Summary
不定冠詞
Abstract
ほとんどの人間のマラリアの死亡は血液段階熱帯熱マラリア原虫の寄生虫によって引き起こされます。脳マラリア、疾患のほとんどの生命を脅かす合併症は、脳2-4の微小血管系における色 素栄養型の段階での熱帯熱マラリア原虫感染赤血球（iRBC）の蓄積によって特徴付けられる。この微小血管閉塞（隔離は）アシドーシス、低酸素症と有害な炎症性サイトカイン（5レビュー）につながる。隔離は、人間の体2、3のほとんどの微小血管の組織に含まれています。 iRBCが血管壁に付着するメカニズムはまだよくわかっていない。
不死化ヒト脳微小血管内皮細胞株（HBEC - 5iが）血液脳関門6のin vitroモデルとして使用されています。しかし、 熱帯熱マラリア原虫 iRBCは密sequestratとは異なり、in vitroで HBEC - 5Iにわずかしかアタッチ脳マラリアのケースで発生するイオン。そこで、（豊かに）様々なPを選択するためにパンアッセイを開発HBEC - 5Iへの接着のための熱帯熱マラリアは系統、 生体内で発生するものがのより多くの担当者に高い結合寄生虫の個体数を取得するため。
色素栄養型の段階で寄生虫の文化のサンプル（iRBCと感染していない赤血球の混合物）をペトリ皿上に成長させたHBEC - 5Iの層で洗浄し、インキュベートする。インキュベーション後、皿を優しくuRBCとバインドされていないiRBCから無料で洗浄される。新鮮なuRBCは一晩HBEC - 5iおよびインキュベーションに接続されているいくつかのiRBCに追加されます。バーストシゾント段階の寄生虫として、メロゾイトreinvade RBC及びこれらの環状期の寄生虫は、次の日に収穫されます。十分な材料が得られるまでの寄生虫は、培養する（通常は2〜4週間）と選択の新ラウンドを行うことができます。 P.に応じて熱帯熱マラリア原虫株の、選択の4〜7ラウンドは、人口を取得するために必要とされるほとんどの寄生虫はHBEC - 5Iに結合する場所。結合表現型は、徐々にこうしてHBEC - 5Iで通常の選択は表現型を維持するために必要とされ、変異表面抗原の遺伝子発現のスイッチを示し、数週間後に失われます。
要約すると、我々は、P.をレンダリング選択アッセイを開発熱帯熱マラリアは寄生虫より"脳マラリアの接着剤"の表現型を。我々は、4 P.のうち3つの選択することができたHBEC - 5Iで熱帯熱マラリア原虫株 。このアッセイはまた、正常ヒト皮膚と肺内皮細胞への結合のための寄生虫を選択するために使用されています。重要なのは、このメソッドは、脳の内皮に結合するための候補寄生虫リガンドを同定するために、組織特異的な寄生虫の集団を選択するために使用することができます。さらに、このアッセイは、推定反隔離薬7の画面に使用することができます。
Protocol
一般的な推奨事項
人間の脳の微小血管内皮細胞（HBEC - 5i）の文化は、以前は次の6に記載されている、8。P.熱帯熱マラリア原虫は、9と同様に培養した。 HBEC - 5iおよびP.両方熱帯熱マラリア原虫の培養は常に無菌状態に維持する必要があります。すべての試薬は37℃であらかじめ温めたされるべき我々は定期的にPCRによるマイコプラズマ汚染10（Minevera Biolabs社、製造元の指示に従います）をチェックすることをお勧めします。プロトコールを図1に要約される。
1。内皮細胞のルーチン培養
- 必要な試薬を準備します。
| 準備する培地 | 試薬 | 数量 |
| "不完全なDMEM" | DMEM - F12ハム | 500ミリリットル |
| ＆ニッポン放送p; | L -グルタミン200mmの | 5ミリリットル |
| ペニシリン/ストレプトマイシン100X | 5ミリリットル | |
| NaOHを1M | 1.3ミリリットル（7.4にpHを調整） | |
| "完全DMEM" | "不完全なDMEM" | 450ミリリットル |
| 胎児ウシ血清熱不活化 | 50ミリリットル | |
| 内皮細胞成長サプリメント | 5ミリリットル |
- 文化、5％CO 2で37℃インキュベーターで10ミリリットルDMEM完全培地で通気孔25センチメートル2フラスコでHBEC - 5I。
- 継代数の細胞がコンフルエントになる。吸引して、古い培地を除去し、二回DMEM不完全培地または組織培養グレードのPBSを（のCa 2 +およびMg 2 +フリー）予め温めておいた37℃使用して洗う
- 予め温めておいた試しに1mlの追加フラスコの全体をカバーし、37〜2分間インキュベートするpsin - EDTA（0.025％トリプシン、0.5 EDTA）、スワール℃に
- 細胞の少なくとも90％が分離されていることを倒立顕微鏡下で確認してください。必要に応じて、軽く接着細胞を取り除くために、フラスコの底をノック。 15ミリリットルコニカルチューブにトリプシンおよび転送細胞をブロックするDMEM完全培地10mlのを追加。室温（RT）で300 gで4分間遠心。
- 上清を捨て、DMEM完全培地10mlのでペレットを再懸濁します。徹底的に細胞を再懸濁するために上下ソリューションをピペット。
- 新しい培養フラスコに細胞懸濁液の1または2 mlを加え、文化を維持するために新鮮な培地の8ミリリットルを追加します。倒立顕微鏡下で毎日文化の成長を評価し、それが黄色に変わる前に、2,3日ごとに1培地を変更してください。
2。選択のための内皮細胞の準備
- 前のSelectIOの日の2日前まで nは、一つ（またはそれ以上）60ミリメートルペトリ皿に滅菌PBSで希釈したフィブロネクチン（濃度2μg/ cm 2）を加える。 37℃で5〜20分間の一品をインキュベート° Cは、その後の月のために4℃で保存し、一度、再使用可能なフィブロネクチンソリューションを、削除してください。
- 継代数の細胞は、セクション1.3で説明。 1.5〜。と仮定すると100パーセントコンフルエント細胞が分離し、10ミリリットルDMEM完全培地（1.6節。、コンフルエントが低い場合に培地の同等のボリュームで再懸濁し、コンフルエンシーが80％だった場合、例えば 8ミリリットルで再懸濁）に再懸濁し、懸濁の1.5ミリリットルに追加フィブロネクチンコートしたペトリ皿とDMEM完全培地の別の1.5ミリリットルの細胞。
- インキュベーターでシードペトリ皿を置きます。注：理想的には、細胞集密度は二日後に選択の時点で約90％になります。
- 省略可能 。 HBEC - 5iはアクティブにするには、前の選択に50μg/ml24時間の最終濃度でTNF（腫瘍壊死因子）サイトカインを加える。
- 必要な試薬を準備します（ここで下の表を参照）。白血球除去フィルター（一般的なマラリア原虫の培養のための出版物11"マラリア研究の方法"を参照）を通過させることによって全血（グループO +）を分離することによって、ヒト赤血球（RBC）を準備します。 5分間400gで遠心分離と10mlのRPMI不完全でそれらを再懸濁することにより回RBCを洗ってください。 4で洗浄赤血球を保つ° Cの不完全培地で50％のヘマトクリット値で。
| 準備する培地 | 試薬 | 数量 |
| "不完全なRPMI" | RPMI 1640（炭酸水素） | 500ミリリットル |
| HEPES 1M | 12.5ミリリットル | |
| グルコース20パーセント | 5ミリリットル | |
| L -グルタミン200mmの | 5ミリリットル | |
| ゲンタマイシン50mg/ml | 250μlの | |
| NaOHを1M | 0.7ミリリットル（7.2にpHを調整） | |
| "RPMIを完了" | "不完全なRPMI" | 450ミリリットル |
| ヒト（非免疫）プール血清 | 50ミリリットル |
- 文化P. 37 2％のヘマトクリット値とインキュベートでRPMI完全培地℃、3％CO 2、1％O 2、および96％N 2。と熱帯熱マラリア感染赤血球寄生虫（図2）の開発の段階を評価するためのギムザ塗抹標本11は毎日行います。
- 定期的に（およそ週一回）ソルビトール処理12で文化を同期させる。前日に選択アッセイ、5％の寄生虫以上のリングステージの培養のための目的（理想的に少なくとも10％）。
4。 P.の選択内皮細胞へのcytoadhesionのための熱帯熱マラリア原虫
- HBEC - 5iは文化が（理想的には90％）50から100パーセントでコンフルエントになるはずながら、アッセイの日には、寄生虫の文化は、色素栄養型の段階（ 図2）（理想的に10％の寄生虫）になっているはず。寄生虫文化の30μlの血中血球容積はHBEC - 5iはペトリ皿ごとに必要とされる。
- 寄生虫の文化の1.5ミリリットル（5分間500g）を遠心分離によって二回寄生虫を洗ってください。上清を捨て、焼きたての、暖め、DMEM不完全培地10mlので懸濁します。洗浄をもう一度繰り返す。 1％BSAを持つ不完全なDMEM中1.5ミリリットルと30μlの血中血球容積を再懸濁します。
- 二回培地を吸引し、不完全なDMEMの3ミリリットルを追加するHBEC - 5iはコーティングされたペトリ皿を洗ってください。
- 37 HBEC - 5iは皿とインキュベート寄生虫の解決° 75分のためのCを追加。インキュベーション中に（30および60分後）二回寄生虫を再懸濁します優しく四方の料理だけでなく、時計回りと反時計回りに揺動して。
- インキュベーション後、暖かいDMEM不完全培地、および穏やかなロッキングの3mlを追加するには、プラスチック製パスツールピペットを用いて、培地を吸引し皿を5回洗浄する。多くの皿が使用されている場合は、そのような37℃の水で満たされた大きなフラスコ℃と、暖かい表面にそれらを保つ
- 倒立顕微鏡下で料理を確認してください。多くの非感染赤血球がまだ表示されている場合、上記のようなより多くの洗浄を行います。汚染の危険を避けるために、非常に慎重にペトリ皿を扱う。
- 皿から培地を除去し、新鮮なuRBCの40μlの血中血球容積で暖かいRPMI完全培地の3ミリリットルを追加します。
- それは、3分間、気密インキュベーションチャンバー内にガスを料理を置き、37℃で一晩インキュベーターにチャンバーを配置。
- 翌日、セクション4.4で説明したと同様の方法で、RPMI不完全培地で洗浄することによって寄生虫を収穫。しかし、より積極的に。ケーpはすべての培地は、15ミリリットルコニカルチューブに（再懸濁されたRBCを含む）を使用。すべてRBCが皿から削除されていることを倒立顕微鏡下で確認してください。
- ペレット寄生虫は、5ミリリットルRPMI完全培地に再懸濁し、上清を、破棄し、通常の培養用フラスコ中で混合物を配置。
5。代表的な結果
選択されていない寄生虫はHBEC - 5I（図3A）に結合する低レベルを示しています。このように、選択の第1ラウンド後に、非常に少数の寄生虫を収穫され、それが選択の第二ラウンドのための十分な寄生虫に到達するための培養の月間ほどかかる場合があります。選択の各ラウンドの後、より多くの寄生虫は、内皮細胞に結合し、選択はより短い時間間隔で繰り返すことができます。選択の4-5ラウンド後に、高結合寄生虫の個体数が得られる（図3）。
私たちの手で、HBEC - 5IまたはTNF活性HBEC - 5i]のHB3 - HBECの結合は、SIMであったILARレベル（データは示さず）。
ここで記述されたプロトコルは、4 P.でテストされています熱帯熱マラリア原虫株 ：HB3、IT/FCR3、3D7とDD2（表1）。唯一の後者は、さらに選択の5ラウンドの後、HBEC - 5Iにバインドできない証明した。
HB3の寄生虫はまた、ヒト皮膚と肺微小血管内皮細胞（HDMECとHPMEC）への細胞接着のために選択した。ここに記載された方法を使用して、選択の4ラウンド、後に、高結合人口はHDMECとHPMEC（図4）の両方が得られた。
図1。選考プロセスの概要。
P.の図2。発展段階熱帯熱マラリア原虫は赤血球に感染する 。ギムザ塗抹標本では1000X倍率で顕微鏡下で可視化した。
図3。HBEC - 5i]の結合寄生虫の典型的な例 。 （A）青の層は、ギムザでグルタルアルデヒドとステンドグラスでHBEC - 5iは固定です1000X倍率で顕微鏡下で可視化した。 uRBCとバインドされていないiRBCが洗い流された後、撮影された。左側のパネルでは、単一のPを示しています。 HBEC - 5Iにバインドされている熱帯熱マラリア原虫 HB3（未選択）寄生虫。右側のパネルではHB3 - HBEC寄生虫は5ラウンドのために選択されていた。 （B）データは2つの独立した実験、重複で実行される各の平均を表しています。内皮細胞当たりの結合寄生虫の数をカウントした。
表1。成功 HB3もTNF活性化HBに選択されていることをHBEC - 5I（注） への結合のために選択された熱帯熱マラリア原虫株の概要EC - 5iは。選択の5ラウンドの後、DD2株が選択されていない- DD2に比べHBEC - 5Iへの結合の増加を示さなかった。
図4 Pの結合選択の4ラウンドの前と後の熱帯熱マラリア HB3皮膚に寄生虫（HDMEC）と肺（HPMEC）内皮細胞、。HDMECとHPMECのための培養液がわずかに異なりますが（供給者の指示を参照）、選択のために使用されるプロトコルがあるとして同一であったHBEC - 5iは。 400Xの倍率で撮影した画像。
| 試薬の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
| DMEM - F12ハム | シグマ | D6421 | DMEM完全培地用 |
| L -グルタミン200mmの | GIBCO | 25030 | DMEMおよびRPMI完全培地用 |
| ペニシリン/ストレプトマイシン100X（10000単位/ mlおよび10mg/ml） | ScienCell | 0503 | DMEM完全培地用 |
| 胎児ウシ血清熱不活化 | ScienCell | 0025 | DMEM完全培地用 |
| トリプシン- EDTA（0.025％トリプシン、0.5 EDTA） | ScienCell | 0103 | |
| 内皮細胞成長サプリメント | ScienCell | 1052 | DMEM完全培地用 |
| 組織培養は、60 mm X 15ミリメートルのペトリ皿を扱わ | BD | 353002 | |
| ヒトフィブロネクチン | ミリポア | FC010 | 濃度2μg/ cm 2で使用 |
| TNF | R＆Dシステム | 210 - TA | オプションは、50μg/ mlで使用 |
| RPMI 1640 | ロンザ | BE12 - 167F | RPMI完全培地用 |
| ゲンタマイシン50mg/ml | ロンザ | 17 - 518Z | RPMI完全培地用 |
| HEPES 1M | ロンザ | BE17 - 737E | RPMI完全培地用 |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | 一次細胞株 |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | 一次細胞株 |
| HBEC - 5I | フランシスコCandal（fcandal@cdc.gov）から入手 |
表2。マテリアル
Discussion
脳マラリアの特徴は、P.の隔離です。脳内で熱帯熱マラリア iRBC微小血管系2、3。しかしながら、P.の in vitro 培養における HBEC - 5iは、人間の脳微小血管内皮細胞のモデルにのみ不十分cytoadhere 熱帯熱マラリア 。ここでは、表現型より"のような生体内 "、HBEC - 5Iにバインドするための人口を豊かにする簡単なアッセイを開発した。 P. 4のうち三熱帯熱マラリア原虫株は正常にこのメソッドを使用して選択した。さらに、HB3もこのプロトコルは、様々な寄生虫や内皮細胞のタイプに使用できることを示す、HDMECとHPMECに選ばれました。
別の仮説は、DD2歪みと結合性の欠如を説明することがあります。この寄生虫のラインがknoblessであるという事実が、最も可能性が高い、これは深く細胞接着13、14を妨げる。
我々は選択のプロと一緒に培養する選択されていない寄生虫をお勧めします比較のために制御を提供するcess。これは、寄生虫リガンドの候補を発見するのを期待して、結合および非結合寄生虫のトランスクリプトームを比較し、例えば、できるようになります。
TNFは脳マラリアの患者では高いレベルにあるサイトカインであるとHBEC - 5I（Claessens ら 、準備中、8、15、16）の多くの表面タンパク質の発現を誘導する表示されています。このケースでは、バインドされたiRBCの量は、活性化HBEC - 5Iに比べて通常のHBEC - 5Iで同様であった。
この"隔離モデルは"またiRBCと内皮細胞間の分子相互作用だけでなく、推定上の抗細胞接着の薬の効果を研究するために使用することができます。このケースでは、我々はより小さいような"8ウェルチャンバースライド"（BD 354628）のような井戸、または"CultureWell"（シグマC7735 - 20EA）のHBEC - 5iはメッキをお勧めします。
Disclosures
我々は、開示することは何もない。
Acknowledgments
我々はHBEC - 5iは細胞のためにサンフランシスコCandal、CDC技術移転オフィス、ジョージア州アトランタに感謝。この作品は、ウェルカムトラスト（ACおよびJARへの基本的な生物医学科学のシニアフェローシップ、助成金番号084226から4年間の博士課程の学生の身分）によって賄われていた。
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