Summary
Une
Abstract
La plupart des décès dus au paludisme humain sont causées par des parasites au stade sanguin de Plasmodium falciparum. Le paludisme cérébral, la complication la plus mortelle de la maladie, se caractérise par une accumulation de Plasmodium falciparum globules rouges infectés (CISR) au stade trophozoïte pigmentée dans la microvascularisation du cerveau 2-4. Cette obstruction microvasculaire (séquestration) conduit à l'acidose, l'hypoxie et nuisibles cytokines inflammatoires (examiné en 5). Séquestration se trouve également dans la plupart des tissus microvasculaires du corps humain 2, 3. Le mécanisme par lequel CISR fixent sur les parois des vaisseaux sanguins est encore mal comprise.
Le immortalisé microvasculaires du cerveau humain lignée cellulaire endothéliale (HBEC-5i) a été utilisé comme un modèle in vitro de la barrière sang-cerveau 6. Toutefois, le Plasmodium falciparum CISR attachent seulement mal aux HBEC-5i in vitro, contrairement à la sequestrat densesions qui se produit dans les cas de paludisme cérébral. Nous avons donc développé un test pour sélectionner le panoramique (enrichissement) de divers P. falciparum pour l'adhésion à HBEC-5i afin d'obtenir des populations de haute liant les parasites, les plus représentatifs de ce qui se passe in vivo.
Un échantillon d'une culture de parasites (mélange d'CISR et non infectés RBC) au stade trophozoïte pigmentée est lavées et incubées sur une couche de HBEC-5i cultivés sur une boîte de Pétri. Après incubation, le plat est délicatement lavés et exempts de uRBC CISR non consolidés. Frais uRBC sont ajoutés à la CISR quelques attaché à HBEC-5i et incubées pendant la nuit. Comme parasites au stade schizonte éclater, les mérozoïtes envahir à nouveau RBC et ces parasites stade anneau sont récoltés le jour suivant. Les parasites sont cultivées jusqu'à suffisamment de matériau est obtenu (généralement de 2 à 4 semaines) et un nouveau cycle de sélection peut être effectuée. Selon le P. falciparum souche, 4 à 7 tours de sélection sont nécessaires afin d'obtenir une populationoù la plupart des parasites se lient à HBEC-5i. Le phénotype de liaison est progressivement perdu après quelques semaines, indiquant un interrupteur dans la surface de la variante du gène d'antigène d'expression, donc la sélection régulière sur HBEC-5i est nécessaire pour maintenir le phénotype.
En résumé, nous avons développé un test de sélection rendu P. falciparum parasites plus «adhésif cérébrale du paludisme" phénotype. Nous avons été en mesure de sélectionner 3 des 4 P. falciparum sur HBEC-5i. Ce test a également été utilisée avec succès pour sélectionner des parasites pour la liaison à l'homme cutanée et pulmonaire, les cellules endothéliales. Surtout, cette méthode peut être utilisée pour sélectionner des populations de parasites spécifiques de tissus en vue d'identifier des ligands parasitaires candidat pour la liaison à l'endothélium cérébral. En outre, ce test peut être utilisé pour dépister putative anti-séquestration de drogues 7.
Protocol
Les recommandations générales
Microvasculaires humaines du cerveau des cellules endothéliales (HBEC-5i) la culture a été précédemment décrit en 6, 8. P. falciparum ont été cultivées comme dans 9. Les deux HBEC-5i et P. falciparum cultures parasitaires doivent être conservés dans des conditions stériles en tout temps. Tous les réactifs doivent être pré-chauffé à 37 ° C. Nous vous recommandons de consulter régulièrement pour contamination par des mycoplasmes par PCR 10 (Minevera Biolabs, les instructions du fabricant de). Le protocole est résumé dans la figure 1.
1. Endothéliales de la culture cellulaire de routine
- Préparer les réactifs nécessaires.
| Moyen de se préparer | Réactifs | Quantité |
| «Incomplète DMEM" | DMEM-F12 de Ham | 500ml |
| | L-glutamine 200 mM | 5ml |
| Pénicilline / streptomycine 100X | 5 ml | |
| NaOH 1M | 1,3 ml (ajuster le pH à 7,4) | |
| "DMEM complet" | «Incomplète DMEM" | 450ml |
| Fœtale sérum bovin inactivé à la chaleur | 50ml | |
| Endothéliale supplément de croissance cellulaire | 5 ml |
- Culture HBEC-5i dans un ventilé 25cm 2 flacon avec 10ml milieu DMEM complet dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2.
- Passage des cellules quand elles deviennent confluentes. Enlevez l'ancien milieu par aspiration et laver deux fois avec du milieu DMEM incomplet ou de culture de tissus de qualité PBS (Ca 2 + et Mg 2 + libre) de pré-chauffé à 37 ° C.
- Ajouter 1ml de pré-chauffé EssayezPSIN-EDTA (0,025% de trypsine, 0.5mm EDTA), tourbillon de couvrir la totalité du flacon et incuber pendant ~ 2 min à 37 ° C.
- Vérifiez sous microscope inversé qu'au moins 90% des cellules ont été détachées. Si nécessaire, doucement frapper le fond du flacon pour déloger les cellules adhérentes. Ajouter 10 ml de milieu DMEM complet de bloquer les cellules de la trypsine et transférer dans un tube 15ml conique. Centrifuger pendant 4 min à 300 g à température ambiante (RT).
- Jeter le surnageant et remettre le culot avec 10 ml de milieu DMEM complet. Pipeter la solution de haut en bas pour bien remettre les cellules.
- Ajouter 1 ou 2 ml de la suspension cellulaire dans un flacon de culture et d'ajouter de nouveaux 8ml de milieu frais pour maintenir la culture. Évaluer la croissance de la culture tous les jours sous un microscope inversé et changement de milieu tous les 2 ou 3 jours avant qu'il devienne jaune.
2. Préparation des cellules endothéliales pour une sélection
- Deux jours avant le jour de la sélectio n, ajoutez la fibronectine dilué dans du PBS stérile (2 pg / cm 2) dans un (ou plusieurs) de 60 mm boîte de Petri. Incuber le plat pendant 5 à 20 min à 37 ° C, puis retirez la solution de fibronectine, qui peuvent être conservés à 4 ° C pendant un mois et réutilisés une fois.
- Passage des cellules comme décrit dans les sections 1.3. à 1,5. En supposant que 100% des cellules confluentes ont été détachées et remises en suspension dans 10ml milieu DMEM complet (section 1.6., Resuspendre avec un volume équivalent de milieu si la confluence est plus faible, par exemple resuspendre avec 8ml si la confluence a été de 80%), ajouter 1,5 ml de la suspension cellules à la boîte de Pétri fibronectine revêtement et un autre 1,5 ml de milieu DMEM complet.
- Placer le plat de Pétri ensemencés dans l'incubateur. Note: Idéalement, la confluence se situera autour de 90% au moment de la sélection de deux jours plus tard.
- Facultatif. Pour activer HBEC-5i, ajoutez le TNF (facteur de nécrose tumorale) des cytokines à une concentration finale de 50μg/ml 24 heures avant la sélection.
- Préparer les réactifs nécessaires (voir tableau ci-dessous). Préparer des globules rouges (RBC) en séparant le sang entier (groupe O +) par passage à travers un filtre déleucocytation (voir «Méthodes de recherche sur le paludisme" publication 11 pour la malaria parasites en culture générale). Laver deux fois par RBC par centrifugation à 400 g pendant 5 min et les remettre en suspension avec 10 ml de RPMI incomplète. Gardez lavés RBC à 4 ° C dans un milieu incomplet à l'hématocrite de 50%.
| Moyen de se préparer | Réactifs | Quantité |
| «Incomplète RPMI" | RPMI 1640 (avec du bicarbonate) | 500ml |
| Hepes 1M | 12,5 ml | |
| Glucose 20% | 5ml | |
| L-glutamine 200 mM | 5ml | |
| Gentamycine 50mg/ml | 250μl | |
| NaOH 1M | 0,7 ml (ajuster le pH à 7,2) | |
| «RPMI complet" | «Incomplète RPMI" | 450ml |
| Pooled humaine (non-immunes) de sérum | 50ml |
- Culture P. falciparum infectés RBC avec un milieu RPMI complet à l'hématocrite de 2% et incuber à 37 ° C avec 3% de CO 2, 1% O 2, et 96% de N 2. Faire frottis au Giemsa 11 quotidiens afin d'évaluer le stade de développement des parasites (figure 2).
- Régulièrement (environ une fois par semaine) de synchroniser la culture par le traitement de sorbitol 12. Le jour avant le test de sélection, afin d'une culture au stade annulaire parasitémie 5% ou plus (idéalement au moins une0%).
4. Sélection de P. falciparum cytoadhesion aux cellules endothéliales
- Le jour du test, la culture de parasites doivent être au stade trophozoïte pigmentée (figure 2) (idéalement parasitémie de 10%) tandis que HBEC-5i la culture doit être de 50 à 100% de confluence (idéalement 90%). 30μl hématocrite de la culture de parasites est nécessaire par HBEC-5i boîte de Pétri.
- Lavez les parasites à deux reprises par centrifugation (500 g pendant 5 min) 1.5ml de la culture du parasite. Rejeter le surnageant et resuspendre avec 10ml de fraîchement préparé, réchauffé, du milieu DMEM incomplète. Répétez la laver une seconde fois. Reprendre le volume cellulaire 30μl emballé avec 1.5ml d'incomplet avec 1% de BSA DMEM.
- Laver la vaisselle HBEC-5i revêtement de Petri à deux reprises aspirant moyen et ajouter 3 ml de DMEM incomplète.
- Ajouter la solution de parasites à l'antenne HBEC-5i et incuber à 37 ° C pendant 75min. Resuspendre les parasites deux fois (après 30 et 60 min) pendant l'incubationen secouant délicatement le plat dans les quatre directions, ainsi que dans le sens horaire et anti-horaire.
- Après incubation, laver la vaisselle 5 fois en aspirant moyen, en utilisant une pipette Pasteur en plastique à ajouter 3 ml de milieu DMEM chaudes incomplètes, et doux balancement. Si de nombreux plats sont utilisés, les garder sur une surface chaude, comme un grand flacon rempli d'eau à 37 ° C.
- Vérifiez le plat sous un microscope inversé. Si de nombreux infectés RBC sont encore visibles, faire plus de lave comme décrit ci-dessus. Manipuler la boîte de Pétri très soigneusement pour éviter tout risque de contamination.
- Retirer moyennes du plat et ajouter 3ml de milieu RPMI chaud complet avec le volume des cellules 40μl emballée d'uRBC frais.
- Placer le plat dans une chambre hermétique incubation, de gaz pendant 3 min et le lieu de la chambre dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit.
- Le lendemain, la récolte des parasites par un lavage avec du milieu RPMI incomplète, d'une manière similaire à celle décrite à la section 4.4. mais plus vigoureusement. Keep tous les moyens utilisés (contenant resuspendues RBC) dans un tube 15ml conique. Vérifiez sous microscope inversé que tous les RBC ont été retirés de l'antenne.
- Pellet, les parasites, jeter le surnageant, remettre en suspension dans un milieu RPMI complet et 5ml placer le mélange dans un flacon de culture normaux.
5. Les résultats représentatifs
Les parasites non sélectionnés présentent un faible niveau de se lier à HBEC-5i (figure 3A). Ainsi, après le premier tour de sélection, des parasites très peu seront récoltés et cela peut prendre jusqu'à un mois de culture pour atteindre une parasitémie suffisante pour le second tour de sélection. Après chaque tour de sélection, les parasites de plus en plus de se lier aux cellules endothéliales et les sélections peut être répétée à intervalles de temps plus courte. Après 4-5 tours de sélection, les populations de parasites à haute liaison sont obtenus (figure 3).
Dans nos mains, la liaison du HB3-HBEC d'HBEC-5i ou TNF activée HBEC-5i était de simniveau de ILAR (données non présentées).
Le protocole décrit ici a été testé avec 4 p. falciparum: HB3, IT/FCR3, 3D7 et DD2 (tableau 1). Seul ce dernier s'est avéré incapable de se lier à HBEC-5i, même après 5 rondes de sélection.
HB3 les parasites ont également été sélectionnés pour cytoadhérence à l'homme cutanée et pulmonaire cellules endothéliales microvasculaires (HDMEC et HPMEC). Après quatre cycles de sélection, en utilisant la méthode décrite ici, une population à haut contraignant a été obtenu sur les deux HDMEC et HPMEC (figure 4).
Figure 1. Aperçu du processus de sélection.
Figure 2 phases de développement. De P. falciparum globules rouges infectés. Frottis au Giemsa visualisés au microscope à un grossissement de 1000X.
Figure 3. Exemple typique de parasites liant à HBEC-5i. (A) La couche bleue est HBEC-5i fixé avec du glutaraldéhyde et colorées au Giemsa, visualisés au microscope à un grossissement de 1000X. Les photos ont été prises après la CISR uRBC et non liées ont été emportés. Le panneau de gauche montre un seul p. falciparum HB3 (non sélectionné) du parasite lié à HBEC-5i. Dans le panneau de droite, les parasites HB3-HBEC avait été sélectionné pour 5 tours. (B) Les données représentent la moyenne de deux expériences indépendantes, chacune réalisée en double. Le nombre de parasites liés par des cellules endothéliales a été compté.
Tableau 1. Résumé des souches de Plasmodium falciparum qui ont été sélectionnées avec succès pour la liaison à HBEC-5i. Notez que HB3 a également été sélectionné sur le TNF-activé HBCE-5i. Après 5 rondes de sélection, la souche DD2 n'a montré aucune augmentation dans la liaison au HBEC-5i comparé à désélectionné-DD2.
Figure 4. Reliure de P. falciparum HB3 parasites dermiques (HDMEC) et pulmonaires (HPMEC) des cellules endothéliales, avant et après 4 tours de sélection. Bien que le milieu de culture pour HDMEC et HPMEC diffère légèrement (voir les instructions du fournisseur), le protocole utilisé pour la sélection a été identique à celle des HBEC-5i. Photos prises à un grossissement de 400x.
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| DMEM-F12 de Ham | Sigma | D6421 | Pour milieu DMEM complet |
| L-glutamine 200 mM | GIBCO | 25030 | Pour un milieu DMEM et RPMI complet |
| Pénicilline / streptomycine 100X (10000 unités / ml et 10mg/ml) | ScienCell | 0503 | Pour milieu DMEM complet |
| Fœtale sérum bovin inactivé à la chaleur | ScienCell | 0025 | Pour milieu DMEM complet |
| Trypsine-EDTA (0,025% de trypsine, 0.5mm EDTA) | ScienCell | 0103 | |
| Endothéliale supplément de croissance cellulaire | ScienCell | 1052 | Pour milieu DMEM complet |
| La culture de tissus traités 60 mm x 15 mm boîte de Pétri | BD | 353002 | |
| Fibronectine humaine | Millipore | FC010 | Utilisez à 2 pg / cm 2 |
| TNF | R &D Systems | 210-TA | en option, utilisation à 50 pg / ml |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | Pour un milieu RPMI complet |
| Gentamycine 50mg/ml | Lonza | 17-518Z | Pour un milieu RPMI complet |
| Hepes 1M | Lonza | BE17-737E | Pour un milieu RPMI complet |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | Lignée cellulaire primaire |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | Lignée cellulaire primaire |
| HBEC-5i | Obtenu à partir de Francisco Candal (fcandal@cdc.gov) |
Tableau 2. Matériaux
Discussion
La caractéristique de paludisme cérébral est la séquestration de P. falciparum CISR dans le cerveau microvascularisation 2, 3. Toutefois, dans les cultures in vitro de P. falciparum seulement mal aux cytoadhere HBEC-5i, un modèle pour l'endothélium cérébral microvasculaires humaines. Ici, nous avons développé un test simple pour enrichir une population pour la liaison à HBEC-5i, un plus "in vivo comme« phénotype. Trois des 4 P. falciparum ont été sélectionnées avec succès en utilisant cette méthode. Par ailleurs, HB3 a également été sélectionné sur HDMEC et HPMEC, indiquant que ce protocole peut être utilisé pour différents types et des parasites de cellules endothéliales.
Différentes hypothèses peuvent expliquer l'absence de liaison avec la souche DD2. Le plus probable étant le fait que cette ligne parasite est knobless, ce qui entrave profondément la cytoadhérence 13, 14.
Nous recommandons les parasites en culture non sélectionnés aux côtés des pro sélectionCESS pour fournir un contrôle pour comparaison. Cela permettra, par exemple, en comparant le transcriptome de parasites contraignants et non contraignants, avec l'espoir de découvrir des candidats ligand parasitaire.
Le TNF est une cytokine trouve à un niveau élevé de patients atteints de paludisme cérébral et a été montrer à induire l'expression des protéines de surface de nombreux HBEC-5i (Claessens et al, en préparation et 8, 15, 16). Dans ce cas, le montant des CISR lié a été similaire dans la normale HBEC-5i comparé à activé HBEC-5i.
Ce «modèle séquestration» peut également être utilisé pour étudier l'interaction moléculaire entre la CISR et les cellules endothéliales, ainsi que l'effet de la putative anti-cytoadhérence médicaments. Dans ce cas, nous recommandons plaquage HBEC-5i dans les petits puits, comme «chambre de diapositives 8-même" (BD 354 628) ou «CultureWell" (Sigma C7735-20EA).
Disclosures
Nous n'avons rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Francisco Candal, CDC Technology Transfer Office, Atlanta en Géorgie pour la HBEC-5i cellules. Ce travail a été financé par le Wellcome Trust (4 ans bourse d'études de doctorat à la CA et Senior Fellowship en sciences biomédicales de base aux JAR, numéro de la subvention 084 226).
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