 6 möss som väger mellan 20 och 25 g. Anestesi induceras i en induktion låda med 3-4% isofluran, och därefter underhålls med 1,5-2,5% isofluran i luft / syre blandning.
2. Smörj ögonen och placera djuret liggande på en värmedyna. Immobilisera 4 extremiteter med tejp. Det hind-tassar kan vara tejpade i en neutral position, bör dock framtassarna säkras så nära bröstkorgen som möjligt för att tillåta fullständig utflykt bröstkorgen under bröstkompressioner.
3. Smörj och placera en rektaltemperatur sond. Temperaturen styrs med en värmedyna och lampa kopplad till en elektronisk temperaturkontroll (Digi-Sense, Cole Parmer, Vernon Hills IL), som är satt att upprätthålla 37,0 ° C. Eftersom det är möjligt att en temperaturgradient inom djuret kan utvecklas under no-flöde staten, är det viktigt att temperaturen mäts och kontrolleras nära orgeln av intresse.
4. Intuberas luftstrupen med hjälp av en 2,5 cm 22 GA teflon kateter (Insyte-W, BD, Franklin NJ) och skär distala änden av en vinklad introduktör (Frova introducerns, Cook Medical, Bloomington IN). Andra metoder för intubation är acceptabla, men användningen av den vinklade introduktör tillåter korrekt placering av halsen i en något utsträckt position, vilket optimerar kirurgisk exponering för placering av den intravenösa kateter. Den endotrakeal kateter nav är säkrad med en ögla av sutur till framtand och upprätthålls med små spänningar att immobilisera huvudet under bröstkompressioner.
5. Mekaniskt ventilera musen med en gnagare fläkt inställd på 140 mikroliter, 150 andetag / minut. Detta är inte justerat för vikt som detta protokoll utförs alltid i 20-25 g djur. Inte över-fördjupa anestesi. Ställ inte fläkten att tillämpa slutet expiratory tryck som detta försämrar återupplivning.
6. Användning av steril teknik och ett rörelseresultat mikroskop, lägga en förhandsorder spolas PE-10 kateter i halspulsåder. Vardera sidan får användas, men användningen av den sida som är närmast föraren minskar risken för kateter dislodgement under bröstkompressioner eller andra manipulationer. 0,5% bupivicaine är 0,1 ml infitrated i sårkanterna för att kontrollera postoperativ smärta.
7. Säkra PE-10 kateter in i huden stängningen med cyanoakrylat kirurgiskt klister.
8. Placera subkutan EKG-elektroder och ansluta till övervakning enhet. Noggrann uppmärksamhet på signalvägen och maximering av signalen i sig är avgörande för framgången för återupplivning. Se till att alla kablar är säkrade till operativsystemet ytan, minimera signal korsningar, och minimera isolatorer (som luft i ihåliga nålar eller tvinnad tråd) i signalvägen. Solid nålar ansluten till nonstranded blytråd kan köpas eller göras i labbet. När du är ansluten optimera EKG-signalen på skärmen.

2. Hjärtstillestånd

1. Se till att musen är normothermic, definierat som rektaltemperatur 36,5 ° C - 37,5 ° C. Administrera 40 mikroliter av rumstemperatur 0,5 M kaliumklorid intravenöst och observera isoelektriska spårning på EKG. Dosjustering för vikt är inte nödvändigt inom intervallet 20-25 g. Starta gripandet timer.
2. Koppla fläkten. Avbryta anestesiångor. Stäng av värmedyna och annan utrustning som tillverkar elektroniska brus som kan störa EKG övervakning. Placera en isolerande filt över musen.
3. Spela in temperaturen varje minut under hjärtstillestånd. Vid behov kan en värme lampa användas för att få kärntemperatur upp till normothermic sortimentet. Under hjärtstillestånd, förbereda materiel och utrustning (till exempel adrenalin sprutan) för återupplivning. En checklista kan vara till hjälp för att säkerställa oavbruten återupplivning, vilket är nödvändigt för överlevnad.
4. Efter 7 minuter och 30 sekunder av hjärtstillestånd, anslut fläkten och öka hastigheten till 180 andetag / min, hålla tidalvolymen vid före gripandet inställning.
5. På 8 minuter, initiera bröstkompressioner vid 300 BPM. Rörelseartefakt på EKG kan användas för att bedöma HLR kurs. Bröstkompressioner ska levereras med pekfingret, 5 mm över xiphoid processen och något till vänster om mittlinjen. Kistan ska vara komprimerad 1/3-1/2 av anteroposterior avstånd och full rekyl skall lämnas mellan kompressioner. Finger positionering och optimal kompression trycket är helt avgörande. Underlåtenhet att uppnå överlevnad i denna modell är nästan alltid på grund av suboptimala HLR.
6. Infundera 0,5 ml adrenalin, spädd till 15 mikrogram / ml, under de första 30 sekunderna av HLR. Totalt adrenalin dosen 8-12 mikrog. Noggrant följa de EKG för retur av spontan cirkulation (ROSC). Begränsa komplexa QRS-komplex ses mellan kompression artefakter. ROSC inträffar oftast mellan 90 sekunder och 2 minuter efter påbörjad HLR. Återupplivning är övergivet om ROSC inte sker med 3 minuter. Täta prematura ventrikulära kontraktioner och förändringar i EKG-axeln observeras under de första två minuter efter ROSC, och nästan alltid lösa i stadig sinustakykardi på 2 minuter.
7. Rekord totala tiden för återupplivning och adrenalin dosen. Spela in temperaturen varje minut under 10 minuter efter ROSC.
8. EKG leder kan tas bort när spontanandning börjar, oftast inom 12-15 minuter efter ROSC.
9. Extubera luftstrupen när spontan andningsfrekvens är> 60/min.
10. Placera musen i en återhämtning bur på en temperaturstyrd yta inställd på 37 ° C för de första 2 timmarna postprocedure, säkerställer enkel tillgång till mat och vatten. Buren kan då flyttas till standard postoperativa bostadsförhållanden när musen helt har återhämtat sig från anestesi och är aktiv.

3. Exsanguination / perfusion-fixering och njure Harvest

1. 24h efter CA / HLR, inducera anestesi med isofluran 3-4% och säkra djuret i ryggläge på en kirurgisk yta i ett dragskåp som är lämplig för användning med formalin ..
2. Fördjupa bedövning genom att gradvis öka anestesiångor koncentrationen till 5% och se till att musen är djupt sövd, vilket framgår av upphörande av spontanandning.
3. Utför en gripskopa torakotomi och exsanguinate musen via apikala punktering av hjärtats vänstra kammare enligt standard tekniker.
4. Via samma nål, administrera 0,9% koksaltlösning genom långsam infusion. För att acclerate perfusion / exsanguination, nick rätt förmak med en sax. Utför en laparotomi och observera njurarna. När de är skållade kan koksaltlösning ändras till 4% formalin för fixering. Njurarna är sedan inbäddade i paraffin och färgades med Fluoro-jade B för kvantifiering av tubulär epitelnekros.

4. Representativa resultat:

När CA är inducerad, genomsnittligt blodtryck (MAP) och regionala renalt blodflöde (RRBCF) sjunker till nära noll och förblir stabila till återupplivning börjar (Figur 1). 24h efter CA / HLR, serum index av njurfunktion (urea, BUN och kreatinin) är markant förhöjt i förhållande till bluff-drivs djuren. ASAT / ALAT är också förhöjda, ger belägg för djupgående helkropps ischemi (figur 2). Neutrofilmedierad gelatinase tillhörande lipocalin (NGAL), en känslig indikator på nedsatt ischemisk skada är massivt uppregleras 24h efter CA / HLR (Figur 3). Slutligen mikrofotografier demonstrera ojämn, medullär nekros typiskt för ischemisk njurskada med gallring av tubulär epitel och luminala fylla på hematoxylin och eosin fläcken (Figur 4, panel a) och omfattande celldöd i medullär tubulärt epitel när färgats med fluor-jade B ( Figur 4, panel B).

Figur 1. Hjärtstillestånd inducerar omedelbar förlust av perfusionstryck, företrädd här som genomsnittligt blodtryck (MAP) mätt i femoralartärområdet, vilket resulterar i nästan fullständigt upphörande av regionala nedsatt kortikal blodflöde (RRCBF) under hela hjärtstillestånd (skuggade området). Återupplivning med bröstkompressioner och återgår adrenalin MAP till det normala och RRCBF stadigt stiger i inlägget återupplivning perioden. Återges med tillstånd från ^14.

Figur 2. 24h postprocedure, urea (BUN), serumkreatinin och omfattningen av tubulär celldöd är alla signifikant förhöjda hos djur som genomgått CA / HLR jämfört med djur som behandlats med en bluff förfarande. CA / HLR inducerar en pan-organismbiologi ischemisk förolämpning, här framgår av massiva förhöjning av lever-funktion enzymer alaninaminotransferas (ALAT) och aspartataminotransferas (AST) i CA / HLR möss jämfört med simulerad injektion-behandlade djur.

Figur 3. Western blot utförs med hjälp av polyklonala antikroppar mot neutrofila gelatinase-associerad lipocalin (NGAL), en känslig indikator på nedsatt ischemisk skada. Urinprov har erhållits omedelbart före ("pre") och 24h efter ("24h") ÅB / HLR i 4 djur (märkta a, b, c och d ovan). NGAL är kraftigt uppreglerad vid musurinen efter CA / HLR. Återges med tillstånd från ^14.

Figur 4. A) hematoxylin och eosin fläck av en kort axel hilar avsnitt av njurvävnad 24h efter CA / HLR. Det är ojämn, men klart skador medullär och corticomedullary tubuli med tubulär pluggning. Pilarna pekar skadade tubuli med svullna, pyknotiska kärnor på corticomedullary korsning. B) Flouro-jade B fläck i samma region i samma djur, 24h efter CA / HLR. Fluoro-jade B fläckar nekrotiska celler ljust grönt, visar ojämn corticomedullary tubulär nekros. Pilarna pekar starkt färgade skadade tubuli på corticomedullary korsning. Dessa resultat är väsentligt liknar njurbiopsi fynd från människor som utvecklar AKI, och till skillnad från de som produceras av andra djurmodeller av AKI.

Discussion

Den normothermic modell av hjärtstopp och hjärt-lungräddning i musen erbjuder flera möjligheter till utvärdering i en modell som replikerar patofysiologin och morfologi av de vanligaste kliniska orsaken till AKI, hela kroppen hypoperfusion. Hypotesprövning kan vara hjälpt av tillgång till en arsenal av genetisk manipulation tekniker och väl förstådda och kännetecknas anatomi och fysiologi av laboratoriet musen.

Som beskrivs här, är överlevnad i erfarna händer 80%. Även om det kirurgiska förberedelse och efter gripandet vård är okomplicerad, är den faktiska återupplivning av en greps mus ett utmanande kirurgisk färdighet som kräver betydande praxis. Vår erfarenhet är framgångsrika resuscitations blivit norm efter ungefär de första 30-50 försök att återuppliva enskilda djur av en oerfaren kirurg, och konsekvent skada och återupplivning vidta ytterligare praktik. I synnerhet under den tidiga fasen av att lära sig tekniken (dvs. för den första 20 djur), är meningsfullt överlevnad osannolikt, och några överlevande ska avlivas omedelbart efter återupplivning för att förhindra onödigt lidande. Efter en tidig träning, då överlevande visar kraftig hjärt återhämtning i minuter efter återupplivning, är det lämpligt att fortsätta överlevande djuren under den 15 minuter efter ROSC märke. Djur som uppvisar kraftiga spontana respiratorisk insatser från den tidpunkten kommer sannolikt att överleva 24h med lämpliga återhämtning. Denna praxis fasen bör särskilt behandlas i IACUC protokoll. Den svåraste färdighet att lära sig är bröstkompressioner sig som det är svårt att ge kompressioner på behövs takt utan att öka trycket till skadliga nivåer. Mekaniska andningsballonger har tagits fram och används i våra labb och andra ¹⁶ men hittills inga mekaniska Andningsballong för musen har producerat acceptabel överlevnad.

Det finns vissa begränsningar för denna modell. Det första kan ingen musmodell modell fullt människans fysiologi, och resultaten måste tolkas med respekt för mellan arterna skillnader. I synnerhet är musen hjärtat robusta, vi uppnår 80% överlevnad vid 8 minuter av hjärtstillestånd, men i kliniska studier mänsklig överlevnad är mindre än 50% även med återupplivning börjar 2-3 minuter efter gripandet ¹⁷ Den lilla storleken på musen. gör rutiner tekniskt krävande, och det finns en betydande inlärningskurva, särskilt för bröstkompressioner. För det andra, i detta protokoll är läkemedelsdoser och inställningar ventilator inte indexerade till djurens vikt. Detta eftersom vi endast använder djur i 20-25 g Vikt intervall för att minimera effekten av utrustningens storlek. Till exempel använder vi en 22 gauge kateter för att intuberas luftstrupen, tätningen erhålls är inte densamma i en 30 g musen som det är i en 25 g mus och den ökade gasläcka kan vara fysiologiskt betydande. Men användningen av djur i en definierad viktintervall inte återge olika kroppen klasser som är föremål för kliniska ischemi-reperfusion skada. Tredje kan no-flödet staten inte troget replikera resultaten från låg-flöde stater. I synnerhet kan temperaturgradienter utvecklas inom musen under no-flöde. För att minimera effekten (om någon) av gradienter på resultat, är temperaturen mätas nära orgeln av intresse. Slutligen, på grund av tidiga data från våra labb som bekräftade betydande metabolisk acidos i postarrest perioden, hyperventilera vi under återupplivning. Som senaste uppgifterna tyder på att hyperventilering under HLR är skadliga, ^18,19 är det möjligt att denna praxis minskar överlevnad i modellen. Många alternativ modeller för hela kroppen ischemi reperfusion skador finns. Till exempel har CA / HLR har beskrivits hos hundar, ²⁰ kaniner, ²¹ lamm, ²² grisar, ²³ råttor, ¹⁶ och arktiska ekorrar jord. ²⁴

Vi har visat att postoperativ njurfunktionen kan utvärderas av ett antal kemiska, immunologiska eller histologiska tekniker på 24 timmar. Djur kan överleva längre än 24h, dock, och den övergående natur AKI gör denna modell en attraktiv att använda för undersökning av mekanismer för återhämtning och / eller permanent skada. Skadan i sig är titrerbar genom att ändra parametrarna för tid och temperatur under CA. Längre arresteringar och underhåll av högre temperaturer producera större skada (men negativ effekt överlevnad). Som vi har visat med den medföljande uppgifter leverfunktion, är andra organsystem påverkas också och kan undersökas med hjälp av anpassningar av denna modell kan dock betydande ansträngningar krävs för att optimera experimentella villkor för organsystem av intresse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potassium Chloride	Abbott Laboratories	06653-5
Isoflurane	Abbott Laboratories	05260-05 (and others)
Epinephrine HCl	Multiple Suppliers	Multiple
Digi-Sense temperature controller	Cole-Parmer	EW-89000-00
Angiocath IV Cath	VWR international	381134
Frova angled airway introducer	Cook	G27282
MicroVent Ventilator for Mice	Harvard Apparatus	733591