Protocol
1. Kweekomstandigheden van pathogenen voor optische vangen
- Grow A. fumigatus (B-5233/RGD12-8) op een semi-vaste agar media met SBD (Sabouraud dextrose) bij 30 ° C gedurende 3 dagen.
- Grow C. albicans (SC5314) in YPD (Gist-Peptone Dextrose) vloeibare cultuur met 100 ug / ml ampicilline 's nachts in een shaker incubator bij 30 ° C.
2. De voorbereiding van pathogenen voor TL-etikettering
- Oogst gewenste hoeveelheid ziektekiemen en over te dragen aan een 1,5 mL reactie buis.
- Voeg 300 ul van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) de reactie buis.
- Sonificeer mengsel gedurende 30 seconden.
- Centrifugeer bij 4000 rpm gedurende 1 minuut.
- Aspireren supernatant, waardoor pellet ongestoord.
- Herhalen (2,4) en (2,5) nog twee keer.
- Resuspendeer in 500μL van PBS.
3. Etikettering van pathogenen met een fluorescerende kleurstof
- Los 1 mg kleurstof van belang (bijvoorbeeld Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 647) in 100 pi dimethylformamide (DMF) (concentratie van 10 mg / ml).
- Voeg 3 ul van kleurstof mengsel reactie buisjes met gewassen ziekteverwekkers.
- Draaien of schudden monster op 37 ° C gedurende 1 uur.
- Was monster met PBS 3X door centrifugeren bij 4000 rpm gedurende 1 minuut.
- Resuspendeer in 300 ul PBS.
4. Oogsten T-cellen uit volbloed
- Verkrijgen van volbloed (vers).
- Warm bloed, PBS + 2% foetaal bovine serum (FBS), en histopaque tot kamertemperatuur.
- Voeg RosetteSep Human CD4 + T-cel Verrijking Cocktail op 50 ul / ml volbloed.
- Draai monster en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
- Verdunnen monster met een gelijk volume van PBS + 2% FBS en meng voorzichtig.
- Laag verdunde monster op de top van histopaque, het minimaliseren van het mengen van
- Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 1200 xg bij kamertemperatuur met de rem af.
- Verwijder de verrijkte cellen.
- Was de verrijkte cellen 2x met PBS + 2% FBS-oplossing.
- Lyse rode bloedcellen gedurende 2 minuten met een rode bloedcellen lyserende buffer
- Voeg 10 ml PBS + 2% FBS en centrifugeer gelyseerde rode bloedcellen bij 1500 rpm gedurende 5 minuten
- Aspireren supernatant, Pas op dat u de pellet te verstoren
- Resuspendeer in IMDM media met 10% foetaal runderserum
5. De voorbereiding van RAW 264,7 macrofagen in de kamer dia's
- Bereid DMEM (Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium) tot 10% FBS, 1% penicilline / streptomycine, en 1% L-glutamine bevatten.
- Warm media, trypsine, en PBS in warme bad tot 37 ° C.
- Was de plaat 2x met PBS
- Aspireren PBS tussen elke wasbeurt.
- Voeg 5 ml trypsine tot op het bord naar de oppervlakte te dekken (voor een 10 cm weefselkweek plaat).
- Incubeer 5 minuten bij 37 ° C.
- Zachtjes klop kant van de plaat om cellen van plaatoppervlak los te maken. Wees niet te trypsine splash buiten van de plaat.
- Voeg 5 ml of equivalente hoeveelheid media trypsine.
- Aspireren mengsel in een reageerbuis.
- Centrifugeer bij 1000 xg gedurende 3 minuten.
- Aspireren media, Zorg ervoor dat u de pellet te verstoren.
- Resuspendeer in 10 ml media.
- Voeg 400 ul van media om elke kamer van de kamer schuiven.
- Voeg 5 pi van celsuspensie aan elke kamer.
- Groeien 's nachts in de broedstoof bij 37 ° C met 5% CO 2.
6. Toevoeging van pathogenen te proeven
- Pipetteer 5-10 pi van gelabelde pathogenen van belang (van stap 1-3) in de kamer.
- Meng goed door pipetteren op en neer, Zorg ervoor dat u de bodem van de kamer raken om de macrofagen gehandeld verstoren.
7. Het laden van monster op draaiende schijf confocale microscoop (in video, scannen door middel van onderdelen)
- Schakel alle componenten om draaiende schijf confocale microscoop.
- Lijn microscoop voor DIC imaging.
- Verwijder de kamer dia uit incubator.
- Plaats de kamer glijden in gespecialiseerde podium.
- Verwijder de bovenkant van de kamer slide (nodig voor DIC imaging).
8. Voorbereiding voor optische trapping (in video-, scan door middel van onderdelen en de manier waarop het is geïntegreerd in de microscoop)
- Zet de sluiter voor optische val.
- Zet IR-laser.
- Open sluiter (de laser) naar optische val.
- Bevestig de sluiter voor IR laser wordt afgesloten door de controle met IR-kaart.
9. Selectie en manipulatie van een ziekteverwekker met optische val
- Focus op macrofagen op gehandeld dia.
- Zoek ziekteverwekkers vrij fluctuerende in oplossing grenzend aan macrofagen.
- Verplaats stadium zodanig dat de ziekteverwekker is in de buurt van de val.
- Open sluiter en schakel de val.
- Verhuizen monster op macrofagen in contact te brengen met de stationaire trapped ziekteverwekker.
- Afbeelding met draaiende schijf confocale microscoop, hetzij in DIC, fluorescentie, of een combinatie van beide. Doorgaans wordt trapping gedaan in DIC, en real-time beeldvorming wordt gedaan met fluorescentie.
10. Representatieve resultaten:
Uit te oefenen volledige ruimtelijke en temporele controle van pathogenen en kralen in een in vivo en in vitro omgeving, hebben we een custom-built trapping apparaat geïntegreerd op een draaiende schijf confocale microscoop (schematisch weergegeven in Fig. 1). Op volle sterkte, de laser die 350 mW vermogen en na het koppelen van het licht met de verschillende optische componenten in de optische val apparaat, ~ 80 mW vermogen op de TIRF doelstelling, zoals gemeten met een power meter, werd gebruikt om de val formulier in de kamer.
Om een object in de kamer ten opzichte van het object gevangen positie, was het toneel verplaatst terwijl de gevangen object stationair met het vangen laser. Het podium werd verplaatst langzaam genoeg snelheden, zodat de weerstand kracht op de gevangen deeltjes niet de maximale vangst van kracht overschrijden.
Afzonderlijke populaties van C. albicans (typische grootte - ~ 5 micrometer) werden gemerkt met elk van de drie kleuren (AF488, AF568, en AF647, hetgeen overeenkomt met groen, blauw en rood in de figuur, respectievelijk) om beeldvorming te illustreren met meerdere kanalen fluorescentie tegelijkertijd optisch het vangen van de ziekteverwekker. Een enkele C. albicans werd gevangen en verplaatst in een vierkant patroon door middel van een cluster van andere gist, zoals aangegeven door grijze pijlen, waaruit de mogelijkheid om vast te leggen en te manipuleren de specifieke locatie van een enkel pathogeen gekozen door de exploitant, zelfs in een drukke omgeving (Fig. 2A) .
Om te illustreren verder de flexibiliteit van dit systeem om de verschillende vormen morfologiën tentoongesteld door pathogene organismen val, de optische pincet was ook in staat om vast te houden en situeren een C. albicans deeltje met een pseudohyphae. De C. albicans gelabeld met AF647 (rood) was bewogen langs een traject zoals geschetst door de witte pijl en geplaatst naast de fluorescerende GFP-LC3-RAW-cellen (Fig. 2B). De gist deel van de C. albicans werd gevangen als de pseudohyphae getrokken langs.
We hebben ook gepositioneerd Aspergillus fumigatus naast een RAW-muis macrofaag cel in om de absolute tijdsbestek van fagocytose te analyseren met deze specifieke cellijn en pathogeen (Fig. 3A). Zodra de ziekteverwekker in contact komt met de cel, is de val uitgezet, en time-lapse imaging wordt gebruikt voor de daaropvolgende cellulaire gebeurtenissen waarnemen (Fig. 3B). De optische val werd ook gebruikt om de primaire T-cellen geïsoleerd uit het bloed vast te leggen en naast doorverwezen naar parels gecoat met anti-CD3 antilichaam in zodat de T-cel naar een immunologische synaps met de kraal (afb. 4) vormen, tonen de extra veelzijdigheid om direct vangen en te manipuleren immuuncellen.
Figuur 1. Overzicht en schema van gecombineerde optische val en draaiende schijf confocale microscoop setup. Instrument lay-out met de trapping balk (paars), verlichting pad voor helderveld beeldvorming (oranje), fluorescentie excitatie balk (rood), fluorescentie-emissie (groen), charge-coupled device (CCD) camera, elektron-vermenigvuldigen Charge Coupled Device (EM- CCD) camera, dichroïsche spiegels (D1 en D2), spiegels (M1 en M2), en lenzen (L1, L2, L3, L4). Alle andere onderdelen van de trap-confocale microscoop systeem zijn geëtiketteerd in de figuur.
Figuur 2. (A) Fluorescentie beelden van gevangen en gemanipuleerd C. albicans. Een gevangen fluorescent-gelabelde (Alexa Fluor 488 (AF488), blauw) organisme in een gebied van andere fluorescent gelabelde C. albicans (AF568, groen en AF647, rood). Het podium is verplaatst van de gevangen, blauwe CA deeltje zoals aangegeven door de grijze pijlen. (B) Trapped pseudo-hyfen vorm van C. albicans naast GFP-LC3 RAW cel. Fluorescent gelabelde psuedohyphal vorm van CA (rood, AF647) optisch opgesloten en verhuisde grenzend aan GFP-LC3 uitgedrukt RAW macrofagen. De CA organisme wordt verplaatst langs het traject, zoals aangegeven door de witte pijl.
Figuur 3. Trapping en positionering van A. fumigatus naast een fagocytaire RAW cel. (A) Helderveld beelden van een gevangen A. fumigatus, zoals aangegeven door de witte pijl, verplaatst en gepositioneerd langs het pad, zoals aangegeven door de rode pijl. De gevangen pathogeen is enigszins onscherp te wijten aan de val te duwen het organisme iets boven het brandvlak. A. fumigatus wordt verplaatst totdat het grenst geplaatst om de gewenste RAW cel. (B) grieporescence beeldvorming van fagocytose van A. fumigatus met RAW cel. Nadat de gevangen pathogeen is naast een RAW-cel geplaatst, is de fagocytose proces geactiveerd. Op 30 s, het membraan van de RAW-cel begint te veranderen en een beker te vormen rond het deeltje. Op 60 s, is de beker volledig gevormd. Van jaren '90 tot 150s, de A. fumigatus is verzwolgen, en door 180 s, het deeltje volledig geïnternaliseerd
Figuur 4. Trapping primaire T-cel synaps vormen met anti-CD3 gecoate kralen. DIC beelden van een primaire T-cel ontroerd door de optische val naar een positie naast een kraal gecoat met anti-CD3 antilichaam. De cel vormt dan een immunologische synaps, die niet gemakkelijk te onderscheiden zijn in de beelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent Inc. | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs Inc. | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs Inc. | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs Inc. | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport Corp. | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon Instruments | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon Instruments | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon Instruments | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu Corp. | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu Corp. | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter Instrument Co. | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.03 |
References
- Grakoui, A. The immunological synapse: A molecular machine controlling T cell activation. Science. 285, 221-227 (1999).
- Monks, C. R. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis and comparative innate immunity: Learning on the fly. Nat Rev Immunol. 8, 131-141 (2008).
- Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
- Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proc Natl Acad Sci USA. 94, 4853-4860 (1997).
- Ashkin, A. Acceleration and trapping of particles by radiation pressure. Phys Rev Lett. 24, 156-159 (1970).
- Ashkin, A., Dziedzic, J. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria Science. Nature. 235, 1517-1520 (1987).
- Khalil, A. S. Single M13 bacteriophage tethering and stretching. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 4892-4897 (2007).
- Khalil, A. S. Kinesin's cover-neck bundle folds forward to generate force. Proc Natl Acad Sci USA.. 105, 19247-19252 (2008).
- Li, Z. Membrane tether formation from outer hair cells with optical tweezers. Biophys J. , 1386-1395 (2002).
- Kim, S. The αβ T cell receptor is an anisotropic mechanosensor. J Biol Chem. 284, 31028-31028 (2009).
- Mohanty, S., Mohanty, K., Gupta, P. Dynamics of interaction of RBC with optical tweezers. Opt. Express. 13, 4745-4751 (2005).
- Tam, J. Control and manipulation of pathogens with an optical trap for live cell imaging of intercellular interactions. PLoS One. 5, e15215-e15215 (2010).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: Systematic review of the literature. Clin Infect Dis.. 32, 358-366 (2001).
- Wey, S. B. Hospital-acquired candidemia - the attributable mortality and excess length of stay. Arch. Intern. Med. 148, 2642-2645 (1988).
