Summary
Мы описываем процедуры повторных доз ингибиторов мускариновых сигнализации на Лонг поднимающей Auris (LAL) мышцы молодых взрослых мышей и для последующего иммуноокрашивания его нервно-мышечного соединения (NMJs) в wholemounts. LAL мышц имеет уникальные преимущества для выявления
Abstract
Задние мышцы конечностей грызунов, таких как икроножной и передней большеберцовой, которые часто используются для прижизненного фармакологические исследования сигналов необходимо для формирования и поддержания млекопитающих NMJs. Тем не менее, препарат проникновения в эти мышцы после подкожного или внутримышечного введения часто неполные или неодинаковым и многие NMJs может оставаться неизменным. Хотя системное введение с таких устройств, как мини-насосы могут улучшить пространственно-временных эффектов, инвазивный характер такого подхода может вызвать смешанные воспалительные реакции и / или прямой ущерб мышцы. Более того, полный анализ NMJs в мышцу задней конечности является сложной задачей, поскольку требует много времени последовательный секционирования и обширные иммунной окраски.
LAL мыши представляет собой тонкий, плоский лист мышца, расположенная поверхностно на тыльной поверхности шеи. Это быстро сокращающихся мышц, функции, чтобы перемещать ушной раковины. Он содержит ростральной и хвостовой части, которые происходят от средней линии черепа и тянутся по бокам к хрящевой части каждой ушной раковины. Мышцы поставляется ветви лицевого нерва, что проекты, каудально при выходе шилососцевидный отверстия. Мы и другие нашли LAL быть удобной подготовки, что дает преимущества для изучения как краткосрочных, так и долгосрочные в естественных условиях воздействия наркотиков на NMJs и мышц. Во-первых, его поверхностное расположение облегчает несколько локальных приложений наркотиков, находящихся под легкой анестезией. Во-вторых, своей худобой (2-3 слоев мышечных волокон) позволяет визуализации и анализа практически всех NMJs в мышцах. В-третьих, простота рассекает его с ее нетронутыми нервы вместе с образцом его иннервации позволяет дополнительного анализа электрофизиологических в пробирке 9,5. Последнее, возможно, самое главное, малый применяются объема (~ 50 мкл) легко покрывает всю поверхность мышц, обеспечивает равномерную и длительное воздействие всех его NMJs к препарату и устраняет необходимость в системном подходе 1,8.
Protocol
1. Подкожное введение ацетилхолина мускариновых рецепторов (mAChR) антагонисты
- Подготовка в асептических условиях соответствующую дозу mAChR антагонист (см. таблицу) путем растворения препарата в стерильном физиологическом растворе в 1,5 мл трубки реакции. Следующие антагонистов были использованы: атропин, Methoctramine, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, МТ 7.
- Ничья 50 мкл раствора в шприце a1cc инсулина и использовать отдельный шприц для каждой мыши. Также приготовьте шприцами содержащие физиологический раствор только для каждой мыши в контрольной группе. Держите шприц по льду до готовности внедрить.
- Обезболить мышей с кетамином ксилазина коктейль (120 мг / кг кетамина, 8 мг / кг ксилазина) Проверьте соответствующие глубины анестезии, наблюдая отсутствие реакции на ноги крайнем случае.
- После правильной седативный эффект, брить волосы покрытие ростральной области головы до хвостового области шеи, протрите оставшиеся волосы от 70% этанола.
- Наведите под стереомикроскопа и вставить иглу параллельно LAL мышцу в то время как подтягивание слегка на иглу шприца (рис. 1а, б). Это гарантирует, что игла вводится в вышележащих соединительной ткани и непосредственно не повредить LAL мышцы. Вставьте иглу так, чтобы кончик крышки хвостового аспект LAL мышцы.
- Очень медленно начинаю вводить раствор на право LAL мышц при выводе шприц, и общее время инъекции должна быть примерно 1 минуту. Если вводится должным образом, решение должно стать "Купол", что составляет примерно 1 см в диаметре, в вышележащих кожи, которые будут оставаться, по крайней мере один час. Равномерно вводят раствор покроет всю ростральной и хвостовой регионам право LAL мышцы.
- Повторяйте процедуру каждые 12 часов от 1 до 7 дней. Для других studies1, мы использовали тот же протокол для введения факторов роста, каждые 12 часов на срок до 21 дней. Нет ненормальные ответы наблюдались у мышей вводили наркоз 2x в день на срок до 21 дней.
2. Препарирование LAL мышцы
- Усыпить мышей с передозировкой натрия фенобарбитала (390 мг / кг). Смерть обеспечивается оценки отсутствие сердцебиения после торакотомии выполняется.
- Придавить мыши в рассечение блюдо, сверху с 1 штифт в каждой лапе и 1 контактный через нос.
- Сделайте первый разрез через кожу только, используя маленькие ножницы весны до разрезать вдоль левого LAL из региона только проксимальнее ухо к области вокруг левой лопатки.
- Осторожно снимите кожу в этом регионе, но и избежать сокращения слишком близко к правому уху, поскольку это является одной из точек привязки на право LAL мышцы.
- Найдите по центру полосы жировой ткани липидного вдоль средней линии, на поверхностный поверхности головы, где правые и левые мышцы LAL с концами. Использование маленькие ножницы весной, вырезать 1 см справа от жировой ткани (в сторону левого уха) от проксимального края левой LAL мышц до достижения плеча (рис. 1в).
- Как только разрез делается, отогните право LAL мышцы с небольшой пинцет, чтобы разоблачить брюшной стороне мышцы. Trim соединительной ткани и фасции при тщательном подтягивание на право LAL мышц щипцами (рис. 1в).
- Вырезать вокруг хвостовой конец правой LAL у основания уха. Продолжить резки, двигаясь в направлении ростральной конце правым ухом, сохраняя право LAL перевернулся (рис. 1в).. Лучше, чтобы включать больше ткани на этот шаг, чем рискуете повредить сам LAL. Если мышца начинает иссякать, пипетка 1X PBS в течение мышцы.
- Место расчлененный право LAL в 30 мм культуры Sylgard блюдо с 1X PBS, спинной стороной вверх. Придавить четырех углах мышцы с небольшим контактов насекомого.
- Используя небольшие щипцы и ножницы весной, чистая соединительная ткань из спинной и брюшной поверхности правой LAL мышцы. Включите мышцы снова и снова контактный для того, чтобы счистить брюшной поверхности. 2-3 мышцы могут быть размещены в том же 30-мм блюдо.
3. Тройной иммуноокрашивания из LAL NMJs: День 1
- Перед началом иммуноокрашивания, подготовить все необходимые реагенты. 1X PBS, 2% бычьего сывороточного альбумина BSA) / PBS, 0,1 М глицина в 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 в 2% BSA / PBS, и 4% параформальдегида (PFA) в 1X PBS будет необходимо. Предварительное охлаждение метанола в морозильной камере -20 ° C.
- Оставьте LAL мышцы закреплен в сторону спинного блюдо во время этого процесса. Отменить решение 1X PBS и добавьте достаточно 4% (PFA) для покрытия мышцы. Место блюдо на шейкере при скорости набора 2 или 3 в течение 20 минут. Если не указано иное, блюдо должно быть уделено шейкер для следующих шагов.
- Отменить 4% PFA и мыть мышцы с 1X PBS 3 раза, 10 'каждая.
- Отменить последнее 1X PBS вымыть и добавить 0,1 М глицина в 2% BSA / PBS решение для 30 '.
- Отменить 0,1 М глицин решениеD Добавить 1X PBS содержащего родамина сопряженные α-бунгаротоксина в концентрации 1:200 для 15 '.
- Отменить α-бунгаротоксина решение и мыть мышцы в 1X PBS, 3 раза 10 'каждая.
- Permeabilize ткани, добавив предварительно охладить метанол и место блюдо в морозильной камере -20 ° С в течение 5 минут, точно, не качая необходимости.
- Удалить метанола и промыть 3 раза 10 'каждый 1X PBS. Отменить последнее мыть и блок ткани с 0,2% тритона Х-100 в 2% BSA / PBS в течение 1 часа. Мытье и блокирование действия выполняются при комнатной температуре.
- Инкубируйте мышцы за одну ночь, дрожа, при 4 ° С в коктейль из первичных антител разводят в блокирующий раствор (см. таблицу).
4. Тройной иммуноокрашивания из LAL NMJs: День 2
- Вымойте мышцы 1X PBS 3 раза, 10 'каждый при комнатной температуре.
- Добавить коктейль из вторичными антителами в блокировании решения в течение 1 часа при комнатной температуре (см. таблицу). Мышцы должны быть защищены от света от этого шага вперед, чтобы предотвратить фото-отбеливание Alexa Fluor 647-флуоресценции.
- Вымойте мышцы 1X PBS 3 раза, 10 'каждая.
- Очистите все оставшиеся соединительной ткани в 1X PBS, вырезать боковые границы LAL мышцы и смонтировать на слайдах спинной стороной вверх, с использованием стеклянной крышкой-квитанции и монтаж средств массовой информации. Используйте ясный лак для ногтей обеспечить покрытие скольжения на месте.
- Защита слайды от света и хранить при -20 ° С до готовности для анализа.
5. Конфокальной изображений LAL NMJs
- Высокое разрешение конфокальной изображения, полученные с планом Leica Apo 63x нефти цели (1.4NA) на Leica TCS 4D конфокальной микроскопии.
- Флуоресцеина и Alexa 647 сигналов одновременно были отсканированы с лазерных линий 488 нм (аргон, 488 нм, 20 мВт) и 633 нм (гелий-неоновый, 633 нм, 10 мВт), соответственно. Последовательно, родамина сигнал затем сканируется с лазерной линии 561 нм (DPSS, 561, 20 мВт). Оптический разделы были собраны на 0,3 мкм интервалы и количество изображений в г-плоскости колебалась от 60-80. Обскуры настроен на Эйри 1 (107,97 мкм). Формат изображения 1024 x 1024 (X, Y), при этом коэффициент увеличения на 1, на 400 Гц результаты скорости в изображении размером 234,32 мкм и длиной 234,32 мкм и размером пикселя 229,05 нм х 229,05 нм.
- Leica TCS-NT приобретение программного обеспечения затем используется для восстановления Z-серии изображений в максимальной проекции интенсивности.
- Multipanel изображения с учетом яркости и контрастности использованием Adobe Photoshop.
- Для типичного LAL мышцы, надо уметь анализировать примерно 75-100 NMJs фас. Synaptic устойчивость определяется функций, таких как пространственное выравнивание пре-, пери-и постсинаптических элементов (т.е. нерва, Шванн клеток и мышц), а измерения синаптической области (то есть, синапс размера).
Представитель результаты:
На взрослых млекопитающих NMJ, одного аксона двигатель развивает тонкой ветви, которые формируют высоко дифференцированного беседки из нервного окончания (рис. 2, зеленый) по одному волокну мышцы, точно соединенный с постсинаптической кластеров никотиновых АХР (рис. 2, Red) . Perisynaptically, терминал Шванн клетки плотно охватывают все отрасли пресинаптических нервных окончаний (рис. 2, синий). Структурную и функциональную целостность этой трехсторонней организацией сильно возмущенный ежедневного применения подтип-специфических ингибиторов mAChR. В примере, приведенном здесь (рис. 3), 4-DAMP, mAChR антагонист с высоким сродством к M1, M3, M4 и M5 mAChR подтипы, вызывает селективное устранение нервных окончаний от многочисленных NMJs всей мышцы поверхности (рис. 3Б, С). Кроме того, терминал Шванн клетки аномально покоя 8, о чем свидетельствует яркая маркировка S100 без процесса расширения (рис. 3B ", 3C"). Postsynaptically, мышечные волокна являются нормальными и нет потери nAChRs (рис. 3B, 3C ").
Рисунок 1. Анатомическое расположение и организация LAL мышцы. Расположение ростральной (rLAL), хвостовой (Клаль) и LAL нерва (LALn) и соответствующих полос концевой пластинки показаны (А, вставка). Местоположения и ориентации иглы по отношению к LAL мышц показана для инъекций порядок (Б). Разрез точками показаны для вскрытия процедуры (С).
Рисунок 2. Трехсторонней организации NMJ. Высокая увеличение конфокальной вид мыши NMJ. Одного аксона разрабатывает тонкой ветви терминал (), плотно покрыта терминал Шванн клеток и их процессов (', звездочки указывают на терминал органов Шванн клетки). Postsynaptically в мышечное волокно, кластер никотиновых АХР именно соединенный с ветвей нерва TERMIсигналы и терминальные Шванн клеток.
Рисунок 3. LAL мышцы обрабатывают 4-DAMP, mAChR антагонистом. Низкого и высокого увеличения конфокальной видом LAL мышцы получавших транспортного средства или 4-влажный. В отличие от автомобиля обработанной мышце (-'''), многочисленные NMJs в 4-DAMP обработанной мышце отсутствие нервных окончаний (В-В''', С-С'''). Коробках области на рисунке 2B увеличена на рис 2С.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, представленный здесь позволяет исследовать ранее неизвестные роли подтипа конкретных mAChR сигнализации в стабильности и поддержание млекопитающих NMJs. Этот метод также будет полезна для проверки эффектов нейротрофических факторов и фармакологических агентов. Например, наши лаборатории обнаружили, что цилиарный нейротрофический фактор (CNTF) вызвало прорастание почти из всех LAL нервных окончаний у взрослых мышей 1 . Этот результат контрастирует с предварительного исследования CNTF обработанных задних мышц конечностей, в котором сообщалось умеренной прорастания на ок. 13-33% от ягодичной и в 9% от боковых икроножных переходов 3. Мы считаем, расхождение за счет более равномерного и длительного воздействия на нервные окончания в CNTF в LAL, чем в мышцах задних конечностей. Действительно, когда мы обратились к боковым CNTF икроножной и передней большеберцовой мышцы, используя тот же протокол, который вызвал широкое прорастания почти из всех LAL NMJs, мы наблюдали слабую прорастание только из небольшого числа NMJs, которая была преимущественно расположенных вблизи места инъекций. Судя по всему, воздействие NMJs задних конечностей к CNTF были ограничены и неравномерно, что также указывалось в предыдущем исследовании 2 . С другой стороны, CNTF вводят между подкожной соединительной ткани и LAL фасции, но не CNTF вводят подкожно в задних мышц конечностей, формируется местный, подкожный отек, который сохраняется в течение по крайней мере за один час до сосудистой реабсорбции. Следует также отметить, что даже при инъекции частота CNFT или mAChR антагонистов была увеличена до четырех раз в день, мы не наблюдали особенно эффект суммирования CNTF и mAChR антагонистами. Кроме того, если инъекция процедура выполняется соответствующим образом, маловероятно, что какой-либо прямой ущерб мышц будет происходить. Тем не менее, если кто-то повреждение мышцы во время инъекции процедуры аксонального прорастания нерва на терминале или в узлах и / или дегенерации мышечных волокон можно было наблюдать 1,8. Таким образом, LAL мышцы уникальный препарат, который позволяет форме, длительное воздействие всех NMJs в мышцах с относительно простой и быстрый процедур.
Узкой хвостовой части LAL мышцы толстые (3-5 мышечных волокон толстой), чем более широкий ростральной части (2-3 мышечных волокон толщиной). Соответственно, NMJs связаны с мышечными волокнами глубоко расположены в хвостовой LAL часто либо не помечены в wholemount иммунной или маркированы только α-бунгаротоксина, которое проникает глубже, чем антитела, из-за меньшего размера и высоким сродством к nAChRs. Эти NMJs может быть неверно истолкован как потеряв нервных окончаний или Шванн клетки из-за специфических эффектов применяемых лекарств. Поэтому важно отметить, являются ли эти переходы наблюдаются только в хвостовой LAL, и является ли NMJs или мышечные волокна поверхностно или глубоко расположена: поверхностно расположены мышечные волокна, как правило, связано с гораздо более высокой, чем фон иммунофлюоресценции глубоко расположены волокна. Кроме того, можно опустить глубоко позиционируется NMJs в хвостовой полосе LAL из wholemount анализа.
Хотя полная перерезка нервов LAL относительно легко и позволил нам изучить последствия mAChR торможение на денервированных мышцы, размер и доступность LAL нервы ограничить виды хирургических подходов, которые могут быть исследованы. Например, частично повреждения LAL силы, чтобы заставить частичной денервации мышц LAL кажется технически довольно сложной задачей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана мышечной дистрофии ассоциации, NIH (NS062320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ketamine | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd, Inc. | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche Group | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
- Wright, M. C., Son, Y. J. Ciliary neurotrophic factor is not required for terminal sprouting and compensatory reinnervation of neuromuscular synapses: re-evaluation of CNTF null mice. Exp Neurol. 205, 437-448 (2007).
- Gurney, M. E., Yamamoto, H., Kwon, Y. Induction of motor neuron sprouting in vivo by ciliary neurotrophic factor and basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 12, 3241-3247 (1992).
- Caroni, P., Aigner, L., Schneider, C. Intrinsic neuronal determinants locally regulate extrasynaptic and synaptic growth at the adult neuromuscular junction. J Cell Biol. 136, 679-692 (1997).
- Witzemann, V., Brenner, H. R., Sakmann, B. Neural factors regulate AChR subunit mRNAs at rat neuromuscular synapses. J Cell Biol. 114, 125-141 (1991).
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82, 83-88 (1987).
- Lanuza, M. A. Pre- and postsynaptic maturation of the neuromuscular junction during neonatal synapse elimination depends on protein kinase. C. J Neurosci Res. 67, 607-617 (2002).
- Garcia, N., Santafe, M. M., Tomas, M., Lanuza, M. A., Tomas, J. Short-term effects of beta-amyloid25-35 peptide aggregates on transmitter release in neuromuscular synapses. J Neuropathol Exp Neurol. 67, 250-259 (2008).
- Wright, M. C., Cho, W. J., Son, Y. J. Distinct patterns of motor nerve terminal sprouting induced by ciliary neurotrophic factor vs. botulinum toxin. J Comp Neurol. 504, 1-16 (2007).
- Wright, M. C. Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses. J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y1 receptors. J Physiol. 587, 5739-5752 (2009).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscul Disord. 20, 740-743 (2009).
- Dorje, F. Antagonist binding profiles of five cloned human muscarinic receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 256, 727-733 (1991).
- Caulfield, M. P., Birdsall, N. J. International Union of Pharmacology. XVII. Classification of muscarinic acetylcholine receptors. Pharmacol Rev. 50, 279-290 (1998).
