Summary
एक विधि के लिए व्यक्तिगत का चयन करें, हेरफेर वर्णित है, और छवि रहते रोगज़नक़ों एक कताई डिस्क खुर्दबीन एक ऑप्टिकल मिलकर जाल का उपयोग कर. ऑप्टिकल जाल स्थानिक और लौकिक जीवों के नियंत्रण प्रदान करता है और उन्हें मेजबान कोशिकाओं के लिए आसन्न स्थानों. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी कोशिकाओं को कम से कम गड़बड़ी के साथ गतिशील कहनेवाला बातचीत कब्जा है.
Protocol
1. संस्कृति शर्तों रोगजनकों के ऑप्टिकल फँसाने के लिए
- एक अर्द्ध ठोस अगर 30 में SBD (Sabouraud dextrose) युक्त मीडिया ° सी पर ए fumigatus (B-5233/RGD12-8) 3 दिनों के लिए आगे बढ़ें.
- सी. आगे बढ़ें YPD में (SC5314) albicans (खमीर - Peptone Dextrose) तरल संस्कृति 100 μg / एमएल एम्पीसिलीन रात भर में एक प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर में 30 से युक्त डिग्री सेल्सियस
2. रोगजनकों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए तैयार
- हार्वेस्ट रोगजनकों की राशि वांछित है और एक 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूब को हस्तांतरण.
- जोड़ें फॉस्फेट की 300 μL प्रतिक्रिया ट्यूब buffered खारा (पीबीएस).
- 30 सेकंड के लिए मिश्रण Sonicate.
- 1 मिनट के लिए 4000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला Aspirate, गोली undisturbed छोड़ने.
- (2.4) दोहराएँ और (2.5) दो से अधिक बार.
- पीबीएस के 500μL में Resuspend.
3. फ्लोरोसेंट रंजक के साथ रोगजनकों के लेबल
- 100 μL dimethylformamide (DMF) (10 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता) में ब्याज की डाई (जैसे Alexa 488 Fluor, alexa Fluor 647) के 1 मिलीग्राम भंग.
- प्रतिक्रिया धोया रोगज़नक़ों युक्त ट्यूबों डाई मिश्रण के 3 μL जोड़ें.
- घुमाएँ या 37 में नमूना हिला डिग्री सेल्सियस 1 घंटे के लिए.
- पीबीएस 3X के साथ 1 मिनट के लिए 4000 rpm पर centrifuging नमूना धो लें.
- पीबीएस के 300 μL में Resuspend.
4. पूरे रक्त से टी कोशिकाओं फसल काटने वाले
- पूरे रक्त (ताजा) प्राप्त करते हैं.
- गर्म रक्त, Pbs + 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और कमरे के तापमान पर histopaque.
- 50 / पूरे रक्त की μL एमएल RosetteSep मानव सीडी 4 + टी सेल संवर्धन कॉकटेल जोड़ें.
- नमूना घुमाएँ और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
- पीबीएस + 2% FBS की एक समान मात्रा के साथ नमूना पतला और धीरे मिश्रण.
- परत histopaque के शीर्ष पर नमूना पतला, कम से कम मिश्रण
- ब्रेक से के साथ 1200 XG कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- समृद्ध कोशिकाओं निकालें.
- समृद्ध पीबीएस + 2% FBS समाधान के साथ 2x कोशिकाओं धो लें.
- लाल रक्त कोशिका lysing बफर के साथ 2 मिनट के लिए लाल रक्त कोशिकाओं lyse
- 5 मिनट के लिए पीबीएस + 2% FBS और अपकेंद्रित्र lysed 1500 rpm पर लाल रक्त कोशिकाओं के 10 एमएल जोड़ें
- सतह पर तैरनेवाला, सावधान Aspirate गोली परेशान नहीं
- IMDM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त मीडिया में Resuspend
5. चैम्बर स्लाइड्स में रॉ 264.7 मैक्रोफेज की तैयारी
- DMEM (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम) 10% FBS, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1% एल glutamine को रोकने के लिए तैयार.
- गर्म मीडिया, trypsin, और गुनगुने पानी से स्नान में 37 पीबीएस डिग्री सेल्सियस
- पीबीएस के साथ थाली 2x धो
- प्रत्येक धोने के बीच Aspirate पीबीएस.
- थाली करने के लिए 5 एमएल trypsin जोड़ें सतह को कवर (10 सेमी टिशू कल्चर की थाली के लिए).
- 37 पर 5 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
- धीरे थाली की ओर दस्तक थाली की सतह से कोशिकाओं को अलग. थाली के बाहर trypsin नहीं छप सावधान रहें.
- 5 एमएल या trypsin मीडिया के बराबर राशि जोड़ें.
- एक प्रतिक्रिया ट्यूब में मिश्रण Aspirate.
- 3 मिनट के लिए 1000 XG अपकेंद्रित्र.
- Aspirate मीडिया, सावधान गोली को परेशान नहीं.
- मीडिया के 10 एमएल में Resuspend.
- चैम्बर स्लाइड के प्रत्येक कक्ष के लिए मीडिया के 400 μL जोड़ें.
- प्रत्येक कक्ष में सेल निलंबन के 5 μL जोड़ें.
- इनक्यूबेटर में 37 पर रातोंरात ग्रो डिग्री सेल्सियस 5% सीओ 2 के साथ .
6. रोगजनकों के नमूना के अलावा
- Pipet ब्याज की लेबल रोगजनकों के 5-10 μL चरण 1-3 से चेंबर में.
- ऊपर और नीचे pipeting, सावधान कक्ष के नीचे छू नहीं का पालन मैक्रोफेज परेशान करके अच्छी तरह मिक्स.
7. कताई डिस्क confocal खुर्दबीन पर नमूना लोड हो रहा है (वीडियो में, घटकों के माध्यम से स्कैन)
- सभी घटकों पर कताई डिस्क confocal खुर्दबीन करने के लिए मुड़ें.
- डीआईसी इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप संरेखित करें.
- इनक्यूबेटर से चैम्बर स्लाइड निकालें.
- विशेष चरण में चैम्बर स्लाइड सम्मिलित करें.
- चैम्बर स्लाइड (डीआईसी इमेजिंग के लिए आवश्यक) के शीर्ष निकालें.
8. ऑप्टिकल फँसाने के लिए तैयार (वीडियो में, घटकों के माध्यम से स्कैन और यह माइक्रोस्कोप में कैसे एकीकृत है)
- ऑप्टिकल जाल के लिए शटर पर मुड़ें.
- IR लेजर पर मुड़ें.
- ऑप्टिकल जाल ओपन शटर (लेजर) पर.
- IR लेजर के सामने शटर की पुष्टि IR कार्ड के साथ की जाँच करके बंद कर दिया है.
9. चयन और ऑप्टिकल जाल के साथ रोगज़नक़ के हेरफेर
- पालन स्लाइड पर मैक्रोफेज पर ध्यान दें.
- मैक्रोफेज करने के लिए आसन्न समाधान में स्वतंत्र रूप से अस्थिर रोगज़नक़ों का पता लगाएं.
- ऐसी है कि रोगज़नक़ जाल के आसपास के क्षेत्र में मंच पर ले जाएँ.
- शटर खोलें और जाल संलग्न.
- स्थिर जाल के साथ संपर्क में मैक्रोफेज लाने नमूना ले जाएँped रोगज़नक़.
- कताई डिस्क confocal खुर्दबीन, डीआईसी, प्रतिदीप्ति, या दोनों के संयोजन में या तो के साथ छवि. आमतौर पर, फँसाने डीआईसी में किया जाता है, और वास्तविक समय इमेजिंग प्रतिदीप्ति के साथ किया जाता है.
10. प्रतिनिधि परिणाम:
Vivo में एक और इन विट्रो वातावरण में पूरा रोगज़नक़ों और मोती के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण लागू करने के लिए, हम एक कस्टम निर्मित फँसाने एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन (योजनाबद्ध चित्र में दिखाया गया है 1.) पर एकीकृत तंत्र बनाया है. पूरी ताकत में, लेजर बिजली की 350 मेगावाट प्रदान की और विभिन्न ऑप्टिकल घटकों के साथ ऑप्टिकल जाल तंत्र में प्रकाश युग्मन के बाद, TIRF उद्देश्य पर ~ 80 पर सत्ता के मेगावाट के रूप में एक बिजली मीटर के साथ मापा, जाल बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था चैम्बर में.
आदेश में फंस वस्तु के सापेक्ष कक्ष में एक वस्तु की स्थिति के लिए, मंच पर ले जाया गया था जबकि फंस फँसाने लेजर के साथ स्थिर वस्तु पकड़े. चरण धीमी पर्याप्त वेग पर ले जाया गया था, ताकि फंस कण पर खींचें बल अधिकतम फँसाने बल से अधिक नहीं था.
सी. albicans के अलग आबादी (विशिष्ट आकार - ~ 5 सुक्ष्ममापी) प्रत्येक तीन रंग (AF488, AF568, और AF647, हरे, नीले, के लिए इसी आंकड़े में लाल, क्रमशः) के साथ लेबल रहे थे कई प्रतिदीप्ति चैनल के साथ इमेजिंग उदाहरण देकर स्पष्ट करना जबकि एक साथ ऑप्टिकली रोगज़नक़ फँसाने. एक एकल सी. albicans फंस गया था और अन्य खमीर के एक क्लस्टर के माध्यम से एक वर्ग पैटर्न में ले जाया गया, के रूप में भूरे रंग के तीर द्वारा संकेत पर कब्जा करने के लिए और एक एकल एक भीड़ भरे वातावरण में भी ऑपरेटर द्वारा चुना रोगज़नक़ का विशिष्ट स्थान ( 2A छवि) में हेरफेर करने की क्षमता का प्रदर्शन .
आगे यह जाल अलग आकार रोगजनक जीवों द्वारा प्रदर्शित morphologies प्रणाली के लचीलेपन वर्णन करने के लिए, ऑप्टिकल चिमटी से नोचना भी पकड़ और एक सी. बैठा था करने में सक्षम एक pseudohyphae साथ albicans के कण. सी. AF647 (लाल) के साथ लेबल albicans के एक प्रक्षेपवक्र साथ ले जाया गया था के रूप में सफेद तीर द्वारा उल्लिखित है और फ्लोरोसेंट GFP-LC3 रॉ कोशिकाओं (छवि 2B) के बगल में रखा है. सी. के खमीर भाग albicans के रूप में pseudohyphae साथ पिछड़ फंस गया था.
हम भी Aspergillus fumigatus तैनात एक रॉ माउस बृहतभक्षककोशिका सेल करने के लिए अगले क्रम में इस विशेष सेल लाइन और रोगज़नक़ (छवि 3A) के साथ phagocytosis का पूर्ण समय सीमा का विश्लेषण. एक बार रोगज़नक़ सेल के साथ संपर्क में आता है, जाल बंद कर दिया है, और समय चूक इमेजिंग के लिए बाद में सेलुलर घटनाओं का निरीक्षण (3B छवि) के लिए कार्यरत है. ऑप्टिकल जाल भी प्राथमिक टी - कोशिकाओं पर कब्जा खून से अलग और टी सेल के लिए आदेश में विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ लेपित मनका (4 छवि) के साथ एक प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse फार्म मोतियों के लिए आसन्न निर्देशित किया गया था, अतिरिक्त दिखाने बहुमुखी प्रतिभा सीधे और जाल करने के लिए प्रतिरक्षा कोशिकाओं में हेरफेर.
चित्रा 1 अवलोकन और संयुक्त ऑप्टिकल जाल और कताई डिस्क confocal खुर्दबीन सेटअप के योजनाबद्ध. साधन फँसाने (बैंगनी) बीम, brightfield इमेजिंग (नारंगी), प्रतिदीप्ति उत्तेजना बीम (लाल), प्रतिदीप्ति उत्सर्जन (हरा), प्रभारी युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा, के लिए रोशनी इलेक्ट्रॉन गुणा चार्ज डिवाइस युग्मित पथ दिखा लेआउट (EM- सीसीडी) कैमरा, dichroic दर्पण (D1 और D2), दर्पण (M1 और M2), और लेंस (L1, L2, L3, L4). जाल confocal खुर्दबीन प्रणाली के सभी अन्य घटकों आंकड़ा में चिह्नित कर रहे हैं.
चित्रा 2 (ए) के प्रतिदीप्ति छवियों और फँस सी. चालाकी. albicans. फंस fluorescently लेबल अन्य fluorescently लेबल सी. के क्षेत्र में जीव (Alexa 488 Fluor (AF488), नीले) (AF568, हरे और AF647, लाल) albicans. चरण फंस, नीले सीए के रूप में भूरे रंग के तीर द्वारा संकेत कण के चारों ओर ले जाया जाता है. (बी) फँसा सी. के रूप छद्म hyphal GFP-LC3 रॉ सेल करने के लिए अगले albicans. सीए के fluorescently लेबल psuedohyphal प्रपत्र (लाल, AF647) ऑप्टिकली और फँस GFP-LC3 के लिए आसन्न ले जाया रॉ मैक्रोफेज व्यक्त किया. सीए जीव प्रक्षेपवक्र के साथ ले जाया जाता है के रूप में सफेद तीर द्वारा संकेत.
चित्रा 3 फँसाने और ए की स्थिति. एक phagocytic रॉ सेल करने के लिए अगले fumigatus. (ए) एक फँस ए brightfield छवियों fumigatus, के रूप में सफेद तीर द्वारा संकेत दिया, के रूप में लाल तीर द्वारा संकेत मार्ग के किनारे चले गए और तैनात. फंस रोगज़नक़ थोड़ा ध्यान से बाहर है फोकल हवाई जहाज़ से थोड़ा ऊपर जीव धक्का जाल के कारण ए . fumigatus ले जाया जाता है जब तक यह वांछित रॉ सेल करने के लिए आसन्न रखा है. (बी) फ्लूए के phagocytosis की orescence इमेजिंग रॉ सेल द्वारा fumigatus. फंस रोगज़नक़ के बाद एक रॉ सेल करने के लिए बगल में रखा गया है, phagocytosis प्रक्रिया सक्रिय है. 30 एस में, रॉ सेल की झिल्ली के बदलने के लिए और कण के चारों ओर एक कप फार्म शुरू होता है. 60 एस, कप पूरी तरह से बनाई है. 90 के दशक से 150s, ए fumigatus घिरा हुआ है, और 180 द्वारा, कण पूरी तरह से भली भाँति है
चित्रा 4. एक टी सेल प्राथमिक विरोधी CD3 एंटीबॉडी के साथ एक मनका लेपित करने के लिए अगले स्थिति के लिए ऑप्टिकल जाल द्वारा ले जाया के प्राथमिक टी सेल विरोधी CD3 लिपटे मोतियों के साथ synapse फार्म. डीआईसी छवियों को फँसाने. सेल तो एक प्रतिरक्षाविज्ञानी synapse, जो छवियों में आसानी से discerned नहीं किया जा सकता है रूपों.
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Discussion
5 सुक्ष्ममापी - इस काम में हम एक ऑप्टिकल 3 सुक्ष्ममापी बीच आयामों के साथ जाल रोगज़नक़ों कब्जा का उपयोग. हालांकि हमारी प्रयोगशाला में ब्याज की रोगज़नक़ों आम तौर पर इन आयाम है, ऑप्टिकल चिमटी से नोचना यहाँ वर्णित प्रणाली के लिए आकार की एक बड़ी रेंज जाल लचीला है. वास्तव में ऑप्टिकल जाल एकल परमाणुओं से कोशिकाओं को व्यास में लगभग 10 सुक्ष्ममापी लेकर कणों पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. गोलाकार, अण्डाकार, और अत्यंत लम्बी कण, जो उपयोगी है जब जैविक रोगज़नक़ों के साथ काम कर रहे: इसके अतिरिक्त, इस ऑप्टिकल फँसाने प्रणाली विभिन्न आकार के कणों पर कब्जा करने में सक्षम था.
इस विधि, phagocytosis और synapse गठन के साथ, वास्तविक समय में, की जांच की, थे और सेलुलर सतह पर संरचनात्मक परिवर्तनों का विश्लेषण किया गया था. किसी कक्ष के बगल में स्थिति कणों करके, जीना रोगज़नक़ों नियंत्रित थे और phagocytic मशीनरी को सक्रिय और जीवित कोशिकाओं में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अध्ययन करने और phagocytosis का पूरा कोर्स के माध्यम से एक घटना के निरपेक्ष शुरुआत की निगरानी करने के लिए चालाकी है. एक परिणाम के रूप में, phagocytic घटनाओं और मशीनरी के संपूर्ण विकास को सही मापा जा सकता है. हम ए के phagocytosis पीछा रोगज़नक़ के रूप में fumigatus एक बृहतभक्षककोशिका बगल में रखा है, और प्रारंभिक झिल्ली परिवर्तन के रूप में देखा कण घिरा हुआ था. हम करने के लिए सही नियंत्रित है जब हम प्रक्रिया रोगज़नक़ के स्थान के साथ शुरू करने के लिए चाहता था द्वारा इस प्रक्रिया के पूरे समय सीमा को मापने में सक्षम थे. इस तकनीक को भी प्राथमिक टी कोशिकाओं द्वारा देख synapse गठन के लिए बढ़ाया गया था. ऑप्टिकल चिमटी से नोचना एक टी सेल एक विरोधी CD3 लेपित मनका एंटीबॉडी के बगल में ले जाया गया, और synapse गठन वास्तविक समय में मनाया जा सकता है है.
हमारे ज्ञान करने के लिए इस पद्धति को नियंत्रित करने के लिए और एक phagocytic सेल करने के लिए अगले रोगज़नक़ में हेरफेर करने के लिए पहली है, और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ conjuction में, रिकॉर्ड और के साथ विवर्तन सीमित निरपेक्ष और phagocytosis की शुरुआत के अंत कल्पना तीन आयामों में इस्तेमाल किया गया था spatio अस्थायी समाधान है. तकनीक भी नियंत्रित करने के लिए और प्राथमिक टी - कोशिकाओं में हेरफेर प्रतिरक्षाविज्ञानी synapses का अध्ययन करने के लिए, जैविक आवेदनों की एक किस्म के लिए इस उपकरण की बहुमुखी प्रतिभा illustrating के लिए उपयोग किया गया था. हमारी प्रणाली पांच उत्तेजना तरंगदैर्य प्रदान करता है, यूवी उत्तेजना सहित fluorophores की एक किस्म की इमेजिंग सक्षम है. फँसाने उपकरण 4.5 फुट 2 पदचिह्न, कई पारंपरिक epifluorescent और confocal सूक्ष्मदर्शी पर एकीकृत किया जा करने में सक्षम में रह रहे हैं. हालांकि इस उपकरण ऑब्जेक्ट हेरफेर के लिए मुख्य रूप से डिजाइन किया गया था, भविष्य संशोधनों उच्च शक्ति लेजर, मनका स्थिति का पता लगाने क्षमताओं, आदि शामिल हैं सेल रोगज़नक़ बातचीत में biomechanical बलों के लक्षण वर्णन में सक्षम होगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम मैसाचुसेट्स चिकित्सा आंतरिक फंड के जनरल अस्पताल विभाग (JMT, MKM, विधान परिषद के सदस्य, JMV), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल इमेजिंग के और बायोइन्जिनियरिंग T32EB006348 अनुदान (सीईसी), कम्प्यूटेशनल और एकीकृत जीवविज्ञान विकास निधि के लिए मैसाचुसेट्स जनरल ने अस्पताल केंद्र और AI062773 द्वारा समर्थित था ( RJH), AI062773 अनुदान, DK83756, और 043351 डी.के. (RJX), NSF 0643745 (MJL), R21CA133576 NIH (MJL), और एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के (NIH) के AI057999 (JMV ). हम निकोलस सी. Yoder उपयोगी विचार - विमर्श के लिए धन्यवाद, और तकनीकी सहायता के लिए चार्ल्स Felts (आरपीआई इंक).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| A. fumigatus | Albino strain, B-5233/RGD12-8, gift from K.J. Kwon-Chung, NIH | ||
| C. albicans | SSY50-B mutant, gift from Eleftherios Mylonakis, MGH; SC5314 strain, gift from Gerald Fink, Whitehead Institute | ||
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A20000 | |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A20006 | |
| dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 | |
| Fresh blood | Gift from R.J.W. Heath, MGH, HMS | ||
| Nikon inverted microscope | Nikon Instruments | Model Ti-E | |
| Trapping laser, ChromaLase | Blue Sky Research | CLAS-106-STF02-02 | |
| Fluorescence excitation laser | Coherent Inc. | Model Innova 70C | |
| Breadboards for trapping components | Thorlabs Inc. | MB1224, MB1218 | |
| Optical air table | Technical Manufacturing Corp. | ||
| Electronic shutter with pedal control | Uniblitz | Purchased from Vincent Associates, Rochester, NY | |
| Singlemode optical fiber | Oz Optics | PMJ-3S3S-1064-6 | |
| Fiber positioner | Thorlabs Inc. | PAF-X-5-C | |
| Fiber collimator | Oz Optics | HPUCO-23-1064-P-25AC | |
| Lenses for telescope | Thorlabs Inc. | AC254-150-B | Focal length of 150 mm |
| Translation stages (x, y, z) | Newport Corp. | M-461-XYZ | |
| IR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | ET750-sp-2p8 | |
| Objective lens (100X) | Nikon Instruments | NA = 1.49, oil immersion, TIRF objective | |
| Confocal head | Yokogawa | CSU-XI | |
| Polarizer | Nikon Instruments | MEN51941 | |
| Wollaston prism | Nikon Instruments | MBH76190 | |
| EM-CCD camera | Hamamatsu Corp. | C9100-13 | |
| CCD camera (ORCA ER) | Hamamatsu Corp. | C4742-80-12AG | |
| Filter wheel | Ludl | 99A353 | |
| Filter wheel | Sutter Instrument Co. | LB10-NWE | |
| Chambered coverglass | Lab-Tek | 155409 | |
| Dynabeads | Invitrogen | 111-51D | Coated with anti-CD3 |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Invitrogen | 10313 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Fetal Bovine Serum (HyClone) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30071.03 |
References
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