Summary
Abstract
대부분의 인간의 말라리아 사망자는 혈액 단계 Plasmodium falciparum의 기생충에 의해 발생합니다. 대뇌 말라리아, 질병의 가장 생명을 위협하는 합병증은 뇌 2-4 microvasculature에 색소 trophozoite 단계에서 Plasmodium falciparum 감염 적혈구 (iRBC)의 축적이 특징입니다. 이 microvessel 방해 (격리)는 산증, hypoxia 해로운 염증 크린 시토킨 (5 검토)로 연결됩니다. 격리는 또한 인체 2, 3 대부분의 microvascular 조직에서 발견된다. iRBC은 혈관 벽에 부착되는 메커니즘은 아직 제대로 이해됩니다.
불후의 인간 두뇌 microvascular 내피 세포 라인 (HBEC - 5i)은 혈액 뇌 장벽 6 체외 모델로 사용되고 있습니다. 그러나, Plasmodium falciparum iRBC은 빽빽한 sequestrat 달리 체외에서 HBEC - 5i에만 제대로 첨부대뇌 말라리아 케이스에서 발생 이온. 따라서 (풍부) 다양한 P.을 선택 패닝 분석을 개발 HBEC - 5i에 부착을위한 falciparum의 변종 높은 바인딩 기생충, 생체내에서 발생하는 것을 더 대리인의 인구를 얻기 위해서 인치
색소 trophozoite 단계에서 기생충 문화의 샘플 (iRBC과 감염되지 않은 RBC의 혼합물)는 페트리 접시에서 성장 HBEC - 5i의 레이어에 세탁하고 incubated입니다. 부화 후 요리가 부드럽게 uRBC와 언바운드 iRBC에서 무료로 세탁합니다. 신선한 uRBC는 HBEC - 5i와 incubated 하룻밤에 연결된 몇 iRBC에 추가됩니다. schizont 무대 기생충이 버스트로 reinvade RBC 이러한 링 단계 기생충은 다음날 수확 아르 merozoites. 충분한 자료 얻은 것입니다 (일반적으로 2-4주)과 선택의 새로운 원형을 수행할 수있을 때까지 기생충이 양식입니다. P.에 따라 falciparum 변형, 선택의 4-7 라운드는 인구를 위해 필요한대부분의 기생충은 HBEC - 5i에 바인딩 어디에. 바인딩 표현형은 점차적 따라서 HBEC - 5i에 대한 일반 선택이 표현형을 유지하기 위해 필요한, 변형 표면 항원 유전자 발현에 스위치를 나타내는 몇 주 후에 손실됩니다.
요약에서 우리는 선택 분석 렌더링에게 P.을 개발 falciparum은 기생충보다 "대뇌 말라리아 접착제"표현형합니다. 우리는 4 P. 3를 선택할 수 있었다 HBEC - 5i에 falciparum의 변종. 이 분석은 또한 성공적으로 인간의 피부와 폐의 내피 세포에 바인딩에 대한 기생충을 선택하는 데 사용되었습니다. 중요한 것은,이 방법은 뇌의 내피에 바인딩을위한 후보 기생충의 리간드를 확인하기 위해 조직을 특정 기생충의 인구를 선택하는 데 사용할 수 있습니다. 또한,이 분석은 putative 방지 격리 마약 7 화면으로 사용할 수 있습니다.
Protocol
일반적인 권고 사항
인간 두뇌의 microvascular 내피 세포 (HBEC - 5i) 문화는 이전에 다음 ID로 8, 6 설명되었습니다. P.가 falciparum의 기생충은 9로 교양되었습니다. HBEC - 5i와 P. 모두 falciparum 기생충 문화는 항상 무균 상태에서 보관해야합니다. 모든 시약은 37 ° C.에 미리 예열한다 우리는 정기적으로 PCR (Minevera Biolabs, 다음과 같은 제조 업체의 지침)에 의해 mycoplasma 오염 10 확인하는 것이 좋습니다. 프로토콜은 그림 1에 요약됩니다.
1. 내피 세포 일상 문화
- 필요한 시약을 준비합니다.
| 준비 중 | 시약 | 양 |
| "불완전한 DMEM" | DMEM - F12 햄 | 500ml |
| 및nbsp; | L - 글루타민 200mM | 5ml |
| 100X 페니실린은 / 스트렙토 마이신 | 5 ML | |
| NaOH 1M | 1.3 ML (7.4로 산도를 조절) | |
| "완료 DMEM" | "불완전한 DMEM" | 450ml |
| Foetal 소 혈청 열 inactivated | 50ml | |
| 내피 세포 형성제 | 5 ML |
- 문화 5 % CO 2와 37 ° C 배양기에서 10ml DMEM 완전한 매체와 통풍 25cm 2 플라스크에 HBEC - 5i.
- 통로 세포들이 합류된다. 흡입에 의해 기존의 미디어를 제거하고 두 번 DMEM 불완전 매체 또는 조직 문화 학년 PBS (CA 2 + 및 MG 2 + 무료) 37 미리 예열 ° C.를 사용하여 세척
- 사전 예열 시도의 1ml 추가플라스크의 전체를 커버하고 37 ~ 2 분 부화 psin - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.025 % 트립신, 0.5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)), 소용돌이 ° C.
- 세포의 최소 90 %가 분리되었다는 거꾸로 현미경으로 확인합니다. 필요한 경우, 부드럽게 점착 성의 세포를 이동시키다하는 술병의 바닥을 물릴. 15ml 원뿔 튜브에 트립신 및 전송 세포를 차단하는 DMEM 완료 매체의 10ml를 추가합니다. 실온 (RT)에서 300g에 4 분 원심 분리기.
- 뜨는을 취소하고 DMEM 전체 매체의 10ml로 펠렛을 resuspend. 철저하게 세포를 resuspend에 대한 해결책을 피펫 아래.
- 새로운 문화 플라스크에 세포 현탁액 1 또는 2 ML을 추가하고 문화를 유지하기 위해 새로운 매체의 8ml를 추가합니다. 거꾸로 현미경으로 매일 문화의 성장을 평가하고 노란색 변하기 전에 매 2 또는 삼일 매체를 변경합니다.
2. 선택에 대한 내피 세포를 준비
- 전에 selectio의 하루 이틀 N 하나 (혹은 이상) 60mm 페트리 접시에 무균 PBS (2 μg / cm 2)에 희석 fibronectin을 추가합니다. 37 5-20 분 요리를 품어 ° C, 그럼 한달 동안 4 ° C에서 저장하고 한번 다시 사용할 수있는 fibronectin 솔루션을 제거합니다.
- 통로 세포는 섹션 1.3에서 설명한. 1.5. 가정 백퍼센트 합류 세포 분리 및 10ml DMEM 전체 매체 (섹션 1.6., confluency이 낮은 경우 매체의 동등한 볼륨 resuspend, confluency는 80 % 였다면 예 8ml와 resuspend)에 resuspended 있었다 정지의 1.5ml 추가 fibronectin 코팅된 배양 접시와 DMEM 전체 매체의 다른 1.5ml로 세포.
- 인큐베이터에있는 씨앗을 페트리 접시를 놓습니다. 참고 : 이상적으로, confluency 이틀 후에 선택의 시간을 90 % 정도됩니다.
- 선택 사항입니다. HBEC - 5i 활성화하려면, 사전 선택에 50μg/ml 24 시간 최종 농도에서 TNF (Tumour의 괴사 팩터) 시토킨를 추가합니다.
- 필요한 시약을 (여기 아래 표 참조) 준비합니다. 백혈구 고갈 필터 (일반 말라리아 기생충의 culturing에 대한 출판 11 "말라리아 연구의 방법"참조)을 통해 통과하여 전체 혈액 (그룹 O +)를 분리하여 인간의 적혈구 (RBC)를 준비합니다. 5 분 400g에 centrifuging 10 ML RPMI 불완전한 그들을 resuspending하여 두 번 RBC 씻으십시오. 4 세탁 RBC 계속 ° C를 불완전 매체 50 %의 혈소판에서.
| 준비 중 | 시약 | 양 |
| "불완전한 RPMI" | RPMI 1640 (소 포함) | 500ml |
| Hepes 1M | 12.5ml | |
| 포도당 20% | 5ml | |
| L - 글루타민 200mM | 5ml | |
| Gentamycin 50mg/ml | 250μl | |
| NaOH 1M | 0.7 ML (7.2 산도를 조절) | |
| "RPMI 완료" | "불완전한 RPMI" | 450ml |
| 인간 (비 면역) 혈청 풀링 | 50ml |
- 문화 P. 37 2 %의 혈소판과 부화에 RPMI 완료 매체 ° C 3퍼센트 CO 2, 1 % O 2, 96% N 2.와 falciparum에 감염된 RBC 기생충 (그림 2)의 개발 단계를 평가하기 위해 Giemsa의 얼룩 11 매일합니다.
- 정기적으로 (약 일주일에 한 번) sorbitol 치료 12 문화를 동기화할 수 있습니다. 일 이전에 선택 분석, 5 % parasitaemia 이상에서 반지 무대 문화에 대한 목표 (이상 최소 10 %).
4. P.의 선택 내피 세포에 cytoadhesion위한 falciparum
- HBEC - 5i 문화 (이상 90%) 50~100%에서 confluency되어야하는 동안 분석의 날, 기생충 문화 색소 trophozoite 단계 (그림 2) (이상 10 % parasitaemia)에 있어야합니다. 기생충 문화의 30μl 포장 셀 볼륨 HBEC - 5i 페트리 접시마다 필요합니다.
- centrifuging (5 분 500g) 기생충 문화의 1.5ml로 두 번 기생충 씻으십시오. 뜨는 갓 만든, 예열, DMEM 불완전 매체 10ml로 resuspend 폐기하십시오. 세척에게 두 번째 시간을 반복합니다. 1 % BSA와 함께 불완전한 DMEM의 1.5ml와 30μl 모여 셀 볼륨을 Resuspend.
- 두 매체 aspirating 및 불완전 DMEM의 3ml를 추가 HBEC - 5i 코팅 페트리 접시를 씻으십시오.
- 37 HBEC - 5i 요리와 부화 기생충의 솔루션 ° 75min C를 추가합니다. 부화 기간 동안 (30 및 60 분 후) 두 번 기생충 Resuspend부드럽게 네 개의 방향뿐만 아니라, 시계 방향과 반 시계 방향으로 접시를 락을하여.
- 부화 후, 3 따뜻한 DMEM 불완전 매체의 ML, 부드러운 흔들어 추가하는 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체를 aspirating하여 접시에게 5 번 씻는다. 많은 요리가 사용되는 경우, 그러한 37 물이 담겨있는 대형 플라스크 ° C.로 따뜻한 표면에 그들을 계속
- 거꾸로 현미경 접시를 확인합니다. 많은 감염되지 않은 RBC 아직도 볼 수있다면, 위에서 설명한대로 더 세척 해. 오염의 위험을 피하기 위해 매우 조심스럽게 페트리 접시를 취급하고 있습니다.
- 접시에서 매체를 제거하고 신선한 uRBC의 40μl 포장 셀 볼륨 따뜻한 RPMI 전체 매체의 3ml를 추가합니다.
- 밀폐 챔버 잠복기에있는 접시, 3 분 가스를 놓고 37 ° C 야간에 인큐베이터에있는 챔버를 놓습니다.
- 그날 이후, 섹션 4.4에서 설명한대로 유사한 방식으로, RPMI 불완전 매체로 세탁하여 기생충을 수확. 하지만 더 적극적으로. 키P 모든 매체 15ml 원뿔 튜브 (resuspended RBC를 포함)의 사용. 모든 RBC는 접시에서 제거된 것을 거꾸로 현미경으로 확인합니다.
- 펠렛 기생충, 5ml RPMI 완료 매체와 장소 정상 culturing에 대한 플라스크에 혼합물에 resuspend 뜨는을 버리고.
5. 대표 결과
선택하지 않은 기생충 HBEC - 5i (그림 3A)에 바인딩의 낮은 수준을 보여줍니다. 따라서, 선택의 첫 라운드 이후 거의 기생충이 수확되고 그것은 선택의 두 번째 라운드에 대한 충분한 parasitaemia에 도달 culturing의 달 소요될 수 있습니다. 선택 각 라운드마다, 점점 더 많은 기생충은 내피 세포에 바인딩하고 선택은 짧은 시간 간격으로 반복 수 있습니다. 선택 4-5 라운드 후, 높은 바인딩 기생충의 인구는 (그림 3) 얻을 수 있습니다.
우리 손에, HBEC - 5i 또는 TNF 활성화 HBEC - 5i에 HB3 - HBEC의 바인딩은 시뮬레이션을했습니다ilar 수준 (데이터가 표시되지 않음).
프로토콜은 여기에서 설명한 4 P. 함께 테스트되었습니다 falciparum의 변종 : HB3, IT/FCR3, 3D7 및 Dd2 (표 1). 오직 후자도 선택 5 라운드 후 HBEC - 5i에 바인딩할 수 없습니다이었다.
HB3 기생충은 또한 인간의 피부와 폐 Microvascular 내피 세포 (HDMEC 및 HPMEC)에 cytoadherence이 선택되었습니다. 방법을 사용하여 선택 4 라운드가 여기에 설명된 후, 높은 바인딩 인구는 HDMEC 및 HPMEC (그림 4) 모두에 얻은 것입니다.
그림 1. 선정 과정의 개요.
P.의 그림 2. 개발 단계 falciparum은 적혈구를 감염. Giemsa의 얼룩은 1000X 확대 현미경 시각.
그림 3. HBEC - 5i에 바인딩 기생충의 전형. (A) 파란색 레이어는 Giemsa와 글루 타 알데히드와 스테인드와 HBEC - 5i 고정 1000X 확대 현미경 시각. uRBC 및 언바운드 iRBC가 씻겨 나서 사진을 촬영했다. 왼쪽 패널은 단일 P.을 보여줍니다 falciparum HB3 (선택되지 않은) 기생충은 HBEC - 5i에 바인딩. 오른쪽 패널에서 HB3 - HBEC 기생충은 5 라운드를 위해 선택했다. (B) 데이터는 두 개의 독립적인 실험, 중복으로 수행 각각의 평균을 나타냅니다. 내피 세포 당 행 기생충의 수를 계산했다.
표 1. 성공적으로 HB3 또한 TNF - 활성 HB에서 선택한 것을 HBEC - 5i. 참고로 바인딩 선정되었다 Plasmodium falciparum의 종자의 요약EC - 5i. 선택 5 회진 후, Dd2 긴장이 선택되지 않은 - Dd2에 비해 HBEC - 5i에 바인딩에 증가했다 없습니다.
그림 4. P.의 바인딩 HDMEC 및 HPMEC에 대한 문화 매체 약간 차이가 있지만 이전과 선택 4 라운드 후 피부 (HDMEC)와 폐 (HPMEC) 내피 세포에 falciparum HB3 기생충. (업체의 지침을 참조) 선택에 사용되는 프로토콜과 마찬가지로 동일했습니다 HBEC - 5i. 사진은 400X 배율에서 찍은.
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| DMEM - F12 햄 | 시그마 | D6421 | DMEM 전체 매체에 |
| L - 글루타민 200mM | GIBCO | 25,030 | DMEM과 RPMI 전체 매체에 |
| 100X 페니실린은 / 스트렙토 마이신 (10,000 대 / ML 및 10mg/ml) | ScienCell | 0503 | DMEM 전체 매체에 |
| Foetal 소 혈청 열 inactivated | ScienCell | 0025 | DMEM 전체 매체에 |
| 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.025 % 트립신, 0.5mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) | ScienCell | 0103 | |
| 내피 세포 형성제 | ScienCell | 1052 | DMEM 전체 매체에 |
| 조직 문화는 60mm를 치료 X 15mm 배양 접시 | BD | 353,002 | |
| 인간 Fibronectin | Millipore | FC010 | 2 μg / cm 2 사용 |
| TNF | R &D 시스템 | 210 - TA | 옵션, 50 μg / ML에서 사용 |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12 - 167F | RPMI 전체 매체에 |
| Gentamycin 50mg/ml | Lonza | 17 - 518Z | RPMI 전체 매체에 |
| Hepes 1M | Lonza | BE17 - 737E | RPMI 전체 매체에 |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | 기본 셀 라인 |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | 기본 셀 라인 |
| HBEC - 5i | 시스코 Candal (fcandal@cdc.gov)에서 획득 |
표 2. 재료
Discussion
대뇌 말라리아의 특징은 P.의 격리입니다 두뇌 microvasculature 2, 3 시간 falciparum iRBC. 그러나, P.의 체외 배양에 HBEC - 5i, 인간 두뇌 microvascular의 내피를위한 모델 falciparum은 제대로 cytoadhere. 여기 표현형보다 "처럼 - 생체내"HBEC - 5i에 바인딩을위한 인구를 풍성하게하는 직접적인 분석을 개발했습니다. 4 P. 중 3 falciparum의 변종이 성공적으로이 방법을 사용하여 선택되었습니다. 또한, HB3 또한이 프로토콜은 다양한 기생충 및 내피 세포 유형에 사용할 수 나타내는 HDMEC 및 HPMEC에 선정되었습니다.
다른 가설은 Dd2 변형과 바인딩의 부족을 설명할 수 있습니다. 이 기생충 라인 knobless이라는 사실되는 대부분, 이것은 깊이 cytoadherence 13, 14을 막아.
우리는 선택 프로와 함께 culturing 선택되지 않은 기생충을 권장비교를위한 컨트롤을 제공하기 위해 세금. 이것은 기생충 리간드 후보를 발견의 희망과 함께, 바인딩 및 구속력이 기생충의 transcriptome를 비교 예를 들어, 수 있습니다.
TNF는 대뇌 말라리아 환자의 높은 수준에서 찾을 시토킨이며 HBEC - 5i (Claessens 동부 표준시 준비에 알, 8, 15, 16)의 많은 표면 단백질의 표현을 유도하기 위해 공연을하고 있습니다. 이 경우, 행 iRBC의 양은 활성화 HBEC - 5i에 비해 일반 HBEC - 5i와 비슷한되었습니다.
이 "격리 모델은"또한 iRBC와 내피 세포 사이의 분자 상호 작용뿐만 아니라, putative 방지 cytoadherence 약물의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이 경우, 우리는 "8 자 챔버 슬라이드"(BD 354628) 또는 "CultureWell"(시그마 C7735 - 20EA)와 같은 작은 우물에서 HBEC - 5i 도금 권장합니다.
Disclosures
우리는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 HBEC - 5i 전지 시스코 Candal, CDC 기술 이전 사무소, 아틀란타 조지아 감사합니다. 이 작품은 Wellcome 트러스트 (AC 및 JAR에 기본 의생명 과학 수석 원정대에 사년 박사 학생이기, 부여 번호 084226)에 의해 재정 지원되었다.
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