Summary
Se describen los procedimientos para la administración repetida de los inhibidores de la señalización de receptores muscarínicos a la largo del músculo elevador del auris (LAL) del músculo de los ratones adultos jóvenes y de inmunotinción posterior de sus uniones neuromusculares (NMJs) en wholemounts. El músculo LAL tiene ventajas únicas para revelar
Abstract
Los músculos de las extremidades traseras de los roedores, tales como gemelos y el músculo tibial anterior, se utilizan con frecuencia en los estudios farmacológicos in vivo de las señales esenciales para la formación y el mantenimiento de NMJs mamíferos. Sin embargo, la penetración del fármaco en estos músculos después de la administración subcutánea o intramuscular es a menudo incompleta o irregular y muchas NMJs puede quedar afectada. Aunque la administración sistémica con dispositivos tales como mini-bombas se pueden mejorar los efectos espacio-temporales, la naturaleza invasiva de este método puede causar confusión respuestas inflamatorias y / o daño muscular directo. Además, el análisis completo de la NMJs en un músculo extremidades posteriores es un reto porque requiere mucho tiempo de seccionamiento de serie y la inmunotinción extensa.
La LAL del ratón es una hoja delgada y plana de músculo que se encuentra superficialmente en el dorso del cuello. Es un músculo de contracción rápida que funciona para mover el pabellón de la oreja. Que contiene partes rostral y caudal que se originan en la línea media del cráneo y se extienden lateralmente a la porción cartilaginosa de cada pabellón. El músculo está inervado por una rama del nervio facial que los proyectos de caudal a medida que sale del agujero estilomastoideo. Nosotros y otros han encontrado LAL a ser una preparación útil que ofrece ventajas para la investigación de corto y largo plazo los efectos in vivo de las drogas en NMJs y los músculos. En primer lugar, su localización superficial facilita múltiples aplicaciones locales de medicamentos bajo anestesia ligera. En segundo lugar, su delgadez (2-3 capas de las fibras musculares) permite la visualización y el análisis de casi todos los NMJs dentro del músculo. En tercer lugar, la facilidad de disección con su nervio intacto, junto con el patrón de su inervación permite el análisis complementario electrofisiológicos in vitro 9,5. Por último, y quizás lo más importante, una pequeña cantidad aplicada (~ 50μl) fácilmente cubre la superficie del músculo entero, ofrece una exposición uniforme y prolongada de todas sus NMJs a la droga y elimina la necesidad de un enfoque sistémico 1,8.
Protocol
1. La administración subcutánea de receptor de acetilcolina muscarínicos (mAChR) antagonistas
- Preparar en condiciones asépticas, la dosis apropiada de antagonista mAChR, (cf. cuadro) mediante la disolución del fármaco en solución salina fisiológica estéril en el tubo de reacción de 1,5 ml. Los antagonistas se utilizaron los siguientes: atropina, methoctramina, 4-DAMP, AFDX-116, AFDX-384, MT 7.
- Dibuja 50μl de solución en jeringa de insulina a1cc y usar una jeringa para cada ratón. También preparan las jeringas que contienen solución salina fisiológica única para cada ratón en el grupo control. Mantenga las jeringas en el hielo hasta que esté listo para inyectar.
- Anestesiar a los ratones con ketamina-xilazina cóctel (120 mg / kg de ketamina, 8 mg / kg de xilazina) Verifique que la profundidad anestésica adecuada mediante la observación de la falta de respuesta a los pies pellizco.
- Después de la sedación adecuada, afeitarse el vello que cubre la región rostral de la cabeza de la región caudal del cuello, limpie el cabello lejos queda con el 70% de etanol.
- Coloque el cursor bajo microscopio estereoscópico, e inserte la aguja paralela al músculo LAL mientras tira suavemente sobre la aguja de la jeringa (Fig. 1A, B). Esto asegura que la aguja se inserta en el tejido conjuntivo que recubre y no dañan directamente el músculo LAL sí mismo. Insertar la aguja de modo que la punta cubre el aspecto caudal del músculo LAL.
- Muy lentamente comienzan a inyectar la solución sobre el músculo LAL derecho mientras se retira la jeringa, el tiempo total de inyección debe ser de aproximadamente 1 minuto. Si se inyecta correctamente, la solución debe formar una "cúpula" que es más o menos 1 cm de diámetro, en la piel que recubre que permanecerá por lo menos durante una hora. Una solución inyectada uniformemente cubrirá las regiones de todo el rostral y caudal del músculo LAL derecha.
- Repita el procedimiento cada 12 horas durante 1 a 7 días. Para estudios1 otros, se utilizó el mismo protocolo para inyectar factores de crecimiento cada 12 horas durante un máximo de 21 días. No hay respuestas anormales se observaron en ratones administrados con 2 anestesia al día durante un máximo de 21 días.
2. Disección de los músculos LAL
- La eutanasia a los ratones con una sobredosis de pentobarbital sódico (390 mg / kg). La muerte está asegurada mediante la evaluación de la falta de ritmo cardíaco después de toracotomía.
- Precisar el ratón en un plato de la disección, la parte dorsal con un alfiler en cada pata y un pin a través de la nariz.
- Hacer la primera incisión en la piel solamente, con unas tijeras pequeñas para cortar la primavera a lo largo del LAL izquierda de la región proximal a la oreja a la región alrededor del omóplato izquierdo.
- Retire con cuidado la piel en esta región, pero no cortar demasiado cerca de la oreja derecha, ya que es uno de los puntos de fijación para el músculo LAL derecha.
- Localice el tubo de tejido adiposo en posición central de los lípidos en la línea media, en la capa superficial de la cabeza, donde los músculos LAL derecha e izquierda se encuentran. Con la tijera pequeña primavera, corte de 1 cm a la derecha del tejido adiposo (hacia la oreja izquierda) desde el borde proximal del músculo LAL izquierda hasta llegar a los hombros (Fig. 1C).
- Una vez hecha la incisión, pelar el músculo derecho LAL con unas pinzas pequeñas para exponer el lado ventral del músculo. Recorte el tejido conjuntivo y la fascia, mientras que con cuidado tirando hacia arriba del músculo LAL derecha con una pinza (Fig. 1C).
- Corte alrededor de la parte caudal del LAL justo en la base de la oreja. Continuar el corte, moviéndose hacia el extremo rostral de la oreja derecha, manteniendo el derecho LAL entregado (Fig. 1C).. Es mejor incluir mayor cantidad de tejido en este paso que el riesgo de dañar la propia LAL. Si el músculo comienza a secarse, pipeta 1X PBS sobre el músculo.
- Lugar disecados derecho LAL en la cultura de 30 mm plato Sylgard contiene 1X PBS, la parte dorsal hacia arriba. Precisar los rincones del músculo con alfileres pequeño insecto.
- El uso de pinzas y tijeras pequeñas de primavera, el tejido conectivo de limpiar superficies dorsal y ventral del músculo LAL derecha. A su vez más de los músculos y volver a pin con el fin de limpiar la superficie ventral. 03.02 músculos se pueden colocar en el plato de 30mm misma.
3. Triple tinción de NMJs LAL: Día 1
- Antes de inmunotinción principio, preparar todos los reactivos necesarios. 1X PBS, 2% de albúmina sérica bovina BSA) / PBS, 0,1 M de glicina en el 2% BSA / PBS, 0,2% Triton X100 en el 2% BSA / PBS, y el 4% de paraformaldehído (PFA) en 1X PBS serán necesarios. Pre-enfriado de metanol en congelador a -20 ° C.
- Deja músculos LAL clavado en la parte dorsal plato durante este proceso. Deseche 1X solución de PBS y añadir una cantidad suficiente del 4% (PFA) para cubrir el músculo. Plato a cabo el agitador a velocidad 2 o 3 por 20 minutos. A menos que se indique lo contrario, el plato debe ser colocado en un agitador durante los siguientes pasos.
- Desechar 4% PFA y lavar el músculo con 1X PBS 3 veces, 10 'cada uno.
- Deseche última PBS 1X lavar y añadir 0,1 M de glicina en el 2% BSA / PBS solución durante 30 '.
- Descartar una solución de glicina 0,1 M und añadir 1X PBS con rodamina conjugado α-bungarotoxina a una concentración de 1:200 durante 15 '.
- Deseche α-bungarotoxina solución y lave muscular en 1X PBS, 3 veces 10 'cada uno.
- Permeabilizar el tejido mediante la adición de pre-enfriado metanol y colocar la cápsula en el congelador a -20 ° C, precisamente por 5 minutos, no es necesario agitarlo.
- Eliminar el metanol y lavar 3 veces 10 'cada uno con PBS 1X. Deseche el último lavado y el tejido bloque con 0,2% Triton X-100 en el 2% BSA / PBS durante 1 hora. Las etapas de lavado y el bloqueo se realiza a temperatura ambiente.
- Incubar los músculos durante la noche, temblando, a 4 ° C en un cóctel de anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo (véase el cuadro).
4. Triple tinción de NMJs LAL: Día 2
- Lavar los músculos en 1X PBS 3 veces, 10 'cada uno a temperatura ambiente.
- Añadir un cóctel de anticuerpos secundarios en solución de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente (cf. cuadro). Los músculos deben estar protegidos de la luz a partir de este paso para evitar que la foto-blanqueo de Alexa-Fluor 647 fluorescencia.
- Lavar los músculos en 1X PBS 3 veces, 10 'cada uno.
- Limpie cualquier resto de tejido conectivo en 1X PBS, corte los bordes laterales de los músculos de la LAL y montaje de diapositivas cara dorsal, utilizando vidrio cubreobjetos y medios de montaje. El uso de esmalte de uñas transparente para asegurar cubreobjetos en su lugar.
- Proteger a las diapositivas de la luz y almacenar a -20 ° C hasta que esté listo para su análisis.
5. Imagen confocal de NMJs LAL
- Imágenes de alta resolución confocal se obtienen con un plan de objetivos Leica Apo aceite de 63X (1.4NA) en un microscopio confocal Leica TCS 4D.
- Fluoresceína y las señales de Alexa 647 fueron escaneados de forma simultánea con las líneas de láser de 488 nm (argón, 488 nm, 20 mW) y 633 nm (He-Ne, 633 nm, 10 mW), respectivamente. Secuencial, la señal de rodamina se escanea con la línea de láser 561 nm (DPSS, 561, 20 mW). Secciones ópticas se recogieron en 0,3 intervalos de micras, y el número de imágenes en el plano z varió de 60-80. El agujero se ajusta a una Airy (107,97 um). El formato de imagen 1024 x 1024 (X, Y), con un factor de zoom de 1, en los resultados de velocidad de 400 Hz en un tamaño de imagen de 234,32 m x 234,32 m y tamaño de píxel de 229,05 x 229,05 nm nm.
- Leica TCS-NT adquisición de software se utiliza para reconstruir la serie Z de las imágenes en proyecciones de máxima intensidad.
- Multipanel imágenes se ajustan el brillo y contraste usando Adobe Photoshop.
- Para que un músculo LAL típico, uno debe ser capaz de analizar aproximadamente 75-100 NMJs face. Estabilidad sináptica está determinada por características como la alineación espacial de pre, peri y post-sinápticas elementos (es decir, los nervios, las células de Schwann y el músculo), y las mediciones del área sináptica (es decir, el tamaño de la sinapsis).
Los resultados representativos:
En la UNM mamífero adulto, un solo axón motor desarrolla ramas finas que forman glorietas muy diferenciados de una terminación nerviosa (Fig. 2, verde) en una sola fibra muscular, precisamente, adosados a grupos postsináptica de AChR nicotínico (Fig. 2; Rojo) . Perisynaptically, terminal de las células de Schwann tape bien todas las ramas de los terminales nerviosos presinápticos (Fig. 2, azul). La integridad estructural y funcional de esta organización tripartita está muy perturbado por la aplicación diaria de inhibidores específicos de los subtipos mAChR. En el ejemplo que aquí se presenta (Fig. 3), 4-DAMP, un antagonista mAChR con alta afinidad por la M1, M3, M4 y M5 subtipos mAChR, evoca la eliminación selectiva de los terminales nerviosos de NMJs numerosos a lo largo de la superficie del músculo (Fig. 3B, C). Además, la terminal de las células de Schwann son anormalmente reposo 8 como lo demuestra brillante etiquetado S100 sin extensión del proceso (Fig. 3B ", 3C"). Postsináptico, las fibras musculares son normales y no hay pérdida de nAChR (Fig. 3B, 3C).
Figura 1. Localización anatómica y la organización del músculo LAL. Ubicación de rostral (rLAL), caudal (CLAL), y el nervio LAL (LALn) y las bandas correspondientes placa terminal se muestran (A, recuadro). La ubicación y orientación de la aguja con respecto al músculo LAL se muestra para el procedimiento de inyección (B). Puntos de incisión se muestran para el procedimiento de disección (C).
Figura 2. Organización tripartita de la UNM. Gran aumento vistas confocal de un ratón MNJ. Un solo axón elabora finas ramas terminales (A), bien cubierto por el terminal de células de Schwann y sus procesos (A, punto terminal de asteriscos a los órganos de la célula de Schwann). Postsináptico en la fibra muscular, un grupo de AChR nicotínico es, precisamente, adosados a las ramas terminales del nervionales y las células de Schwann del terminal.
Figura 3. Músculos LAL tratados con 4-DAMP, un antagonista mAChR. Puntos de vista confocal de alta y baja magnificación de los músculos LAL tratados con vehículo o con 4-DAMP. En contraste con el músculo tratado con vehículo (A-A NMJs'''), numerosos en los terminales de los músculos 4-DAMP tratados con nervio falta (B-B''', C-C'''). Un área del recuadro en la Figura 2B se amplía en la figura 2C.
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Discussion
El método aquí presentado permite la investigación de los roles previamente no reconocido de los subtipos específicos mAChR de señalización en la estabilidad y el mantenimiento de NMJs mamíferos. Este método también será útil para probar los efectos de los factores neurotróficos y agentes farmacológicos. Por ejemplo, nuestro laboratorio encontró que el factor neurotrófico ciliar (CNTF) provocó brotes de casi todas las terminales nerviosas en ratones adultos LAL 1 . Este resultado contrasta con estudios previos de CNTF tratados con los músculos de las extremidades posteriores, que informó de brotes moderados de CA. 13-33% de los glúteos y el 9% de las uniones laterales gemelos 3. Creemos que la discrepancia se debía a la exposición más uniforme y prolongada de los terminales nerviosos de CNTF en LAL que en los músculos de las extremidades posteriores. De hecho, cuando se aplicó a la CNTF gastrocnemio lateral y tibial anterior músculos utilizando el mismo protocolo que provocó brotes generalizados de casi todos los NMJs LAL, se observó germinación débil de sólo un modesto número de NMJs que se encuentra preferentemente cerca de los lugares de inyección. Al parecer, la exposición de las extremidades inferiores NMJs de CNTF había sido limitado y desigual, como se señala en un estudio previo 2 . Por otro lado, CNTF inyectado entre el tejido conectivo subcutáneo y la fascia LAL, pero no CNTF inyecta por vía subcutánea en los músculos de las extremidades posteriores, formó una inflamación local, subdérmica que persistió durante al menos una hora antes de la reabsorción vascular. También es de notar que aun cuando la frecuencia de las inyecciones de antagonistas CNFT o mAChR se incrementó a un máximo de cuatro veces al día, no se observan efectos aditivos sobre todo de los antagonistas de CNTF y mAChR. Además, si el procedimiento de inyección se lleva a cabo apropiadamente, es poco probable que cualquier daño muscular directo tendría lugar. Sin embargo, si se dañó el músculo durante el procedimiento de inyección, axonal en el nervio terminal o en los nodos, y / o degeneración de las fibras musculares se pudo observar 1,8. En resumen, los músculos LAL son una preparación única que permite una exposición uniforme y prolongada de todas las NMJs dentro de un músculo con procedimientos relativamente fácil y rápido.
La parte más estrecha caudal de un músculo LAL es más grueso (3-5 fibras musculares gruesas) que la porción rostral más amplio (2-3 fibras musculares gruesas). En consecuencia, NMJs asociados con las fibras del músculo profundo situado en caudal LAL a menudo no están bien etiquetados en inmunotinción wholemount o etiquetadas únicamente por α-bungarotoxina, que penetra más profundamente que los anticuerpos, debido a su menor tamaño y de alta afinidad para nAChR. Estos NMJs puede ser malinterpretada como de haber perdido las terminaciones nerviosas o células de Schwann, debido a los efectos específicos de los medicamentos aplicados. Por tanto, es importante tener en cuenta si estas uniones sólo se observan en el caudal LAL, y si el NMJs o las fibras musculares son superficial o profundamente posición: posición superficialmente las fibras musculares se asocian generalmente con inmunofluorescencia de fondo mucho mayor que las fibras muy posicionado. Alternativamente, se puede omitir NMJs profundamente situado en la franja de caudal de la LAL del análisis wholemount.
A pesar de la transección completa de los nervios LAL es relativamente fácil y nos permitió estudiar los efectos de la inhibición mAChR en músculos denervados, el tamaño y la accesibilidad de los nervios LAL limitar los tipos de procedimientos quirúrgicos que pueden ser investigados. Por ejemplo, parcialmente dañar los nervios LAL con el fin de inducir la denervación parcial de un músculo LAL parece técnicamente muy difícil.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Asociación de Distrofia Muscular, el NIH (NS062320).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ketamine | Hospira Inc. | NDC0409-2051-05 | Dose: 120mg/kg |
| xylazine | Lloyd, Inc. | LA33806 | Dose: 8mg/kg |
| atropine | Sigma-Aldrich | A0132 | (>98% purity); Dose: 0.2mg/kg — 20mg/kg |
| atropine | Voigt Global Distribution | AT105 | Pharmaceutical grade |
| Methoctramine | Sigma-Aldrich | M105 | Dose: 100 - 400M |
| 4-DAMP | Sigma-Aldrich | D142 | Dose: 2.5mg/kg |
| AFDX-116 | Tocris Bioscience | 1105 | 250M |
| AFDX-384 | Tocris Bioscience | 1345 | 50M - 500M |
| MT 7 | Peptides International | PMT-4340-s | 0.1M - 1M |
| 1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Invitrogen | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Make 10% solution first by dissolving 10g/100mL de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4 |
| Sodium pentobarbitol | Virbac Animal Health | NDC-051311-050-01 | Dose: 390mg/kg |
| Sylgard | Dow Corning | Part # 184 | Follow instructions that come with kit, can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs |
| 0.1M Glycine | Sigma-Aldrich | G-7126 | Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS |
| 2% Bovine serum albumin (2% BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100g | Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS |
| 0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer) | Sigma-Aldrich | T9284-100mL | Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS |
| α-bungarotoxin | Invitrogen | T1175 | Use at concentration of 1:200 |
| SMI-312 | Sternberger Monoclonals Inc. | SMI312 | Use at concentration of 1:1000 |
| SV2 | Developmental Studies Hybridoma Bank | SV2-Supernatant | Use at concentration of 1:10 |
| S100 | Dako | Z0311 | Use at concentration of 1:400 |
| FITC- goat anti-mouse IgG1 | Roche Group | 03117731001 | Use at concentration of 1:200, but if background is high, try 1:400 |
| Alexa-Fluor 647 conjugated goat anti-rabbit | Invitrogen | A21244 | Use at concentration of 1:200 |
| Vectashield fluorescent mounting media | Vector Laboratories | H-1000 | This is not a hard-set media, you will need to secure the cover slip with clear nail polish. |
| Small Spring Scissors | Fine Science Tools | 15002-08 | |
| Dissection forceps | Fine Science Tools | 11295-51 |
References
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