Summary
Protocol
Общие рекомендации
Мозг человека микрососудистых эндотелиальных клеток (HBEC-5i) культура была ранее описана в 6, 8. P. тропической паразитов культивировали как и в 9. Оба HBEC-5i и П. паразита тропической культуры должны храниться в стерильных условиях в любое время. Все реагенты должны быть предварительно нагревают при 37 ° C. Мы рекомендуем регулярно проверять на микоплазму загрязнения 10 методом ПЦР (Minevera Биолабс, инструкции следующие производителя). Протокол приведены на рисунке 1.
1. Эндотелиальная клетка культуры рутинной
- Подготовка необходимых реагентов.
| Средний подготовить | Реагенты | Количество |
| "DMEM неполным" | DMEM-F12 Хэм | 500 мл |
|   | L-глютамин 200 мМ | 5 мл |
| Пенициллин / стрептомицин 100X | 5 мл | |
| NaOH 1M | 1,3 мл (корректировать рН до 7,4) | |
| "DMEM полной" | "DMEM неполным" | 450 мл |
| Плода бычьего сывороточного тепла инактивированной | 50 мл | |
| Эндотелиальная дополнения рост клеток | 5 мл |
- Культура HBEC-5i в вентилируемом 25 см 2 колбу с 10 мл DMEM полной среды в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2.
- Прохождение клетки, когда они становятся вырожденным. Удалите старый среды всасывания и мыть дважды используя DMEM неполным средним или культуры тканей класса PBS (Ca 2 + и Mg 2 + бесплатный) предварительно нагревают до 37 ° C.
- Добавить 1 мл подогретого Попробуйтеpsin-ЭДТА (0,025% трипсина, 0,5 мм ЭДТА), вихря, чтобы покрыть полностью из колбы и инкубировать в течение ~ 2 мин при 37 ° C.
- Проверьте под инвертированным микроскопом, что по крайней мере 90% клеток были отделены. В случае необходимости, осторожно постучать дне колбы, чтобы сместить прилипшие клетки. Добавить 10 мл DMEM полной среде, чтобы блокировать трипсина и передачи клеток в 15 мл коническую трубку. Центрифуга в течение 4 мин при 300 г при комнатной температуре (RT).
- Удалите супернатант и ресуспендируют осадок с 10 мл DMEM полной среде. Внесите решение вверх и вниз, тщательно ресуспендирования клеток.
- Добавьте 1 или 2 мл клеточной суспензии в новую культуру колбу и добавляют 8 мл свежей среды для поддержания культуры. Оценка роста культуры каждый день под инвертированным микроскопом и изменение среды каждые 2 или 3 дня до его желтеет.
2. Подготовка эндотелиальных клеток для выбора
- За два дня до дня selectio п, добавить фибронектина разводят в стерильном PBS (2 мкг / см 2) в одной (или более) 60 мм чашки Петри. Инкубируйте блюдо от 5 до 20 мин при 37 ° С, а затем удалить фибронектина решение, которое может храниться при температуре 4 ° С в течение месяца и повторно использовать один раз.
- Прохождение клетки, как это описано в разделах 1.3. до 1,5. Предполагая, 100% вырожденная клетки были отделены и ресуспендировали в 10 мл DMEM полной среде (раздел 1.6., Ресуспендируют с эквивалентного объема среды, если слияния ниже, например, ресуспендируют с 8 мл, если слияния было 80%), добавить 1,5 мл взвешенных клеткам фибронектина покрытием чашке Петри, а другая из 1,5 мл DMEM полной среде.
- Место блюдо посеяны Петри в инкубаторе. Примечание: В идеале, слияния составит около 90% на момент отбора через два дня.
- Необязательно. Для активации HBEC-5i, добавьте TNF (фактор некроза опухоли) цитокинов в конечной концентрации 50μg/ml за 24 часа до выбора.
- Подготовьте необходимые реагенты (см. таблицу здесь, под). Подготовка человека красных кровяных телец (эритроцитов) путем отделения цельной крови (группа O +) при прохождении через фильтр лейкоцитов истощения (см. «Методы исследований в области малярии" публикации 11 для общего культивирования малярийных паразитов). Вымойте РБК дважды центрифугированием при 400 г в течение 5 мин и ресуспендирования их с 10 мл RPMI неполным. Держите мыть РБК при 4 ° С при неполном среде при 50% гематокрита.
| Средний подготовить | Реагенты | Количество |
| "RPMI неполным" | RPMI 1640 (с бикарбонатом) | 500 мл |
| Hepes 1M | 12.5ml | |
| Глюкоза 20% | 5 мл | |
| L-глютамин 200 мМ | 5 мл | |
| Гентамицин 50мг/мл | 250 мкл | |
| NaOH 1M | 0,7 мл (корректировать рН до 7,2) | |
| "RPMI полной" | "RPMI неполным" | 450 мл |
| Объединенные человека (неиммунных) сыворотки | 50 мл |
- Культура P. тропической инфицированных РБК со RPMI полной среде на уровне 2% гематокрита и инкубировать при температуре 37 ° C с 3% CO 2, 1% O 2, и 96% N 2. Сделать Гимзе мазка 11 ежедневно для оценки стадии развития паразитов (рис. 2).
- Регулярно (примерно раз в неделю) синхронизировать культуры сорбитол лечение 12. День до выбора теста, стремиться к кольцу-сценической культуры на уровне 5% паразитемии или более (в идеале, по крайней мере 10%).
4. Выбор P. тропической для cytoadhesion в эндотелиальных клетках
- В день теста, культуры паразита должна быть не пигментированные этапе трофозоит (рис. 2) (в идеале 10% паразитемии), а HBEC-5i культура должна быть от 50 до 100% слияния (в идеале 90%). 30μl гематокрита культуры паразита необходимо в HBEC-5i чашке Петри.
- Вымойте паразитов в два раза путем центрифугирования (500 г в течение 5 мин) 1,5 мл культуры возбудителя. Удалите супернатант и ресуспендируйте с 10 мл свежеприготовленного, потеплела DMEM неполной среде. Повторите мыть второй раз. Ресуспендируют 30μl гематокрита с 1,5 мл из неполных DMEM с 1% BSA.
- Вымойте HBEC-5i покрытием чашке Петри в два раза аспирационных средних и добавление 3 мл неполного DMEM.
- Добавить решение паразитов HBEC-5i блюдо и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 75 мин. Ресуспендируют паразитов в два раза (после 30 и 60 мин) в течение инкубационногоосторожно покачайте его блюдо в четырех направлениях, а также по часовой стрелке и против часовой стрелки.
- После инкубации, мыть блюда в 5 раз по аспирационных среды, использованием пластиковой пипетки Пастера добавить 3 мл теплой DMEM неполных средних и нежный качания. Если многие блюда используются, держать их на теплую поверхность, например, большой колбе с водой при температуре 37 ° C.
- Проверьте блюдо под инвертированным микроскопом. Если многие неинфицированных РБК еще видны, делать больше моет, как описано выше. Ручка чашки Петри очень тщательно, чтобы избежать любого риска загрязнения.
- Удалить среды от блюдо и добавить 3 мл теплой RPMI полной среде с 40μl гематокрита свежих УрБК.
- Место блюдо в герметичной камере инкубации, газ в течение 3 мин и место камеры в термостат при температуре 37 ° С в течение ночи.
- На следующий день после, урожай паразитов промывкой RPMI неполной среды, таким же образом, как описано в разделе 4.4. но более энергично. Кир всех средних используется (содержащие ресуспендировали РБК) в 15 мл коническую трубку. Проверьте под инвертированным микроскопом, что все РБК были удалены из тарелки.
- Гранул паразитов, отбросить супернатант, ресуспендируют в 5 мл полной среды RPMI и место смеси в колбе для нормального культивирования.
5. Представитель Результаты
Невыбранная паразитов показать низкий уровень связывания с HBEC-5i (рис. 3А). Таким образом, после первого тура отбора, очень мало паразитов будет собрано, и это может занять до месяца культивирования достичь паразитемии достаточным для второго тура отбора. После каждого раунда отбора, все больше и больше паразитов связываются с эндотелиальные клетки и выбор может быть повторен в более короткие промежутки времени. После 4-5 раундов отбора, высоких обязательными популяций паразита получены (рис. 3).
В наших руках, связывание HB3-HBEC к HBEC-5i или TNF активированный HBEC-5i был симilar уровне (данные не представлены).
Протокол, описанный здесь, был испытан с 4 P. тропической штаммов: HB3, IT/FCR3, 3D7 и DD2 (табл. 1). Только последнее оказалось не способны связываться с HBEC-5i, даже после 5 раундов отбора.
HB3 паразиты были также отобраны для cytoadherence для кожи человека и легких микрососудистой эндотелиальных клеток (HDMEC и HPMEC). После 4 тура отбора, используя метод, описанный здесь, высокого обязательными населения было получено с обеих HDMEC и HPMEC (рис. 4).
Рисунок 1. Обзор процесса отбора.
Рисунок 2. Этапы развития P. тропической инфицированных красных кровяных телец. Гимза мазков визуализируются под микроскопом на 1000X увеличения.
Рисунок 3. Типичный пример паразитов привязки к HBEC-5i. (А) синий слой HBEC-5i фиксированной глутаральдегидом и окрашивали Гимза, визуализируются под микроскопом при увеличении 1000X. Фотографии были сделаны после УрБК и несвязанные iRBC были смыты. Левая панель показывает одном П. тропической HB3 (не выделен) паразит связан с HBEC-5i. В правой панели HB3-HBEC паразиты были отобраны в течение 5 раундов. (B) Данные, представляет собой среднюю из двух независимых экспериментов, каждый выполнена в двух экземплярах. Число паразитов связаны в эндотелиальных клеток было подсчитано.
Таблица 1. Резюме Plasmodium штаммов тропической которые были успешно выбраны для привязки к HBEC-5i. Обратите внимание, что HB3 был также выбран на ФНО-активированной HBEC-5i. После 5 раундов отбора, DD2 штамма показали никакого увеличения привязки к HBEC-5i по сравнению с невыбранные-DD2.
Рисунок 4. Связывание П. тропической HB3 паразиты кожи (HDMEC) и легочная (HPMEC) эндотелиальных клеток, до и после 4 тура отбора. Хотя питательной среды для HDMEC и HPMEC немного отличается (см. инструкции поставщика), протокол, используемый для выбора была такая же, как с HBEC-5i. Снимки, сделанные на 400X увеличении.
| Название реагента | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| DMEM-F12 Хэм | Сигма | D6421 | Для полной среде DMEM |
| L-глютамин 200 мМ | GIBCO | 25030 | Для DMEM и полной среде RPMI |
| Пенициллин / стрептомицин 100X (10000 ЕД / мл и 10mg/ml) | ScienCell | 0503 | Для полной среде DMEM |
| Плода бычьего сывороточного тепла инактивированной | ScienCell | 0025 | Для полной среде DMEM |
| Трипсин-EDTA (0,025% трипсина, 0,5 мм ЭДТА) | ScienCell | 0103 | |
| Эндотелиальная дополнения рост клеток | ScienCell | 1052 | Для полной среде DMEM |
| Культуры ткани обрабатывают 60 мм X 15 мм чашки Петри | BD | 353002 | |
| Человек Фибронектин | Millipore | FC010 | Используйте на 2 мкг / см 2 |
| ФНО | R &D Systems | 210-TA | обязательно, использовать на 50 мкг / мл |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | Для полной среде RPMI |
| Гентамицин 50мг/мл | Lonza | 17-518Z | Для полной среде RPMI |
| Hepes 1M | Lonza | BE17-737E | Для полной среде RPMI |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | Первичная клеточная линия |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | Первичная клеточная линия |
| HBEC-5i | Получают из-Франциско Candal (fcandal@cdc.gov) |
Таблица 2. Материалы
Discussion
Отличительной чертой церебральной малярии является секвестрация П. тропической iRBC в мозге 2 микрососудов, 3. Тем не менее, в пробирке культур P. тропической только плохо cytoadhere к HBEC-5i, модель для человеческого эндотелия капилляров мозга. Здесь мы разработали простой анализ для обогащения населения за связывание с HBEC-5i, более «в естественных условиях, как« фенотип. Три из 4 P. тропической штаммы были успешно выбраны с помощью этого метода. Кроме того, HB3 был также выбран на HDMEC и HPMEC, указывая, что этот протокол может быть использован для различных паразитов и эндотелиальных типов клеток.
Различные гипотезы могут объяснить отсутствие связывания с DD2 напряжение. Скорее всего, является тот факт, что эта линия паразит knobless, который глубоко препятствует cytoadherence 13, 14.
Мы рекомендуем культивирования невыбранные паразитов вместе с выбором пропроцессом обеспечить контроль для сравнения. Это позволит, например, сравнение транскриптом обязательных и необязательных паразитов, с надеждой на обнаружение паразитов кандидатов лиганда.
ФНО цитокинов найти на высоком уровне в церебральной малярии и пациентов было показать индуцируют экспрессию многих белков поверхности HBEC-5i (Claessens и др., в подготовке и 8, 15, 16). В этом случае количество связанного iRBC была одинаковой в нормальном HBEC-5i по сравнению с активированным HBEC-5i.
Этот «секвестр модель" также может быть использован для изучения молекулярного взаимодействия между iRBC и эндотелиальных клеток, а также влияние предполагаемых анти-cytoadherence наркотиков. В этом случае, мы рекомендуем покрытие HBEC-5i в небольших скважин, такие как "8-а камера скользит» (BD 354 628) или "CultureWell" (Sigma C7735-20EA).
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Франциско Candal, CDC трансфера технологий Office, Атланте Грузии HBEC-5i клеток. Эта работа финансировалась Wellcome Trust (4 года кандидат студенчества к сети переменного и старший стипендий в основных биомедицинских наук в JAR, номер гранта 084 226).
References
- Scherf, A. Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum. Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).
- MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration. Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).
- Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children. J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).
- Taylor, T. E. Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts. Nat. Med. 10, 143-145 (2004).
- van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction. Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).
- Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain. Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).
- Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications. Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).
- Xiao, L. Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells. Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).
- Corrigan, R. A., Rowe, J. A. Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum. Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).
- Rowe, J. A. Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication. Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).
- Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. (2009).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Cell. Microbiol. , (2009).
- Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface. J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).
- Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria. Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).
- Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).
