Summary
Ici, nous décrivons les méthodes détaillées direct imagerie cellulaire pour enquêter sur le chimiotactisme. Nous présentons la fluorescence des méthodes microscopiques pour surveiller la dynamique spatio-temporelle des événements de signalisation dans les cellules en migration. Mesure des événements de signalisation nous permet de mieux comprendre comment un réseau de signalisation GPCR réalise gradient de détection et de contrôle des chimiotactiques migration directionnelle des cellules eucaryotes.
Abstract
Beaucoup de cellules eucaryotes peuvent détecter des gradients de signaux chimiques dans leur environnement et de migrer en conséquence 1. Cette migration cellulaire guidée est mentionné que le chimiotactisme, qui est essentiel pour différentes cellules pour mener à bien leurs fonctions telles que le trafic des cellules immunitaires et la structuration des cellules neuronales 2, 3. Une grande famille de G-récepteurs couplés aux protéines (RCPG) détecte la variable de petits peptides, connu sous le nom de chimiokines, de diriger la migration cellulaire in vivo 4. L'objectif final de chimiotactisme de recherche est de comprendre comment un gradient de chimiokine GPCR machines et des commandes de signalisation sens des événements menant à la chimiotaxie. À cette fin, nous utilisons des techniques d'imagerie pour suivre, en temps réel, les concentrations spatio-temporelle des mouvements chimiotactiques cellulaire, dans un gradient de chimiotactique, GPCR activation médiée par des protéines G hétérotrimériques, et les signaux intracellulaires impliqués dans le chimiotactisme des cellules eucaryotes 5-8 . L'organisme simple eucaryotes, Dictyostelium discoideum, affiche des comportements chemotaxic qui sont similaires à celles des leucocytes, et D. discoideum est un système modèle pour l'étude des principaux chimiotactisme eucaryotes. Comme amibes libres, D. discoideum cellules se divisent en milieu riche. Après la famine, les cellules entrer dans un programme de développement global dans lequel elles par le biais de l'AMPc à médiation chimiotactisme pour former des structures multicullular. De nombreux composants impliqués dans le chimiotactisme au camp ont été identifiés dans D. discoideum. La liaison de l'AMPc à un GPCR (CAR1) induit la dissociation des protéines G hétérotrimériques dans Gγ et 7 sous-unités Gßy, 9, 10. Sous-unités Gßy activer Ras, qui active à son tour la PI3K, la conversion PIP PIP 2 en 3 sur la membrane cellulaire de 11 à 13. PIP 3 servent de sites de liaison pour des protéines ayant une homologie avec pleckstrine (PH) domaines, recrutant ainsi ces protéines à la membrane 14, 15. L'activation des récepteurs CAR1 contrôle également les associations de la membrane de PTEN, qui déphosphoryle PIP PIP 3 à 2 16, 17. Les mécanismes moléculaires sont évolutivement conservées dans des chimiokines GPCR médiée par le chimiotactisme des cellules humaines telles que les neutrophiles 18. Nous présentons des méthodes suivantes pour étudier le chimiotactisme des D. cellules discoideum. 1. Préparation des cellules composant chimiotactiques. 2. Imagerie chimiotactisme des cellules dans un gradient d'AMPc. 3. Surveillance d'une activation induite des RCPG G hétérotrimériques protéines dans des cellules vivantes simples. 4. Imagerie chimioattractive déclenché PIP dynamique 3 réponses simples cellules vivantes en temps réel. Nos méthodes d'imagerie développée peut être appliquée à l'étude du chimiotactisme des leucocytes humains.
Protocol
1. Préparation du chimiotactisme des cellules compétentes de Dictyostelium discoideum
- Pour générer des cellules D. discoideum qui sont chimiotactiques au camp chimiotactique, la récolte des cellules de plus en plus D3-t rich media à partir d'une culture en agitant à 22 ° C.
- Laver les cellules deux fois en mémoire tampon non nutritifs développement (buffer DB contenant 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, MgCl2 2 mM, 0,1 mM CaCl et 2).
- Re-suspendre les cellules dans un tampon de DB à une densité de 2x10 7 cellules / ml.
- Agiter 10 ml de cellules dans un flacon de 250 ml à 100 rpm à 22 ° C pendant une heure.
- Livrer 100 ul de 7,5 uM AMPc stocks aux 10 cellules par ml toutes les six minutes de plus de 6 heures pour obtenir une concentration finale de 75 nM d'AMPc, un processus désigné comme le traitement de l'AMPc pulsation. Après 5-6 heures de traitement pulsation AMPc, D. cellules discoideum deviennent compétents chimiotactiques envers gradient d'AMPc.
- Recueillir les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min puis remettre les cellules avec le tampon DB contenant 2,5 mM de caféine, et secouer à 200 rpm à 22 ° C pendant 20 min à basolate cellule à une situation chimiotactiques.
2. Imagerie cellules chemotaxing dans un gradient chimiotactique visible et manipulable
- Remblai d'une micropipette avec un fraîchement préparés solution à 30 pi de 1 uM AMPc et Alexa 594 au 0.1μg/μl dans le tampon de la DB.
- Fixez le Femtotip à un titulaire de micropipette et raccorder le tuyau à un appareil d'alimentation de pression, Eppendorf FemtoJet système.
- Fixez l'ensemble micropipette pour un micromanipulateur (Eppendorf TransferMan NK2) motorisé micromanipulateur pour fournir une pression constante en vue d'établir un gradient stable.
- Monter une chambre d'un bien LabTek rempli de 6 ml de tampon DB sur une lentille d'huile 40X sur un microscope confocal et l'utilisation brillante optique de champ, le centre Femtotip dans le champ de vision.
- Allumez l'alimentation de pression et régler la pression de compensation (PC) pour 70 hPa pour établir un gradient de l'AMPc / Alexa 594 mélange.
- Visualisez gradient d'AMPc par la surveillance du mélange de concentration souhaitée de l'AMPc et Alexa 594 fluorescence à l'aide d'excitation avec une ligne de 543 nm du laser.
- Utiliser l'auto-positionnement en fonction de la micromanipulateur pour mettre micropipette pour les positions souhaitées et de les définir comme la position 1, position 2, 3 et position de manipuler le gradient à laquelle la cellule sont exposés.
3. Immobile système cellulaire non polarisé facilite des événements de signalisation impliquées dans l'imagerie de l'AMPc gradient de détection
- Après le traitement de caféine, enlever une partie aliquote de cellules et centrifuger à 500 g pendant 3 min.
- Retirer du tampon et de diluer les cellules à 5x10 5 cellules / ml avec le tampon DB frais contenant 2,5 mM de caféine.
- Appliquer 1 ml de suspension cellulaire à une chambre simple bien ou 0,4 ml dans chaque puits d'une chambre de quatre puits.
- Laisser les cellules adhèrent pendant 10 min, soigneusement la pipette hors du tampon pour enlever les cellules seules et remplacer par le même volume.
- Repérez les cellules sous le microscope désirée et commencer l'imagerie.
- Pour une expérience conçue pour surveiller la dynamique de la signalisation dans les cellules composantes exposer à un gradient constant, de traiter les cellules avec 5,0 uM (concentration finale) Latrunculin B pendant 10 min avant les expériences.
4. Simultanée hétérotrimériques surveillance protéine G activation et la production PIP 3
- AMPc pulsation développer des cellules co-exprimant GαCFP et YFPGβ (cellules G) et des cellules exprimant le PIP 3 Indicateur PH-GFP (cellules PH) 7.
- Mélanger ces deux types de cellules avec un rapport 1:1 et plaque eux dans les chambres d'un bien ou 4-même.
- Créez et enregistrez des émissions de référence d'empreintes digitales courbe de CFP, YFP et la GFP en utilisant le mode d'acquisition Lambda Stack dans la gamme spectrale de 464 à 624 nm avec une largeur de 10 nm.
- Simultanément activation de la protéine G d'image dans les cellules G et 3 PIP production dans des cellules en utilisant PH avec mode Lambda Acquisition même pile dans la gamme spectrale de 464 à 544 nm avec un incrément de 10 nm.
- Appliquer la fonction linéaire de Déconvolution Zeiss 510META logiciels utilisant sauvé CFPand YFP et les empreintes digitales d'émission pour calculer mathématiquement la contribution de chaque fluorophore dans la pile lambda de se séparer de la PCP et de l'intensité YFP dans les canaux individuels dans G.
- Avec la même stratégie, appliquer la fonction linéaire Déconvolution utilisant la GFP et les empreintes digitales enregistrées des émissions de fond pour calculer mathématiquement l'intensité de GFP dans les cellules PH.
5. Les résultats représentatifs:
- Un excellent modèle de D. discoideum pour chimiotactisme GPCR médiation. Une amibe sociale, D. discoideum présente un chimiotactisme frappante durant le cycle de vie. En raison de ses avantages génétiques et biochimiques, D. D fournit une puissante système d'étudier le chimiotactisme.
- Chimiotactisme des cellules sous un champs visible et manipulable chemoattract. Ici, nous montrons d'abord une méthode simple pour obtenir une relation linéaire entre la concentration d'AMPc et l'intensité d'un colorant fluorescent Alexa 594 par une série de dilution de 2 uM AMPc mélangé avec 10 ug / ml Alexa 594 (figure 2A). Ensuite, nous offrent un moyen facile de visualiser la pente, en outre, d'établir une mesure quantitative de la concentration d'AMPc d'un gradient de l'intensité des Alexa 594 (fig. Fig. 2B).
- Motilité cellulaire est découplée de la polarisation cellulaire et la détection directionnelle. Un inhibiteur polymérisation de l'actine élimine pré-existantes de polarité morphologique et empêche également le mouvement des cellules tout en préservant la capacité des cellules de détection directionnel (figure 3A). Emploi de la stimulation de l'AMPc visible et manipulable garantit l'entrée, par exemple des stimulations appliquées uniformément ou avec un dégradé. Cette méthode permet une analyse quantitative de l'AMPc induite par la redistribution des principaux composants de signalisation dans les machines de détection de gradient. Mesuré dynamique spatio-temporelle de ces composants de signalisation nous permettent de comprendre comment le réseau de signalisation réalise l'adaptation aux stimulations uniforme tout en générant des réponses biochimiques polarisée aux gradients (figure 3B).
- Mesures systémiques de la cinétique des chemosensing réseau de signalisation à l'exposition à un gradient constant. Il est essentiel de mesurer la dynamique / cinétique de la signalisation directionnelle de détection de composantes de comprendre comment chaque élément contribue à l'établissement de la polarisation intracellulaire lorsque les cellules d'expérience du premier gradient. Application de l'imagerie de cellules vivantes avec un tempo-spatiale haute résolution, nous montrons d'abord une biphasique PIP3 production de cellule qui est exposée à un gradient d'AMPc stable (Fig. 4A-C). Application imagerie des cellules vivantes, nous avons systématiquement mesuré dynamique de direction à détection de réseau de signalisation spécifiques de la stimulation de la production d'AMPc d'PIP3 (Fig. 4D, E).
- Contrôle de l'activation simultanée des protéines G hétérotrimériques et PIP 3 lors de la stimulation de production d'AMPc appliquées uniformément. Förster énergie de résonance de transfert (en abrégé FRET) fournit une approche efficace pour contrôler l'activation des protéines G hétérotrimériques (dissociation) lors de la stimulation de l'AMPc. Ici, nous avons décrit une pratique et facile d'adopter le système pour une mesure simultanée de l'activation des protéines G hétérotrimériques et PIP 3 Production en surveillant le FRET changement et translocation membranaire de PIP 3 sonde, PH-GFP dans les cellules G et PH, respectivement (Fig. 5 ). Une stimulation de l'AMPc appliquée uniformément déclenche une activation de la protéine G persistante tout ce qui déclenche un PIP transitoires de production 3.
Figure 1: un excellent modèle de D. discoideum de la chimiotaxie médiée GPCR. A. Schéma montre une voie de signalisation de détection brève directionnelle. B. AMPc induit le chimiotactisme gradient rapide de D. cellules discoideum. Cellules expriment PIP 3 sonde, PH-GFP (Green). Dégradé (rouge) est visualisée par Alexa 594. Barre d'échelle = 50 microns.
Figure 2: chimiotactisme des cellules sous un champs visible et manipulable chemoattract. A. Le graphique montre une relation linéaire entre la concentration d'AMPc et l'intensité d'un colorant fluorescent Alexa 594 par une série de dilution de 2 uM AMPc mélangé avec 10 ug / ml Alexa 594. B. La mesure quantitative de la concentration d'AMPc d'un gradient par la relation linéaire de la concentration de l'AMPc et l'intensité des colorant fluorescent Alexa 594 dans A.
Figure 3: la motilité cellulaire est découplée de la polarisation cellulaire et la détection directionnelle. A. Image montre que les cellules immobile par le traitement de l'inhibiteur de la polymérisation de l'actine Latrunculin B maintenir la capacité de détection directionnel. Cellules expriment PIP 3 sonde, PH-GFP (Green). Dégradé (rouge) est visualisée par Alexa 594. B. AMPc cellulaire manipulable système de stimulation et immobile permet de répondre aux questions clés de la détection directionnelle. Barre d'échelle = 10 microns.
Figure 4: mesures systémiques de la cinétique des chemosensing réseau de signalisation à l'exposition à un gradient constant. A. Montage montre un PIP biphasique de production 3 (verte) de la cellule qui est exposée à un gradient d'AMPc constante (rouge). B. image montre les régions d'intérêt (ROI) pour la mesure de la cinétique de PIP 3 de production présentées dans C. C . Kinetics oPIP F 3 la production dans les cellules exposées à un gradient constant. D. schéma montre le réseau de signalisation de détection directionnelle de la stimulation de l'AMPc à la PIP 3 de la production. Leur cinétique après exposition à un gradient d'équilibre est présenté dans les lignes de même couleur solide dans E.
Figure 5: simultanée de surveillance multi-événements des réseaux de signalisation des RCPG. Schéma A. montre la mesure simultanée de l'activation des protéines G hétérotrimériques et PIP 3 Production en surveillant le FRET changement et la translocation membranaire des PIP3 sonde, PH-GFP dans les cellules G et PH, respectivement. B. Montage d'images d'arc-en-G et les cellules PH montre qu'une stimulation de l'AMPc appliquée uniformément déclenche une activation de la protéine G persistante à la cellule périphérique, tout ce qui déclenche une passagère PIP3 production. Les points de temps sont avant (0s) et après stimulation par 4.9s, 10.2s et 20.4s. C. Cinétique de l'activation des protéines G et PIP3 production sur une stimulation de l'AMPc appliquées uniformément.
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Discussion
Le processus d'atteindre l'étape chimiotactiques compétentes des cellules
Pour type sauvage D. cellules discoideum, il faut environ 5 ~ 6 heures pulsation de développement à la température ambiante pour les inciter à une étape bien chimiotactiques compétents au cours de laquelle les cellules présentent une morphologie bien polarisée cellulaire et la migration cellulaire rapide (Fig. 1). Plusieurs facteurs, tels que la concentration d'AMPc d'impulsions, de la température, et différents fonds génétiques, peuvent affecter le processus d'atteindre l'étape chimiotactiques compétente. Un guide de gradient d'AMPc des cellules à se déplacer vers la source du camp, une migration cellulaire dirigée désigné comme le chimiotactisme. Cependant, les cellules qui n'ont pas atteint le stade chimiotactiques compétents en raison du développement insuffisant ou de leur fond génétique peut ne pas apparaître deux caractéristiques typiques: morphologie polarisée et le mouvement rapide des cellules. D'autre part, les cellules qui ont dépassé le stade chimiotactiques compétents en raison de sur-développement forment souvent des amas de cellules, qui sont très difficiles à séparer dans des cellules individuelles pour des expériences d'imagerie ..
1. Imagerie cellules chemotaxing dans un gradient chimiotactique visible et manipulable
Il s'agit d'une avance technique à appliquer marqué par fluorescence et à la stimulation chimiotactique manipulable dans un système expérimental. Historiquement, nous avions appliqué une stimulation appliquée de manière homogène (aussi appelée stimulation uniforme) ou la stimulation de gradient pour observer la morphologie cellulaire et les comportements. Toutefois, une «aveugle» de stimulation montre aucune information tempo-spatiale sur la façon dont les stimuli atteint les cellules, jette donc un doute sur toute «anormale» des observations des réponses cellulaires. Ici, nous montrons une application de colorant fluorescent (Alexa594, Molecular Probe) avec chimiotactique pour établir une relation linéaire entre la concentration de l'agent chimiotactique et l'intensité de la journée fluorescentes surveillées et (Fig. 2A, B). Une combinaison d'acquisition de la protéine fluorescente verte (GFP) et une émission dans le rouge du colorant fluorescent (Alexa594) qui nous permet de surveiller à la fois une stimulation et réponses cellulaires lors de cette stimulation (figure 2C).
Selon l'exigence expérimentale, il ya plus de combinaisons disponibles. Tout en considérant un colorant fluorescent nouvelle, il est essentiel de confirmer la fluorescence est adapté à votre expérience, surtout pour une expérience de gradient, il est important de confirmer la diffusion de co-efficacité de votre stimuli et un colorant fluorescent. Aussi, afin d'obtenir une relation linéaire de la concentration et l'intensité des stimuli de la teinture fluorescente mixtes, il est nécessaire d'acquérir la concentration maximale de stimuli sans saturation d'intensité.
2. Immobile système cellulaire non polarisé facilite imagerie des cellules vivantes
La chimiotaxie est un processus compliqué cellulaires, mais il peut être disséqué en trois aspects fondamentaux: la polarisation cellulaire, la motilité et la détection directionnelle. Morphologiquement, la polarisation de l'une est appelée à un front clairement définies et les principaux extrémité arrière d'une cellule. De nombreux composants de signalisation impliquées dans le chimiotactisme localiser soit dans le fornt ou le retour dans une des cellules polarisées. Directionnel de détection est la capacité d'une cellule de traduire un gradient extracellulaire en une polarisation polarisé biochimiques intracellulaires. Comme le montre la Fig. 3A, le traitement des cellules avec des inhibiteurs de polymérisation de l'actine (Latrunculin B) élimine rapidement la motilité cellulaire et sa polarisation initiale. Étonnamment, les cellules sont encore en mesure d'établir une polarisation intracellulaires, comme une accumulation de PIP 3 à l'avant des cellules face à la pente (représenté par un croissant PIP3biosensor, PH-GFP), indiquant que la détection directionnelle des cellules peuvent être découplé de la polarisation cellulaire et la motilité cellulaire. Ce système de cellules non polarisées nous permet de déterminer la cinétique de la signalisation des composants essentiels pour chemosensing sans la complication de la motilité cellulaire et la polarisation précédente. Pour et contre, le traitement de l'inhibiteur de la polymérisation de l'actine abolit toute la dynamique qui charge sur l'actine du cytosquelette.
3. Réseau de surveillance de la signalisation par le multi-spectrale imagerie des cellules vivantes
Engagement de l'AMPc à son récepteur déclenche l'activation de protéines G hétérotrimériques. Comme une suite, se dissocie sous-unité Gßy de la sous-unité Ga et active des effecteurs en aval pour induire des réponses cellulaires telles que PIP3 production. Les progrès techniques sur le tempo-spatiale résolution de la microscopie fluorescente permettent une imagerie simultanée de plusieurs événements de signalisation au niveau subcellulaire dans les cellules vivantes. Dans cette section, nous montrons d'abord une imagerie simultanée de deux molécules de signalisation le long avec une pente de surveillance de l'AMPc (figure 4A). Ensuite, nous présentons l'imagerie spectrale de l'activation de G et sa réponse cellulaire en aval de la production PIP3 (figure 4B). Försterd'énergie de résonance de transfert (en abrégé FRET), aussi connu comme le transfert d'énergie par résonance de fluorescence, le transfert d'énergie par résonance (RET) ou de transfert d'énergie électronique (EET), est un mécanisme décrivant transfert d'énergie entre deux chromophores. Il ya trois critères pour l'apparition du FRET: chevauchement des émissions de donateurs et d'excitation accepteur, une orientation appropriée, et à courte distance (<10 nm). L'exigence de distance / l'orientation des deux molécules facilite FRET être un moyen efficace pour détecter les interactions protéine-protéine ou un changement de conformation intromolecular d'une protéine. Ici, nous avons utilisé la commune utilisée CFP / YFP paire FRET (Gα-CFP/Gβ-YFP) pour surveiller la dissociation dynamique des protéines G α / βγ sous-unités dans des cellules vivantes. Comme une conception intelligente expérimentale que nous avons décrit ici est de mélanger deux types différents de cellules dans le but de surveiller simultanément deux activation de la protéine G et la production PIP3 quand il n'est pas commode de mesurer toutes les dynamiques dans une cellule.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par le fonds intra-muros du NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D3-T Growth Media | KD Medical | ||
| Caffeine | Sigma-Aldrich | ||
| Latrunculin B | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Alexa 594 | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| cAMP | Sigma-Aldrich | ||
| ChronTrol XT programmable timer | ChronTrol Corp | ||
| Miniplus 3 peristaltic pump | Gilbson | ||
| Platform rotary shaker | |||
| FemtoJet microcapillary pressure supply | Eppendorf | ||
| Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc international | ||
| LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope | Carl Zeiss, Inc. | a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | |
| Olympus X81 or equivalent | Olympus Corporation | Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens |
References
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