Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

تحت الجلد إدارة الخصوم والمسكارينية الثلاثي Immunostaining من إبهام العضلة الرافعة أوريس في الفئران

Published: September 8, 2011 doi: 10.3791/3124

Summary

نحن تصف الإجراءات اللازمة لإدارة المتكررة من مثبطات المسكارينية يشير إلى الرافعة الأذن الطويلة (LAL) عضلات الفئران البالغين الشباب وimmunostaining لاحقة من التقاطعات في الاعصاب (NMJs) في wholemounts. عضلة LAL ومزايا فريدة للكشف عن

Abstract

وكثيرا ما تستخدم عضلات الأطراف الخلفية من القوارض ، مثل الساق الأمامية والظنبوبي ، لفي الدراسات الدوائية المجراة من الإشارات الأساسية لتشكيل وصيانة NMJs الثدييات. ومع ذلك ، فإن تغلغل المخدرات في هذه العضلات بعد تحت الجلد أو في العضل الإدارة غالبا ما تكون ناقصة او غير مستوية وNMJs كثيرة يمكن أن تبقى غير متأثرة. على الرغم من أن الإدارة النظامية مع الأجهزة مثل المضخات الصغيرة يمكن أن تحسن من آثار spatiotemporal ، لا يمكن للطبيعة الغازية لهذا النهج يسبب التباس الاستجابات الالتهابية و / أو أضرار مباشرة في العضلات. وعلاوة على ذلك ، وتحليل كامل للNMJs في العضلة الخلفية أطرافهم يمثل تحديا لأنه يتطلب وقتا طويلا sectioning immunostaining المسلسل واسعة النطاق.

وLAL الماوس رقيقة ، ورقة مسطحة من العضلات الموجودة بشكل سطحي على ظهر الرقبة. فهو سريع نشل وظائف العضلات التي لتحريك الصيوان. أنه يحتوي على أجزاء منقاري والذيلية التي تنشأ من خط الوسط من الجمجمة ويمتد أفقيا إلى جزء غضروفي كل الصيوان. ويتم تزويد عضلة من قبل فرع من العصب الوجهي أن المشاريع caudally فور خروجها من الثقبة الإبرية الخشائية. لقد تم العثور على LAL وغيرها لتكون مريحة استعدادا التي توفر مزايا للتحقيق في المديين القصير والطويل الأجل في آثار المخدرات على الجسم الحي NMJs والعضلات. أولا ، وموقعها سطحية يسهل تطبيقات محلية متعددة من المخدرات تحت تخدير خفيف. الثانية ، لركاكة (2-3 طبقات من ألياف العضلات) تصاريح التصور والتحليل لNMJs كلها تقريبا داخل العضلات. ثالثا ، سهولة مع تشريح الأعصاب سليمة لها جنبا إلى جنب مع نمط تعصيب لها تصاريح التحليل التكميلي في المختبر 9،5 الكهربية. الماضي ، وربما الأهم من ذلك ، حجم صغير تطبيق (~ 50μl) تغطي بسهولة على سطح العضلة بأكملها ، ويوفر موحدة والتعرض المطول للNMJs به جميعا في المخدرات ويلغي الحاجة إلى اتباع نهج متسق 1،8.

Protocol

1. تحت الجلد إدارة الخصوم أستيل المسكارينية (mAChR) مستقبلات

  1. إعداد تحت ظروف معقمة الجرعة المناسبة من خصم mAChR ، (راجع ، الجدول) عن طريق تذويب المخدرات في المياه المالحة الفسيولوجية العقيمة في أنبوب 1.5mL رد فعل. الخصوم التالية استخدمت : الأتروبين ، Methoctramine ، 4 - رطبة ، AFDX - 116 ، AFDX - 384 ، MT 7.
  2. رسم 50μl حل حقنة الانسولين في a1cc واستخدام حقنة منفصلة لكل الماوس. أيضا بإعداد الحقن التي تحتوي على المياه المالحة الفسيولوجية فقط لكل الماوس في السيطرة على المجموعة. إبقاء الحقن على الجليد حتى جاهزة للحقن.
  3. تخدير الفئران مع الكيتامين - زيلازين الكوكتيل (120 ملغم / كغم من الكيتامين و 8 ملغ / كغ زيلازين) التحقق من عمق التخدير المناسبة من خلال مراقبة عدم استجابة إلى أخمص قدميه قرصة.
  4. بعد التخدير المناسبة ، حلق الشعر الذي يغطي المنطقة منقاري من الرأس إلى المنطقة الذيلية من الرقبة ، ومحو ما تبقى الشعر بعيدا مع الايثانول 70 ٪.
  5. الفأر في ظل stereomicroscope ، وإدراج موازية لإبرة عضلية LAL حين سحب ما يصل برفق على إبرة المحقنة (الشكل 1A ، B). هذا يضمن أن يتم إدخال الإبرة في النسيج الضام المغطي ولا أضرار مباشرة في عضلة LAL نفسها. ادخال الإبرة بحيث يغطي رأس الجانب الذيلية عضلة LAL.
  6. تبدأ ببطء جدا لحقن المحلول فوق العضلات LAL حق حين سحب الحقنة ، والوقت حقن مجموع ينبغي حوالي 1 دقيقة. إذا حقنت بشكل صحيح ، يجب حل تشكيل "القبة" وهذا هو ما يقرب من 1 سم في القطر ، في الجلد المغطي التي ستبقى لمدة ساعة على الأقل. سيكون هناك حل موحد حقن تغطية مناطق بأكملها منقاري والذيلية من العضلات LAL الحق.
  7. كرر الإجراء كل 12 ساعة لمدة 1-7 أيام. لstudies1 أخرى ، استخدمنا نفس البروتوكول لحقن عوامل النمو كل 12 ساعة لمدة تصل إلى 21 يوما. لم يلاحظ أي استجابات غير طبيعية من فئران تديرها 2X مع تخدير في اليوم لمدة تصل إلى 21 يوما.

2. تشريح العضلات LAL

  1. الموت ببطء مع الفئران جرعة زائدة من الصوديوم بنتوباربيتال (390 ملغ / كلغ). وأكد وفاة من خلال تقييم نقص ضربات القلب بعد إجراء بضع الصدر.
  2. دبوس باستمرار على الماوس في طبق تشريح ، حتى مع الجانب الظهري 1 دبوس في كل مخلب و 1 دبوس عن طريق الأنف.
  3. جعل شق الأولى من خلال الجلد فقط ، وذلك باستخدام مقص لقطع صغيرة الربيع على طول LAL اليسرى من المنطقة القريبة فقط على الأذن في المنطقة حول الكتف الأيسر.
  4. إزالة بعناية الجلد في هذه المنطقة ، ولكن تجنب قطع قريبة جدا من الأذن اليمنى حيث أن هذا هو واحد من الإسناد لعضلة LAL الحق.
  5. تحديد الأنسجة الدهنية المتمركزة مركزيا الشريط من الدهون على طول خط الوسط ، على السطح سطحية في الرأس ، حيث العضلات اليمنى واليسرى LAL قاء. باستخدام مقص صغير في الربيع ، وقطع 1cm إلى اليمين من الأنسجة الدهنية (نحو الأذن اليسرى) من الحافة القريبة من العضلات LAL اليسار حتى تصل إلى الكتف (الشكل 1C).
  6. مرة واحدة يتم إجراء شق ، قشر العضلة الخلفية LAL الحق مع ملقط صغير للكشف عن الجانب البطنية من العضلات. قص النسيج الضام ، وبينما لفافة بعناية سحب ما يصل على عضلة LAL الحق مع ملقط (الشكل 1C).
  7. قطع حوالي نهاية الذيلية للLAL الحق في قاعدة الأذن. تواصل خفض وصولا الى نهاية منقاري من الأذن اليمنى ، والحفاظ على حق سلمت LAL (الشكل 1C). فمن الأفضل لتشمل المزيد من الأنسجة في هذه الخطوة من مخاطر الإضرار LAL نفسها. إذا كانت العضلات تبدأ لتجف ، ماصة 1X PBS على العضلات.
  8. مكان تشريح LAL الحق في الثقافة 30mm Sylgard صحن يحتوي على 1X PBS ، حتى الجانب الظهري. دبوس بانخفاض أربعة أركان من العضلات مع دبابيس الحشرات الصغيرة.
  9. باستخدام ملقط ومقص صغير الربيع ، والنسيج الضام نظيفة من السطوح الظهرية والبطنية من العضلات LAL الحق. بدوره على العضلات وإعادة دبوس من أجل تنظيفه قبالة السطح البطني. لا يجوز أن يوضع 2-3 العضلات في نفس الطبق 30mm.

3. الثلاثي immunostaining من NMJs LAL : يوم 1

  1. قبل بداية immunostaining ، وإعداد جميع الكواشف اللازمة. سوف 1X PBS ، الأبقار مصل الزلال 2 ٪ BSA) / برنامج تلفزيوني ، 0.1M جليكاين في 2 ٪ تكون هناك حاجة إلى جيش صرب البوسنة / PBS ، 0.2 ٪ X100 تريتون في 2 ٪ BSA / برنامج تلفزيوني ، وبارافورمالدهيد 4 ٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني 1X. قبل الميثانول بارد في الثلاجة -20 درجة مئوية.
  2. ترك العضلات LAL معلقة في طبق جانبي ظهري حتى أثناء هذه العملية. تجاهل 1X PBS الحل وإضافة ما يكفي من 4 ٪ (PFA) لتغطية العضلات. تعيين مكان على طبق شاكر في سرعة 2 أو 3 لمدة 20 دقيقة. ما لم يذكر خلاف ذلك ، ينبغي أن توضع في طبق على شاكر للخطوات التالية.
  3. تجاهل PFA 4 ٪ ، ويغسل العضلات مع 1X 3 مرات في برنامج تلفزيوني ، 10 'لكل منهما.
  4. تجاهل مشاركة 1X PBS يغسل وإضافة 0.1M جليكاين في 2 ٪ BSA / PBS حل ل30 '.
  5. تجاهل 0.1M جليكاين حلاد إضافة 1X PBS تحتوي رودامين مترافق α - بنغاروتوكسين بتركيز لمدة 15 1:200.
  6. تجاهل α - بنغاروتوكسين حل ، ويغسل في عضلة 1X PBS ، 3 مرات 10 'لكل منهما.
  7. Permeabilize الأنسجة بإضافة الميثانول قبل تبريده ووضع الطبق في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق بالضبط ، والهز لا الحاجة.
  8. إزالة الميثانول وتغسل 3 مرات 10 'مع كل برنامج تلفزيوني 1X. تجاهل الماضي وغسل كتلة الأنسجة مع 0.2 ٪ تريتون X - 100 في 2 ٪ BSA / برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة. يتم تنفيذ الخطوات الغسيل وعرقلة في درجة حرارة الغرفة.
  9. احتضان العضلات بين عشية وضحاها ، والهز ، في 4 درجات مئوية في مزيج من الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل (راجع ، الجدول).

4. الثلاثي immunostaining من NMJs LAL : يوم 2

  1. غسل العضلات في 1X 3 مرات في برنامج تلفزيوني ، 10 'كل في درجة حرارة الغرفة.
  2. إضافة مزيج من الأجسام المضادة الثانوية في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (راجع ، الجدول). يجب أن تكون محمية من الضوء على العضلات من هذه الخطوة فصاعدا لمنع الصور وتبييض مضان 647 - اليكسا فلور.
  3. غسل العضلات في 1X 3 مرات في برنامج تلفزيوني ، 10 'لكل منهما.
  4. تنظيف قبالة أي نوع من الأنسجة الضامة المتبقية في برنامج تلفزيوني 1X ، وقطع الحدود الجانبية للعضلات LAL وجبل على شرائح تصل الجانب الظهري ، وذلك باستخدام غطاء زجاجي زلات ووسائل الإعلام في تصاعد مستمر. استخدام طلاء الأظافر واضحة لتأمين تغطية الانزلاق في المكان.
  5. حماية الشرائح من الضوء وتخزينه في -20 درجة مئوية لتصبح جاهزة للتحليل.

5. مبائر تصوير NMJs LAL

  1. ويتم الحصول على صور عالية الدقة مع مبائر هدفا لايكا آبو خطة النفط 63X (1.4NA) على المجهر لايكا 4D TCS مبائر.
  2. وقد تم مسحها ضوئيا في وقت واحد والاشارات فلوريسئين اليكسا 647 مع خطوط الليزر 488 نانومتر (أرغون ، 488 نانومتر ، و 20 ميغاواط) و 633 نانومتر (HeNe ، 633 نانومتر ، و 10 ميغاواط) ، على التوالي. بالتتابع ، ثم يتم مسحها إشارة رودامين مع خط ليزر 561 نانومتر (DPSS ، 561 ، 20 ميغاواط). وقد تم جمع الأجزاء البصرية في فترات 0.3 ميكرون ، وعدد الصور في Z - طائرة متنوعة 60-80. يتم ضبط الثقب إلى 1 إيري (107.97 أم). تنسيق الصورة 1024 x 1024 (X ، Y) ، مع عامل التكبير من 1 ، إلى نتائج سرعة 400Hz في حجم صورة 234.32 234.32 س ميكرومتر ميكرومتر وحجم بكسل نانومتر 229.05 229.05 س نانومتر.
  3. ثم يتم استخدام برامج لايكا اقتناء TCS - NT - Z لإعادة بناء الصور في سلسلة توقعات الكثافة القصوى.
  4. ويتم تعديل الصور Multipanel عن السطوع والتباين باستخدام أدوبي فوتوشوب.
  5. لالعضلات LAL نموذجية ، ينبغي للمرء أن يكون قادرا على تحليل ما يقرب من 75-100 NMJs وجه خاص. يتحدد الاستقرار متشابك من المميزات مثل المحاذاة المكاني لمرحلة ما قبل ، وبعد المشبكي شبه العناصر (أي الأعصاب ، وخلايا شوان والعضلات) ، وقياسات المساحة متشابك (أي حجم المشبك).

ممثل النتائج :

في NMJ في الثدييات الكبار ، ومحور عصبي محرك واحد يفصل فروع الغرامة التي تشكل العرش متباينة جدا من محطة عصب (الشكل 2 ؛ الأخضر) على ألياف العضلات واحد ، على وجه التحديد لمجموعات apposed بعد المشبكي من AChRs النيكوتينيك (الشكل 2 ؛ الأحمر) . Perisynaptically ، محطة خلايا شوان تغطي بإحكام جميع فروع العصب محطات قبل المشبكي (الشكل 2 ؛ الأزرق). هو بشدة على السلامة الهيكلية والوظيفية لهذه المنظمة الثلاثية مضطرب من جراء التطبيق اليومي لمثبطات mAChR سلالة معينة. في المثال المقدمة هنا (الشكل 3) ، 4 - رطبة ، وهو خصم mAChR مع تقارب عالية لM1 ، M3 ، M4 و M5 mAChR فرعية ، تثير القضاء الانتقائي لمحطات العصبية من NMJs عديدة في جميع أنحاء سطح العضلات (الشكل 3B ، C). بالإضافة إلى ذلك ، محطة خلايا شوان وهادئة بشكل غير طبيعي كما يتضح من 8 وسم S100 مشرق دون تمديد العملية (الشكل 3B "3C"). Postsynaptically ، ألياف العضلات طبيعية وليس هناك فقدان nAChRs (الشكل 3B ، 3C ').

الشكل 1
الشكل 1. الموقع التشريحي وتنظيم LAL العضلات. وتظهر مواقع منقاري (rLAL) ، الذيلية (cLAL) ، والعصب لال (LALn) وشرائح endplate المقابلة (A ، أقحم). يظهر موقع واتجاه الإبرة في العضلة يتعلق LAL لإجراء الحقن (B). وتظهر نقاط شق لإجراء تشريح (C).

الشكل 2
الشكل 2. الثلاثية للمنظمة NMJ. عالية التكبير وجهات النظر مبائر NMJ من الماوس. محور عصبي واحد يفصل فروع المحطة الدقيقة (A) ، تغطي بإحكام من قبل خلية شوان محطة وعملياتها (A "نقطة النجمية ، إلى الهيئات محطة خلية شوان). Postsynaptically في ألياف العضلات ، هو بالضبط apposed مجموعة من AChRs النيكوتينيك لفروع العصب terminals وخلايا شوان المحطة.

الشكل 3
الشكل 3. LAL تعامل مع العضلات رطبة - 4 ، وهو خصم mAChR. آراء مبائر التكبير المنخفضة والعالية للعضلات ، LAL تعامل مع السيارة أو 4 رطبة. على النقيض من السيارة العضلات معاملة (A - A NMJs ''')،عديدة في 4 محطات المعالجة رطبة العضلات العصب نقص (B - B'' '، C - C'''). هو أسرع ومحاصر في منطقة في الشكل 2B 2C الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الطريقة المعروضة هنا تصاريح التحقيق في أدوار غير المعترف بها في وقت سابق من mAChR - سلالة معينة يشير في الاستقرار وصيانة NMJs الثدييات. وسوف يكون هذا الأسلوب مفيدا أيضا لاختبار تأثير عوامل عصبية وكلاء الدوائية. على سبيل المثال ، وجدت أن لدينا مختبر الهدبية عامل التغذية العصبية (CNTF) أثارت تنتشر تقريبا من جميع المحطات العصب LAL في الفئران البالغة 1 . هذه النتيجة تتناقض مع الدراسات السابقة من CNTF المعاملة عضلات الأطراف الخلفية ، والتي تنتشر في المعتدلة ذكرت كاليفورنيا. 13-33 ٪ من الألوية وعلى 9 ٪ من التقاطعات الساق الوحشي 3. نحن نعتقد أن التناقض يرجع إلى التعرض لفترات طويلة وأكثر تجانسا من المحطات الطرفية العصبية CNTF في LAL من أطرافهم في العضلات الخلفية. في الواقع ، لاحظنا أننا عندما تطبق CNTF إلى الساق الأمامية الجانبية والعضلات الظنبوبي باستخدام بروتوكول نفسها التي تنتشر على نطاق واسع من أثار NMJs تقريبا كل LAL ، تبرعم ضعيفة فقط من عدد متواضع من NMJs التي كانت تقع بالقرب من مواقع تفضيلي الحقن. على ما يبدو ، قد تعرض لNMJs hindlimb CNTF كان محدودا ومتفاوتا ، كما لوحظ أيضا في دراسة سابقة 2 . من ناحية أخرى ، ضخت CNTF بين النسيج الضام تحت الجلد واللفافة LAL ، ولكن لم تحقن تحت الجلد في العضلات CNTF أطرافه الخلفية ، شكلت المحلية ، وتورم تحت الجلد التي استمرت لمدة ساعة على الأقل قبل استيعاب الأوعية الدموية. ومن الملاحظ أيضا أنه حتى عندما تمت زيادة وتيرة حقن مضادات CNFT mAChR أو لمدة تصل إلى أربع مرات يوميا ، ونحن لم تراع الآثار المضافة لا سيما من الخصوم وCNTF mAChR. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم تنفيذ الإجراء حقن مناسب ، فإنه من غير المحتمل أن أي ضرر قد يحدث في العضلات مباشرة. ومع ذلك ، إذا كان أحد لم تلف العضلات أثناء إجراء الحقن ، محواري تنتشر في محطة عصب أو في العقد ، و / أو العضلات تنكس الألياف ويمكن ملاحظة 1،8. باختصار ، هي عضلات LAL إعداد فريدة من نوعها تسمح موحدة ، والتعرض المطول للجميع NMJs داخل العضلات مع إجراءات سهلة وسريعة نسبيا.

الجزء الضيق من الذيلية في عضلة LAL هو أكثر سمكا (ألياف العضلات السميكة 3-5) الجزء الأوسع من منقاري (2-3 الألياف العضلية سميكة). تبعا لذلك ، غالبا ما تكون مرتبطة NMJs ألياف العضلات وضعه عميقا في LAL الذيلية إما غير المسمى في immunostaining wholemount أو المسمى فقط بنغاروتوكسين - α ، التي تخترق بعمق أكثر من الاجسام المضادة بسبب صغر حجمها وارتفاع صلتها nAChRs. ويمكن أن يساء تفسيرها بأنها NMJs هذه المحطات فقدت العصبية أو خلايا شوان بسبب آثار محددة من الأدوية التطبيقية. ولذلك فمن المهم أن نلاحظ ما إذا كانت هذه هي الملاحظة الوحيدة في تقاطعات LAL الذيلية ، وعما إذا كانت NMJs أو الألياف العضلية وسطحي أو عميق وضعه : ترتبط عادة ألياف العضلات وضعه بشكل سطحي مع خلفية المناعي أعلى بكثير من الألياف وضعه بعمق. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء تجاهل NMJs المتمركزة داخل الشريط عميق الذيلية للLAL من تحليل wholemount.

على الرغم من transection كاملة من الأعصاب LAL من السهل نسبيا ، ويسمح لنا لدراسة الآثار المترتبة على تثبيط mAChR على عضلات مزالة العصب ، وحجم وسهولة الحصول على الأعصاب LAL تحد من أنواع النهج الجراحية التي يمكن التحقيق فيها. على سبيل المثال ، وإلحاق أضرار جزئية العصب LAL من أجل حمل إزالة التعصيب جزئي في عضلة LAL يبدو تقنيا صعبة جدا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة العضلات الضمور ، ورابطة (NS062320).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ketamine Hospira Inc. NDC0409-2051-05 Dose: 120mg/kg
xylazine Lloyd, Inc. LA33806 Dose: 8mg/kg
atropine Sigma-Aldrich A0132 (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg
atropine Voigt Global Distribution AT105 Pharmaceutical grade
Methoctramine Sigma-Aldrich M105 Dose: 100 - 400M
4-DAMP Sigma-Aldrich D142 Dose: 2.5mg/kg
AFDX-116 Tocris Bioscience 1105 250M
AFDX-384 Tocris Bioscience 1345 50M - 500M
MT 7 Peptides International PMT-4340-s 0.1M - 1M
1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 Invitrogen 10010049
Paraformaldehyde Fisher Scientific T353-500 Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4
Sodium pentobarbitol Virbac Animal Health NDC-051311-050-01 Dose: 390mg/kg
Sylgard Dow Corning Part # 184 Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs
0.1M Glycine Sigma-Aldrich G-7126 Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS
2% Bovine serum albumin (2% BSA) Sigma-Aldrich A3059-100g Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS
0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) Sigma-Aldrich T9284-100mL Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS
α-bungarotoxin Invitrogen T1175 Use at concentration of 1:200
SMI-312 Sternberger Monoclonals Inc. SMI312 Use at concentration of 1:1000
SV2 Developmental Studies Hybridoma Bank SV2-Supernatant Use at concentration of 1:10
S100 Dako Z0311 Use at concentration of 1:400
FITC- goat anti-mouse IgG1 Roche Group 03117731001 Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400
Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit Invitrogen A21244 Use at concentration of 1:200
Vectashield fluorescent mounting media Vector Laboratories H-1000 This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish.
Small Spring Scissors Fine Science Tools 15002-08
Dissection forceps Fine Science Tools 11295-51

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
  2. Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
  3. Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
  4. Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
  5. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
  6. Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
  7. Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
  8. Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
  9. Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
  10. Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
  11. Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
  12. Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
  13. Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
تحت الجلد إدارة الخصوم والمسكارينية الثلاثي Immunostaining من إبهام العضلة الرافعة أوريس في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wright, M., Kim, A., Son, Y.More

Wright, M., Kim, A., Son, Y. Subcutaneous Administration of Muscarinic Antagonists and Triple-Immunostaining of the Levator Auris Longus Muscle in Mice. J. Vis. Exp. (55), e3124, doi:10.3791/3124 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter