Summary
Protocol
1. Микроскоп настройки и подготовки изображений
- Наши изображения созданы состоит из Leica MZ16 флуоресцентного стереомикроскопа с быстрым затвором и охлаждением ПЗС-камера управляется программой Метаморф.
- Подготовка термостатом грелку и настроить выход до 32,5 ° С для поддержания температуры тела животного во время и после операции.
- Теплый стерильной раствор Рингера или искусственных спинномозговой жидкости (ACSF) до 32,5 ° C заранее для орошения спинного мозга во время операции.
- Обезболить животное с внутрибрюшинного введения ксилазина (8 мг / кг) и кетамина (120 мг / кг) коктейль.
- Бритье верхней части спины с небольшими кусачками животных и распространение одной маленькой капле лосьон для волос удаление над бритой области с хлопком тампоны. Через несколько минут, снимите применяется лосьон с использованием 70% этилового спирта пропитанные губки марлю.
2. Ламинэктомия и хирургическое воздействие на задний корешок L5
- Место животное на нагревают (32,5 ° С), блокнот и дезинфекции кожи с 70% этанола, пропитанные тампоны.
- Под яркого освещения поля на стереомикроскопа, выполните средней линии разрез (2 - и 3-см) в коже спины. При необходимости можно использовать хлопковые тампоны, чтобы остановить кровотечение.
- Отражение спинной мускулатуры раскрыть основные поясничных позвонков.
- Expose L3-S1 сегментов спинного от правосторонней геми-ламинэктомии с использованием малых rongeurs. Частичное ламинэктомии подвергая 4-6 сегментов поясничного и крестцового спинного мозга создается путем удаления право спинной части L5 позвонков на уровне гребня подвздошной кости тазобедренного сустава (расположение L5 DRG) рострально для L2 позвонков (2 позвонков хвостового до последнего ребра). Заливать полость раствором теплой стерильной Рингера.
- Позиция животное на поддержку подушке (прокат хлопковой марле), чтобы сгладить позвоночника. Используйте опровержение крючки расширить область отображения.
- В этот момент (примерно 30 минут после первой инъекции ф анестезии, дополнения (0,5) следует вводить подкожно, чтобы держать животное полностью под наркозом. Кроме того, газ анестезией (2-4% изофлуран в кислороде 0.5L/min ) может быть использован для повторного обезболивания во время съемки сессии более чем на 1 час.
3. Ризотомия / Спинной раздавить корень
- Переключение в режим возбуждения флуоресценции для визуализации YFP помечены (+) аксонов.
- Использование кончик Sub-Q (26ga.) иглы, выполнить небольшой разрез в твердой мозговой оболочки вышележащих задний корешок L5 (DR). Неоднократно заливать раствором Рингера и чистой осторожно ватой тампоны.
- Определить места, где будет раздавлен и вставить одну сторону штраф пинцет (Дюмон # 5) subdurally.
- Закрыть пинцетом осторожно, но твердо, держа медиальной части L5 болеть за 10 секунд, а затем аккуратно освободить щипцами.
- Вымойте неоднократно с физиологическим раствором и чистой осторожно ватой тампоны.
4. Приобретение изображений и послеоперационных процедур
- Получить несколько изображений всего пострадавшего района в том числе сайт сокрушить и DREZ до и сразу после раздавить при низких и высоких увеличениях.
- Изображения приобретаются либо в качестве одного снимки или несколько потоков от 10 до 20 фреймов в пределах 30 - 40-мс время экспозиции. В фокусе изображения потом выбрали, и обзор монтаж создан позже с помощью Photoshop.
- Чтобы свести к минимуму образование рубцов, плотно применять кусок тонкой синтетической мембраны матрицы (Biobrane), а затем искусственные оболочки, в верхней части подвергаются спинного мозга. Будьте уверены, чтобы разрезать фрагменты, чтобы соответствовать именно в подвергается спинного окна кабель так, что они являются приверженцами спинного мозга.
- Закрыть мускулатуры стерильным 5-0 швов и близких средней линии разрез раны клипов.
- Inject раствор Рингера (0,3 до 0,5 мл подкожно) и администрирования Бупренорфин как послеоперационного обезболивания (0,05 мг / кг) подкожно каждые 12 ч в течение 2 дней.
- Держите животное на грелку (34 ° -35 ° C), пока не восстановлены.
5. Повторные изображений
- Анестезию животного и удалить клипы раны и швы.
- Удалить искусственные оболочки и тонкие синтетические мембраны патчи матрицы и держать их в стерильную пробирку с раствором Рингера для дальнейшего использования.
- Осторожно удалите все накопленные шрам соединительной ткани с загнутым кончиком из Sub-Q и тонкой иглой щипцами. Заливать часто с раствором теплой Рингера.
- Повторно выставить операционного поля, в том числе сайт сокрушить и DREZ, переместите YFP + аксонов отображаемого на предыдущих сессиях, и повторите процедуры, описанные в разделе 4.
6. Представитель результаты:
Мы заметили, что, в то время как они не восстанавливаются после перерезки травмы, почти все аксоны YFP + вырос через сайттравмы на 3 дня после раздавить (рис. 1) 11. Как правило, на следующий день после разрушать, мы наблюдали умирают обратной дегенерации аксонов проксимальной культи и фрагментации / дегенерации аксонов же дистальнее измельчить, который подтвердил, что аксоны были надлежащим поврежден (например, на рисунке 1, 3-й день и 5) . Несколько дополнительных критериев, которые применяются к однозначно отличать регенерирующие аксоны из аксонов, которые были спасены или еще не оправилась от травмы. К ним относятся следующие: (1) регенерирующие аксоны показать расширение не-люминесцентные часть YFP + аксон на сокрушить сайт из-за проксимальных и дистальных дегенерации (в отличие от сужения немеченого разрыв в связи с люминесцентными цитоплазме заправки раздавить сайта если аксоны пережили травмы), (2) регенерирующие аксоны намного тоньше, менее яркие флуоресцентные, и больше, чем волнистые аксонов, которые пережили травму, (3) регенерирующим нейритов тоньше и более тускло, чем флуоресцентные вырождается флуоресцентные фрагменты аксонов, через которые они расширили; (4) в отличие от выживания или пощадил аксонов, регенерирующие аксоны останавливаться на DREZ; и (5) в отличие от выживания или пощадил аксонов, регенерирующие аксоны не проявляют перехватами Ранвье. На рисунке 1 показаны четыре поверхностных YFP + аксоны сразу после раздавить (A1; цветные стрелки). Через три дня после измельчить, все четыре аксонов расширить одного аксонов, которая растет через раздавить сайта (А2). Через пять дней после измельчить, невриты остаются стабильными, и нет дополнительного роста от этих или других проксимальных аксонов (A3).
Регенерирующим нейритов, которые пересекли раздавить сайт удлиненные через гораздо толще и ярче флуоресцентного фрагменты вырождается аксонов (т.е. endoneurial трубки), и прибыть в DREZ уже через 4 дня после раздавить (около 3 мм / 2 дня) 11. Повторная съемка этих аксонов и их советы каждые два-три дня в течение еще двух недель (рис. 2) показали, что они не росли вперед или отказаться, но оставался неподвижным. Единственное заметное изменение отек советы и валов некоторых аксонов. Эти наблюдения таким образом продемонстрировать удивительно быстро и хронической иммобилизации регенерирующие аксоны на DREZ.
Рисунок 1: Повторная съемка L5 DR + YFP аксонов в месте спинной раздавить корень в течение 5 дней. Медиальной части L5 корень был разгромлен (красная стрелка) и отображается на 0-й, 3 и 5 после давки. Области раздавить усиливается в правой панели (А1-А3).
Рисунок 2:. Повторная съемка аксонов прибыл в DREZ в течение 20 дней после L5 раздавить корень 4-й день, три аксонов (цветные стрелки) прибыл в DREZ. Кончики этих аксонов остаются в том же месте и имеют похожий внешний вид на последующих сессиях изображений на 7, 9, 13, 15 и 20. Позиции кончика аксона относительно других советов аксонов и достопримечательностей (звездочки) были использованы для определения аксон моторики между изображениями сессий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изображений DR регенерации непосредственно в живых мышей является особенно сложным, поскольку он требует существенных спинного ламинэктомии для контроля роста аксонов на большой площади следуют несколько инвазивных хирургических и обезболивающие процедуры в последующих сессиях изображений. Несколько стратегий помогли преодолеть эти проблемы. Во-первых, успешное изображений требуется снижение смертности мышей (около 25%), сводя к минимуму продолжительность анестезии и кровотечения, а также тщательный послеоперационный уход. Смертность также была снижена с помощью параметров, которые позволяют быстро скорость камеры для быстрого приобретения нескольких изображений без интубации или дыхательных перерыва. Предотвращение накопления шрам на открытых шнуром также имеет важное значение. Эти коллагеновые рубцы быстро развиваться между изображениями сессий и форму тонкого, но непрозрачного слоя на поверхности твердой мозговой оболочки. Удаление утомительно, продлевает изображение сессии и риски повреждения сосудистой и аксонов. Эффективной стратегией для удаления рубца было применить тонкую мембрану матрицу, которая плотно придерживался подвергается мозга и вызванных рубцами накопить на мембране, а не на твердой мозговой оболочки. Из-за потенциала для смешанных эффектов, связанных с артефактами от хирургических процедур и photoxicity, мы провели обширные контрольные эксперименты, в которых мы рассмотрели аксонального профили у мышей без повторяющихся изображений или хирургического вмешательства.
Протоколы используют широкопольных микроскопии с настройками, которые позволяют быструю скорость камеры и захвата изображений, без интубации или дыхательных перерыва. Мы приобретаем несколько изображений поверхностных аксонов, а затем выбрать лучшие изображения с наименьшими искажениями из-за дыхательные движения. Этот метод обеспечивает недостаточным пространственным разрешением, однако, хотя он позволяет легко идентификации и отслеживания поверхностно расположены аксоны DR на большой площади: это было невозможно иметь совокупность нескольких аксонов сосредоточены в каждой сессии изображений, или для получения четких изображений из нескольких Аксон советов одновременно и неоднократно каждый раз.
Для облегчения идентификации же аксонов в повторных сеансов с изображениями, можно рассмотреть возможность использования флуоресцентных микросфер бисером (1 мкм, Invitrogen), чтобы создать более "ориентиры", в дополнение к внутренней них (то есть, уникальных ветвящиеся структуры кровеносных сосудов и смежных аксонов) . Даже если рост советы чрезвычайно динамичный и быстро менять форму, можно выделить их родительских вала аксона, которая остается неизменной периферического.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Алан Тесслер для комментариев и редакционных помощь. Эта работа была поддержана NIH NS062320.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd, Inc. | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira Inc. | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional Products | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co. | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | BD Biosciences | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon Inc. | K-580 | |
| Wound clips | Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments, Inc. | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices | ||
| Photoshop | Adobe |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
