Summary
В этой статье описываются поверхности и маркировке
Abstract
Эмбриональные эпителия претерпевают сложные деформации (например, изгиб, кручение, складывающиеся, и растяжения) в форме примитивных органов раннего эмбриона. Отслеживание исходных точек маркеров на поверхности этих сотовых листов устоявшихся метод оценки морфогенетических величины, такие как рост, сокращение, и сдвига. Однако не все методы поверхности маркировка могут быть легко приспособлены к обычным методам обработки изображений и обладают различными преимуществами и ограничениями. Здесь мы рассмотрим два метода маркировки и иллюстрируют полезность каждой техники. В первом методе, сотни флуоресцентных меток применяются одновременно эмбрион с использованием магнитных частиц железа. Эти метки используются затем для количество 2-D деформации ткани при морфогенезе. При втором способе, полистирол микросферы используются в качестве контрастных агентов в неинвазивной оптической когерентной томографии (ОКТ) изображений для отслеживания 3-D деформации ткани. Эти методы были успешнымиLy реализованы в нашей лаборатории, чтобы studythe физических механизмов раннего раз голову, сердце и развитие мозга, и должны быть адаптированы к широкому морфогенетических процессов диапазоне.
Protocol
1. Генеральный экспериментальной подготовки
- Подготовка среды тканевой культуры в ламинарном боксе.
- Развести Средний Дульбеко изменения Орла (DMEM) (1 л бутылка с 4,5 г / л глюкозы, натрия бикарбонат, и L-глютамин). Добавить 10 мл пенициллина / стрептомицина / неомицин антибиотиков.
- Удалить 100 мл DMEM с стерильной пипетки передачи и заменить 100 мл куриного сыворотки.
- Алиготе DMEM/10% куриных сыворотки / 1% антибиотиков в стерильные 15 мл конические пробирки и заморозить.
- Подготовка фосфатным буферным раствором (PBS) с добавлением кальция и магния. Смешайте 100 мл 10х PBS, 900 мл деионизированной воды и 1 мл концентрированного раствора кальция и магния (100 мг / мл CaCl 2 • 2H 2 O, 100мг/мл MgCl 2 • 6H 2 O).
- Инкубировать яйца в продольной ориентации на желаемый этап, как это определено Гамбургер и Гамильтоне 1 (то есть 23-25 часов HH стадии 5, или 42-48 Часов этапах HH 11-12).
- Удалить эмбрионов из яйцеклетки с помощью фильтра методом бумажном носителе.
- Трещина в нижней части яйца на стороне A150 блюдо мм Петри. Потяните за исключением корпуса со дна и пустые содержимое яйца в блюде.
- Удалить толстые, вязкий белок из яйца тупым использованием щипцов.
- Вырезать круги Ватман № 2 фильтровальной бумаги 2-3 см. в диаметре. Использование одного дырокол, пробивки отверстий в середине фильтровальную бумагу. Разместите один из фильтров кольца документ о желток в манере, которая держит эмбрионов видны через центральное отверстие в кольце.
- Вырезать вокруг наружного диаметра фильтровальной бумаги с microscissors. Извлеките бумагу из желтка с мелкими щипцами.
- Аккуратно промойте эмбриона в PBS для удаления частиц приверженцем желток. (HH5 эмбрионов, возможно, придется замочить тех пор, пока 15-20 минут для удаления остаточного желтка). Удалить фильтр в сборе бумаги из ванной и поместить его брюшной стороне в35 мм культуры блюдо. Место второго фильтра кольцо бумаги поверх первого, сэндвич эмбриона между кольцами. Поместите металлическое кольцо вокруг внешней фильтр сэндвич бумаги (≈ 1,5 - 2 см в диаметре), чтобы обеспечить эмбриона.
- Погрузитесь эмбрионов в культуральной среде. Проверьте правильность морфологии и эмбриональной стадии с яркими поле микроскопа.
- Использование съемника пипетку, чтобы подготовить точную кончике иглы стекло (1,5 мм внутренний диаметр) (инструменты Всемирного Precision, Sarasota FL) для последующего вскрытия ткани и маркировки.
2. DII Маркировка НН Этап 5 эмбрионов с использованием магнитных частиц железа
- Добавить несколько капель насыщенного DII в спирте, чтобы небольшое количество порошка железа (железа уменьшается, Mallinckrodt Бейкер, Inc Phillipsburg, Нью-Джерси) при комнатной температуре и дайте высохнуть. (Это обычно вызывает частиц торт вместе когда-то алкоголь не испарится.) Используйте кончик потянул микропипетки разбить слипаются частицы железа,перевести их на микроцентрифужных трубки, и ополосните их несколько раз, и крышка с деионизированной водой.
- Чтобы пометить эктодермального клеток в стадии HH 5 эмбрионов, месте собрано эмбрионов (то есть, весь фильтр в сборе бумаги) спинной стороне в 35 мм культуры блюдо покрыта щедрым слоем питательной среды и поместить блюдо под рассекает микроскопом. Используйте стеклянную иглу для удаления желточной мембраны и подвергать эктодермального клеток. (Будьте осторожны, чтобы не проколоть эмбриона.)
- Нарисуйте колонки меченых частиц железа (в деионизированной воде) в пипетку Пастера. Использование рассекает микроскоп, погрузиться пипетки под поверхности жидкости и положение чуть выше эмбриона. Роллинг пипетка медленно вперед и назад между пальцев, толкаются частиц из pipiette и посыпать их через эмбриона.
- Как только эмбрион покрыт частицами, тщательно поместить его в 37 ° C инкубаторе в течение примерно 10 минут. Возьмите эмбриона из инкубатораD Используйте сильный магнит для удаления частиц.
- Используйте флуоресцентный микроскоп с прикрепленными видеокамерой и соответствующие настройки фильтра приобрести как светлого поля и флуоресцентные изображения эмбриона, как показано на рисунке 2А, Б.
- Обратите внимание на этикетку плотности. Если плотнее распределение желании использовать дополнительные частицы (как описано выше) для обозначения эмбриона снова и продлить время инкубации соответственно. Если метки слишком плотным, добавьте небольшое количество немеченых частиц железа микроцентрифужных трубки, заполненной уже меченых частиц и перемешать содержимое пробирки. Повторите процесс маркировки с нового эмбриона и снова отметить этикетке плотности.
3. Полистирол Микросфера Маркировка для оптической когерентной томографии (ОКТ) Визуализация HH11-12 эмбрионов
- Приготовить раствор из черной 10 мкм в диаметре микросфер (Polysciences Inc, Уоррингтон, штат Пенсильвания) в PBS в 35 мм чашке Петри. (Бисер должен быть достаточно большим для создания контраста для октябряобработки изображений, но достаточно маленький, так, что размер гранул составляет порядка отдельных клеток. Конкретные значения будут варьироваться в зависимости от разрешения вашей системы октября и тканей изучается). Одна капля маточного раствора (2,6% твердых веществ, латекса) на мл PBS, как правило, достаточно. Потяните это решение в 10cc шприц использованием 22 иглы. Vortex решение в течение 30 секунд, чтобы обеспечить равномерное распределение бусинку.
- Конические кончики игл вытащил стекло с помощью компьютера жесткий диск 2. Совет диаметр должен быть достаточно большим, что бисер может поместиться в отверстие, но в то же время, как можно меньше, чтобы минимизировать ткани ранены во время инъекции.
- Заполните скошенной иглой стекло с борта решение с помощью шприца. Слегка Флик микропипетки для того, чтобы решение достигла чаевые.
- Использование микроманипулятора, место стеклом иглу в том же поле зрения, как эмбрион. Бусины должны быть вытекающей из кончика пипетки.
- Если нет BEADS выхода микропипетки, может быть забивают. В этом случае, повторите шаги 3.2-3.4 с новой иглой стекло.
- Если слишком много бисера облака вашего поля зрения, ваши пипетки может быть слишком широким. Повторите шаги 3.2-3.4 с новыми пипетку и новый эмбрион.
- Вставьте кончик пипетки в просвет трубки мозга. Убедитесь, что не пробить вентральной этаже ткани. Вы увидите, переходные отек ткани, бисера и жидкости ввести просвет. Это указывает на успешное интубации, теперь быстро удалить стекло иглой.
- Убедитесь в достаточной плотности в бисер внутренней полости мозга трубки использованием ярких поле микроскопа. Пусть бисером соглашайтесь на 20 - 30 минут, прежде чем перейти к гл. 4.
4. Сбор данных
* Следующие методы хорошо подходят для флуоресценции маркировки, описанной выше. Тем не менее, с техникой маркировки микросфер, бусы могут смещаться при передаче образцовмежду инкубаторов и системы визуализации. В этом случае лучше всего, чтобы перейти к шагу 4.2 (что позволяет избежать образец движения / агитации в целом). В обоих методах, эмбрионы культивируются в то время как погруженный в жидкой питательной среды. Если эмбрион не является полностью погружен в продукт (как в случае с некоторыми обычными методами культуры тканей), ткани геометрия сильно изменены аномально высокое поверхностное натяжение нагрузки и деформации распределения не сможет точно захвата нормального 3-D морфогенеза 3, 4. Более того, погружая ткань препятствует яркий контраст наблюдается при жидкость-газ в течение октября изображений из затемнения эмбриональных морфологии и маркер координаты.
- Эмбрион культуры (общая)
- После получения Вашего первого изображения (светлое поле, флуоресценция, или октябрь), расфасованные в семь 35-мм культуры блюд (с эмбрионами) в 150 мм чашки Петри и место всей сборки в небольшой пластиковый пакет. Добавить пару капель деионизированной воды в сумку для увлажненияи заполнить сумку с 95% О 2 / 5% CO 2 смеси. Место эмбрионов в инкубаторе при температуре 37 ° C (Очередь Stabiletherm, Эшвилл, штат Северная Каролина) для нужного времени до следующего изображения timepoint. Используя этот метод, эксперимент может быть выполнен на нескольких эмбрионов в тот же день.
- Покадровый культуры (автоматизированные)
- Наведите меченых эмбрионов в Блюдо Delta T (35 мм наружный диаметр, 23 мм центральное отверстие с конической боковой стенки, 0.17mm толстого стекла; Bioptechs, Батлер, штат Пенсильвания), содержащие 1,2 мл питательной среды.
- Обложка блюдо с крышкой хранятся при температуре 37 ° С с использованием Bioptechs Delta T4 Контроллер Блюдо культуры (для предотвращения конденсации). Переливать эмбриона с 95% О 2 / 5% CO 2 газовая смесь подается из мини-насос переменного потока устройства (Fisher Scientific). До достижения эмбриона, тепла и увлажнения газов путем пропускания ее через деионизированной воды на теплый (<100 ° C) горячей тарелке. Схема этой экспериментальной ыET-приведена на рисунке 1.
- Настройка программного обеспечения на автоматическое получение изображения в указанное пользователем промежутки времени. Для наших флуоресцентного микроскопа, мы используем Openlab программное обеспечение (PerkinElmer, Waltham, MA), и для нашей системы октября, мы используем прокатилась источник Thorlabs программное обеспечение (Ньютон, штат Нью-Джерси). Так как этот метод является в настоящее время только способен обрабатывать один покадровой эксперимент время, часто лучше, чтобы эти типы культур работать на ночь. Можно было бы обойти это ограничение путем установки автоматизированных переводимые этапе совместим как с аппаратного и программного обеспечения системы визуализации 5.
5. Представитель Результаты:
Этикетки отслеживаются автоматически (с помощью Volocity, PerkinElmer) или вручную (с помощью ручного отслеживания плагин в ImageJ, NIH) в каждом эксперименте. В флуоресцентные маркировки техники, мы используем gridfit Matlab рутины, чтобы соответствовать 2D поверхностей через маркер координат, что позволяет штаммов морфогенетических поверхности рассчитывается 6, 7. Стандартный уравнений, используются для преобразования этих значений в соответствующих эмбриональным системе координат. Кроме того, в октябре техника, поверхности создаются из сегментированных томов изображений (полученных с помощью стандартного программного обеспечения, таких как Matlab или курсора 8) и деформаций может быть рассчитана в сторону максимального или минимального кривизны образца 9.
Мы использовали наш железной частицы техника для маркировки и отслеживания движения клетки эктодермального в голову раз в ранней куриного эмбриона. Как показано на рис 2А, флуоресцентно меченые клетки были распределены по всему эмбриону. Яркие области и флуоресцентные изображения эмбриона были захвачены в различные интервалы во время бывший ово культуры. Движения гусеничных меток (рис. 2, б) затем были использованы для вычисления развиваются морфогенетических штамм распределения в голову раза образования (рис. 2D-F).
т "> Точно так же наши полистирола микросфер техника была использована для отслеживания движений тканей в середине заднего мозга границе раннего мозга цыпленка. Как показано на рисунке 3 BD, бисером движения были прослежены в течение 6 часов и деформации ткани характеризующий деформацию в продольном и окружности направления были рассчитаны на маркер координаты. Обратите внимание, что этот метод способен обрабатывать отчетливо 3-D деформаций как бусинки, как правило, придерживаются все стороны внутренней полости мозга (рис. 3А).
Рисунок 1. Схема установки для покадровой тканевой культуры.
Рисунок 2. Количественная 2-D деформации ткани в раннем куриного эмбриона использованием гусеничных флуоресцентные метки. (А) Объединенные светлого поля / флуоресцентное изображение HH этап 5 эмбрионов после удаления частиц железа. DII-лейблред эктодермального клеток (красные), распределяются по всему эмбриону. (B, C) движение меченых клеток было отследить с помощью ImageJ. Этикетка перемещений были рассчитаны в зародыше координат (X, Y). Обратите внимание, что А и В то же изображение. (DF) Контур участках развивается продольной деформации в процессе распределения голову раза образования. Продольные деформации лагранжевых были рассчитаны по отношению к HH этапе 5 (т. е. А и В) после (D) 75 мин, (E) 120 мин, (F) 165 мин инкубации. Эти штаммы характеризуют изменения длины линии элементов, первоначально ориентированные вдоль оси ординат (в стадии эмбриона 5). Более подробную информацию об использовании гусеничных этикетке координаты для расчета морфогенетических штаммы могут быть найдены в фила и соавт. (2007) 6 и Варнер и соавт. (2010) 7. Заметим, что С и F такие же изображения. Шкала бар = 500 мкм.
Рисунок 3. Количественная 3-D ткани гeformations в начале мозга цыпленка. (А) Полистирол микросферы, которые придерживаются спинной (черная стрелка) и вентральной (белая стрелка) полушарий мозга трубки легко различимы от окружающих тканей в поперечном сечении section.Ventral видом реконструкции октября шоу микросфер городах рядом с середины заднего мозга границе в (В) HH12 и после (C) 6 ч инкубации (M: средний мозг, H: задний мозг). Несколько групп из бисера изложены, чтобы выделить общие деформации ткани. (D) Продольная (E ZZ) и окружной (E θθ) лагранжевы штаммы были рассчитаны на эти деформации. Положительные и отрицательные продольной окружной деформации в середине заднего мозга границы отражают осевое удлинение и окружной сокращение этого региона в культуре. Более подробную информацию о расчете морфогенетических штаммов для сложных поверхностей при морфогенезе можно найти в фила и соавт. (2008) 9. Шкала бар = 200 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Два метода маркировки ткани представлены для бывших ово культуры ранних зародышей цыплят. Первый использует флуоресцентные красители липофильных доставляется через магнитные частицы железа одновременно этикетке сотни клеток. Однако этот метод в настоящее время не совместима с оптической когерентной томографии, а флуоресцентные красители обычно не проявляют большого отличие от окружающих тканей с использованием 10 октября. Таким образом, мы показываем альтернативные технологии с использованием микросфер полистирола для обозначения тканей для покадровой анализ октября Эта техника дает 3-D данных, но необходимо соблюдать осторожность, чтобы не выбить бусы из ткани. Использование одного из этих методов в соответствующих экспериментальных установка должна обеспечивать надежную маркировку тканей и экс ово развитие в ранних зародышей. Оба метода используют легко доступны, относительно недорогих материалов (например, железный порошок, полистирола микросфер) и позволяют ткани деформации должны быть количественно во время морфогенеза.ткани маркеров в обоих случаях может быть легко и воспроизводимо применяется к эмбриональной ткани и не требуют специального оборудования, что делает эти эксперименты доступной для новичков в этой области. Визуализация и анализ полученных данных (например, путем вычисления карты морфогенетических деформации) должно помочь осветить механики морфогенеза в вашей модели системы 6, 7, 9, 11, 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами NIH R01 и R01 GM075200 HL083393 (LAT). Мы признаем, общение поддержку BAF от NIH T90 DA022871 и Mallinckrodt Институт радиологии, так и для ВДВ с 09PRE2060795 гранта от Американской ассоциации сердца.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM — high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments, Inc. | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences, Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
- Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
- Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
- Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
- Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
- Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
- Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
- Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
- Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).
