Summary
Bir
Abstract
Spinal kök yaralanmalar yaralandı primer duyusal aksonlar, kronik ağrı ve kalıcı duyu kaybı, omurilik içine yeniden başarısız olur. Omuriliğe dorsal kök (DR) akson Rejenerasyon dorsal kök giriş bölgesi (DREZ), merkezi sinir sistemi ve PNS arasındaki arayüzü önlenmiş olur. DREZ az rejenerasyon önlemek için moleküler ve hücresel olayların anlayışımız, sinir hasarı ile ilişkili karmaşık değişiklikler, postmortem analizleri sonucuna çünkü kısmen eksik. Akson rejenerasyonu gibi dinamik hücresel süreçleri, en iyi gerçek-zamanlı olarak olaylar her canlı hayvanın çoklu gözlem yakalama teknikleri ile çalıştı. Bizim seri nöronlar in vivo monitör yeteneği, optik ve fare transgenik devrimci yenilikler dramatik nedeniyle artmıştır . Thy1-GFP transgenik farelerin birkaç satır, nöron altkümelerini genetik olarak farklı floresan renkler etiketli olduğu, bireysel nöronlar in vivo 1 imaged izin verecek. Bu fareler, kas, 2-4 ve 5-7 beyin in vivo görüntüleme için yaygın olarak kullanılan ve statik analizler çözülmesi olamayacağını fizyolojik mekanizmaları yeni bakış açıları sağlamıştır . Ancak son zamanlarda yaşayan omurilik nöron görüntüleme çalışmaları başladı. Lichtman ve arkadaşları ilk kez geniş alan mikroskobu 8,9 ile yaralı dorsal kolon (DC) aksonlar takip ederek kendi fizibilite gösterdi. Multi-foton, derin yerleştirilmiş DC akson in vivo görüntüleme mikroglia ve kan damarlarının 10 başarılı olmuştur. Son birkaç yıl içinde, biz geniş alan mikroskobu ve thy1-YFP farelerin Y hattı kullanılarak DR akson rejenerasyonu izlemek için in vivo görüntüleme uygulanmasında öncülük etmiştir. Bu çalışmalar 11 omurilik içinde DR aksonlar rejenere engellenir neden hakkında bir roman hipotez için bize yol açmıştır.
Thy1-YFP farelerin Y doğrultusunda, farklı YFP + aksonlar yüzeysel birkaç aksonlar eş zamanlı olarak takip edilmesine olanak sağlamaktadır konumlandırılmış. Biz DREZ gelen DR aksonlar daha iyi servikal spinal kord daha lomber imaged olduğunu öğrendim. Bu raporda biz yenileyici DR akson başarılı uzun süreli ve tekrarlanan görüntüleme sağlamak için yararlı bulduk çeşitli stratejiler açıklanmaktadır. Bunlar tekrarlanan entübasyon ve solunum kesintisi ortadan kaldırmak yöntemleri, cerrahi ile ilişkili stres ve skar oluşumu en aza indirmek ve fototoksisite olmadan istikrarlı yüksek çözünürlükte görüntüler elde edin.
Protocol
1. Mikroskop kurmak ve görüntüleme hazırlık
- Bizim görüntüleme, bir hızlı çekim ve soğutmalı CCD kamera Metamorph yazılımı tarafından kontrol edilen bir Leica MZ16 floresan stereomikroskopta oluşur ayarlayın.
- Termostatik kontrollü bir ısıtma yastığı hazırlayın ve 32,5 ° C, hayvanın vücut ısısını korumak için sırasında ve cerrahi sonrası çıkış ayarlayabilirsiniz.
- 32,5 ° C, ameliyat sırasında omurilik sulama için önceden Sıcak steril Ringer solüsyonu veya yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF).
- Ksilizin (8 mg / kg) ve ketamin (120 mg / kg) kokteyl intraperitoneal enjeksiyonu ile hayvan anestezisi.
- Küçük hayvan kesme makineleri ile üst sırt Tıraş ve pamuklu çubuklar, traş alana epilasyon losyonu küçük bir damla yayıldı. Dakikalar sonra,% 70 etanol batırılmış gazlı bez sünger kullanılarak uygulanan losyon çıkarın.
2. Laminektomi ve L5 dorsal kök cerrahi maruz kalma
- Isıtmalı (32,5 ° C) ped hayvan koyun ve% 70 etanol batırılmış çubuklar ile cilt dezenfekte edin.
- Arka cilt stereomikroskopta parlak alan aydınlatma altında, orta hat insizyonu (3 cm 2) gerçekleştirin. Gerekirse, kanamayı durdurmak için pamuklu çubuklar kullanın.
- Altta yatan bel omurları ortaya çıkarmak için omurilik kas yansıtmaktadır.
- Sağ taraflı hemi-laminektomi küçük rongeurs kullanarak L3-S1 spinal segmentler Açığa. L2 vertebra (2 rostrally kalça iliak düzeyinde L5 vertebra sağ dorsal kısmı (L5 DRG yeri) çıkarırken, lomber ve sakral spinal kord 4-6 segmentleri açığa kısmi laminektomi tarafından oluşturulan son kaburga vertebra kaudal). Ilık steril Ringer solüsyonu ile kavite serpmek.
- Vertebral kolon düzleştirmek için bir destek yastığı (rulo pamuk gazlı bez) hayvan yerleştirin. Maruz alanını genişletmek için geri çekme kancaları kullanın.
- Alternatif olarak, bu noktada (ilk ip anestezik enjeksiyon sonrası yaklaşık 30 dakika, hayvan tam anestezi tutmak için bir ek (0.5x) subkutan enjekte edilmelidir. Gaz anestezi (% 2-4 izofluran 0.5L/MIN oksijen ) 1 saatten daha uzun görüntüleme oturumları sırasında tekrarlanan anesthetization için kullanılabilir.
3. Rizotomi / Dorsal kök ezmek
- YFP aksonlar (+) etiketli görselleştirmek için floresans uyarma geçin.
- Alt-Q (26ga.) iğne ucu kullanarak, dura L5 dorsal kök (DR) üzerinde küçük bir kesi yaparlar. Ringer çözeltisi ile tekrar tekrar serpmek ve pamuklu çubuklar ile nazikçe temizleyin.
- Ezilmiş olmak site belirleyin ve subdurally bir tarafında ince bir pens eklemek (Dumont # 5).
- 10 saniye için L5 kök medial kısmını elinde forseps yavaşça ama sıkıca kapatın ve forseps yavaşça bırakın.
- Fizyolojik çözeltisi ile tekrar tekrar yıkayın ve pamuklu çubuklar ile nazikçe temizleyin.
4. Görüntü edinimi ve post-op prosedürleri
- Hem de düşük ve yüksek büyütme ezmek sonra önce sağ ve ezilme sitesi ve DREZ da dahil olmak üzere tüm açık alan birden fazla görüntü elde edin.
- Görüntüler tek bir anlık görüntü veya 30 gün içinde alınan 10 ila 20 kare birden fazla akarsu olarak elde edilen 40-ms maruz kalma süresi. Odak görüntüler daha sonra seçilir ve genel bir montaj daha sonra Photoshop kullanarak oluşturulur.
- Skar oluşumu en aza indirmek için, sıkıca maruz omuriliğin üstünde, ince sentetik matris membran (Biobrane) bir parçası, yapay dura uygulamak. Omuriliğe yapışık böylece maruz omurilik penceresi tam uyacak şekilde parça kesmek için emin olun.
- Steril 5-0 sütür ile kas kapatın ve yara klipler ile orta hat kesi yakın.
- Ringer solüsyonu (0.3-0.5-ml subkutan) enjekte edilir, postoperatif analjezi (0.05 mg / kg) 2 gün süreyle subkutan olarak her 12 saat gibi Buprenorfin yönetmek.
- Bir ısıtma yastığı (34 ° -35 ° C) düzelene kadar hayvan tutun.
5. Tekrarlanan görüntüleme
- Hayvanın anestezi ve yara klipleri ve dikişlerle çıkarın.
- Yapay dura ve ince sentetik matris membran yamaları çıkarın ve daha sonra yeniden kullanmak için Ringer çözeltisi içeren steril bir tüp içinde saklayın.
- Sub-Q iğne ve ince forseps kıvrık ucu ile birikmiş bağ dokusu skar yavaşça çıkarın. Sıcak Ringer solüsyonu ile sık sık serpmek.
- Ezmek sitesi ve DREZ dahil olmak üzere, ameliyat alanını yeniden ortaya çıkarmak, daha önceki oturumlarda görüntülü YFP + aksonlar taşınmaya ve Bölüm 4 anlatılan işlemleri tekrarlayın.
6. Temsilcisi sonuçları:
Biz bir transection yaralanma sonrası yeniden etmedi ise, hemen hemen tüm YFP + aksonlar site üzerinden büyüdü3 gün sonra ezilme yaralanması (Şekil 1) 11. Tipik olarak, ezilme sonraki gün, proksimal güdük aksonlar ve aksonlar uygun hasarlı olduğunu doğruladı ezmek için distal aynı aksonlar, parçalanma / dejenerasyon ölüyor geri dejenerasyon görülmektedir (örneğin, Şekil 1, 3 ve 5 Gün) . Birçok ek kriterler, net bir şekilde ayrılan veya yaralanma kurtarıldı aksonlar rejenere aksonları ayırt etmek için uygulanır. Bunlar aşağıdakiler dahil: (1) yenileyici aksonlar YFP floresan olmayan kısmını bir genişleme + proksimal ve distal dejenerasyon (ezilme sitesi dolumu floresan sitoplazma nedeniyle etiketsiz boşluğu daralması kontrast nedeniyle ezilme sitesi akson gösteriyor (2) aksonlar yaralanma) hayatta; yenileyici aksonlar, daha az parlak, floresan, ve yaralanma hayatta aksonlar daha dalgalı çok ince (3) yenileyici neurites ince ve akson dejenere floresan parçalarının daha loş floresan üzerinden (4) aksonlar hayatta kalan veya ayrılan aksine, yenileyici aksonlar DREZ durdurmak; genişletilmiş ve (5) aksonlar hayatta kalan veya ayrılan aksine, yenileyici aksonlar Ranvier düğümleri sergilemek yoktur. Şekil 1, ezilme sonra hemen dört yüzeysel YFP + aksonlar (renkli oklar A1) gösterir. Üç gün ezmek sonra, dört aksonlar ezmek sitesi (A2) ile büyüyen tek bir neurite uzanır. Beş gün sonra ezilme, neurites stabil kalır ve bu veya başka bir proksimal aksonlar (A3) herhangi ek bir büyüme var.
Yozlaşan bir akson (yani, endoneurial tüpler) daha kalın ve parlak floresan parçalarının üzerinden uzun ezmek sitesi geçti ve yenileyici neurites ezmek (yaklaşık 2 3mm / gün) sonra 4 gün gibi erken DREZ az 11 varmak. Bu aksonlar ve ipuçları iki hafta daha (Şekil 2) için her iki ya da üç gün tekrarlanan görüntüleme ileri büyümeye veya geri çekilmiyor yaptığı ortaya, ama hareketsiz kaldı. Sadece gözle görülür bir değişiklik, bazı akson ipuçları ve miller şişme oldu. Bu gözlemler, bu nedenle şaşırtıcı derecede hızlı ve kronik immobilizasyon DREZ yenileyici aksonlar göstermektedir.
Şekil 1: 5 gün boyunca, dorsal kök ezmek yerinde L5 DR YFP + aksonlar tekrarlanan görüntüleme . L5 kök medial kısmı ezilmiş (kırmızı ok ucu) ve günlük 0, 3, ve sonra 5 ezmek görüntülendi. Çarpıldı alanı sağ panelleri (A1-A3) büyütülmüş.
Şekil 2: akson Tekrarlanan görüntüleme DREZ L5 kök ezmek sonra 20 gün içinde geldi Gün 4, üç aksonlar (renkli oklar) DREZ geldi. Bu akson ipuçları aynı yerde kalır ve Gün 7, 9, 13, 15, ve 20 sonraki görüntüleme oturumlarda benzer bir görünüme sahip. Diğer akson ipuçları ve simgesel (yıldız) göreli bir akson ucu Pozisyonlar görüntüleme oturumları arasında akson motilite belirlemek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doğrudan yaşayan fareler Görüntüleme DR rejenerasyon özellikle sonraki görüntüleme oturumlarda birden fazla invaziv cerrahi ve anestezi prosedürleri takip geniş bir alana akson büyümesini izlemek için önemli bir dorsal laminektomi gerektirdiğinden zordur. Çeşitli stratejiler, bu zorlukların üstesinden gelmek için yardımcı oldu. İlk olarak, başarılı bir görüntüleme, anestezi ve kanama süresini en aza indirmek fare mortalite (yaklaşık% 25) azaltılması gereklidir ve titiz post-op bakım. Ölüm, entübasyon veya solunum kesinti olmadan hızlı bir şekilde birden fazla görüntü elde etmek için hızlı bir fotoğraf makinesi hız izin ayarlarını kullanarak da azalmıştır. Maruz kablosunun üzerine yara birikiminin önlenmesi de çok önemlidir. Bu kollajen izleri görüntüleme oturumları arasında hızla gelişir ve dura yüzeyinde opak ancak ince bir tabaka oluşturur. Kaldırma, sıkıcı bir görüntü oturumda uzatır ve damarsal ve aksonlar hasar riskleri. Yara izi kaldırma için etkili bir strateji maruz kablosunu sıkıca yapıştırılır ve izleri membran yerine dura birikmesine neden olduğu ince bir matris zar uygulamak oldu. Cerrahi işlemler ve photoxicity eserler nedeniyle karıştırıcı etkileri potansiyeli nedeniyle, tekrarlayan görüntüleme veya cerrahi olmayan farelerde aksonal profilleri incelendiğinde kapsamlı kontrol deneyleri gerçekleştirdi.
Protokolleri entübasyon veya solunum kesinti olmadan, hızlı kamera hız ve görüntü elde etme izin ayarları ile widefield mikroskopi kullanmaktadır. Biz yüzeysel aksonlar birden fazla görüntü kazanmak ve daha sonra solunum hareketleri nedeniyle en az bozulma ile en iyi görüntüyü seçmek. Bu yöntem, ancak yüzeysel olarak geniş bir alana yerleştirilmiş DR aksonlar kolay tanımlama ve izleme izin rağmen yetersiz uzaysal çözünürlüğü sağlar: Her görüntüleme oturumda odaklı birden fazla akson bütünüyle imkansız, ya da birkaç net görüntüler elde etmek için aynı anda ve art arda akson uçları her zaman.
Yinelenen görüntüleme oturumlarda aynı aksonlar belirlenmesini kolaylaştırmak için, bir içsel olanlara ek olarak (örneğin, kan damarları ve komşu aksonlar benzersiz dallanma desen), daha 'simge' oluşturmak için (1 mikrona kadar, Invitrogen) floresan Microsphere boncuklar kullanarak düşünebilirsiniz . Hızlı büyüme ipuçları bile son derece dinamik ve şekil değiştiriyor, bir periferik değişmeden kalır ebeveyn akson mili, bunları tanımlamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Dr Alan Tessler yorum ve editoryal yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü, NS062320 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H line thy1-YFP (2-4 months old, either sex) | Jackson Laboratory | 003782 | |
| Xylazine (AnaSed injection, sterile solution) | Lloyd, Inc. | 4811 | 8 mg/kg |
| Ketamine (Ketamine hydrochloride injection, USP) | Hospira Inc. | 2051 | 120 mg/kg |
| Buprenorphine (Buprenex injectable) (0.05 mg/kg) | Reckitt Benckiser | 7571 | |
| Small animal hair clippers | Oster Professional Products | 76059-030 | |
| Hair removal lotion | Church & Dwight Co. | NAIR with Baby Oil | |
| Gauze sponges | Fisher Scientific | 22-362-173 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific | 14-960-3Q | |
| 1 mL syringes | BD Biosciences | 309602 | |
| Subcutaneous (Sub-Q) needles, 26ga. | BD Biosciences | 305115 | |
| Spring scissors and forceps | Fine Science Tools | ||
| 2.5-mm curved rongeurs | Fine Science Tools | 16221-14 | |
| Lactated Ringer’s Injection USP | B. Braun Medical | BBR-L7502 | |
| Sterile saline solution | APP Pharmaceuticals | 918610 | |
| Thin synthetic matrix membrane (Biobrane) | Bertek Pharmaceuticals | 62794-096-251 | |
| Artificial dura | Gore Preclude MVP Dura Substitute, W.L. Gore and Associates | 1MVP40 | |
| 5-0 silk sutures | Ethicon Inc. | K-580 | |
| Wound clips | Perfect - Ets Bruneau, (Burnea, France) | A75 | |
| Fluorescent stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16 | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA-Rx2 | |
| Temperature Controller | World Precision Instruments, Inc. | ATC 1000 | |
| Metamorph software | Molecular Devices | ||
| Photoshop | Adobe |
References
- Feng, G. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Watching the neuromuscular junction. J Neurocytol. 32, 767-775 (2003).
- Bishop, D. L., Misgeld, T., Walsh, M. K., Gan, W. B., Lichtman, J. W. Axon branch removal at developing synapses by axosome shedding. Neuron. 44, 651-661 (2004).
- Balice-Gordon, R. J., Lichtman, J. W. in vivo visualization of the growth of pre- and postsynaptic elements of neuromuscular junctions in the mouse. J Neurosci. 10, 894-908 (1990).
- Trachtenberg, J. T. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Dev Neurobiol. 68, 771-778 (2008).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. in vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Misgeld, T., Nikic, I., Kerschensteiner, M. in vivo imaging of single axons in the mouse spinal cord. Nat Protoc. 2, 263-268 (2007).
- Davalos, D. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Maio, D. D. i in vivo imaging of dorsal root regeneration: Rapid immobilization and presynaptic differentiation at the CNS/PNS border. Journal of Neuroscience. 31, 4569-4582 (2011).
