Summary
Bu makale, yüzey etiketleme ve tanımlar
Abstract
Embriyonik epitel erken embriyo ilkel organları oluşturmak için karmaşık deformasyonlar (örneğin, bükme, kıvırma, katlama, ve germe) tabi tutulurlar. Bu hücresel yaprak yüzeylerde fiducial belirteçleri Takip büyüme, daralma ve kayma gibi morfogenetik miktarlarda tahmin etmek için köklü bir yöntemdir. Ancak, tüm yüzey etiketleme teknikleri, geleneksel görüntüleme yöntemleri kolayca adapte ve farklı avantajları ve sınırlamaları sahip. Burada, iki etiketleme yöntemleri anlatılmakta ve her iki tekniğin yararını göstermektedir. İlk yöntem, yüzlerce floresan etiket, manyetik demir parçacıkları kullanarak embriyonun aynı anda uygulanır. Bu etiketler, daha sonra 2-B doku deformasyonları miktarına morfolojilerinden sırasında kullanılır. İkinci yöntem, polistiren mikroküreler 3-D doku deformasyonları izlemek için non-invaziv optik koherens tomografi (OCT) görüntüleme kontrast ajanlar olarak kullanılmaktadır. Bu teknikler başarılı olmuşturly erken baş kat, kalp ve beyin gelişimi fiziksel mekanizmalar studythe bizim laboratuvarda uygulanan ve geniş bir yelpazede morfogenetik süreçlerine uyarlanabilir olmalıdır.
Protocol
1. Genel Deneysel Hazırlık
- Laminer akış kaputu doku kültür ortamı hazırlayın.
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) (1 4.5g / L glikoz ile L şişe, sodyum bikarbonat ve L-glutamin) seyreltilir. 10 ml penisilin / streptomisin / neomisin antibiyotik ekleyin.
- DMEM, 100 ml, steril bir transfer pipet yardımıyla çıkarın ve civciv serum 100 ml ile değiştirin.
- Kısım steril 15 ml konik şişeleri ve donma içine DMEM/10% civciv serum /% 1 antibiyotikler.
- Fosfat hazırlayın tamponlu salin (PBS), kalsiyum ve magnezyum ile takviye. 100 ml 10X PBS, 900 mL deiyonize su ve konsantre bir kalsiyum ve magnezyum çözüm (100 mg / ml CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/mL MgCl 2 • 6H 2 O), 1 ml karıştırın .
- Hamburger ve Hamilton 1 (yani 23-25 HH aşamada 5 saat veya 42 tarafından tanımlandığı şekliyle istenilen aşamaya uzunlamasına yönde yumurta inkübeHH aşamaları 11-12) -48 saat.
- Filtre kağıdı taşıyıcı yöntemi kullanarak yumurta embriyolar çıkarın.
- Çatlak yumurta alt tarafta A150 mm petri. Alttan kabuk ayrı çekin ve yemeğin içine yumurta içeriğini boşaltmak.
- Künt forseps kullanarak yumurta kalın, viskoz akı çıkarın.
- Whatman # 2 filtre kağıdı 2-3 cm daireler kesin. çapındadır. Filtre kağıdı ortasında tek bir delikli zımba, zımba delikleri kullanma. Halka merkezi deliğinden embriyo görünür tutar bir şekilde sarısı filtre kağıdı halkalardan birini yerleştirin.
- Microscissors ile filtre kağıdı dış çapı yaklaşık kesin. Ince forseps ile yumurta sarısı, kağıt çıkarın.
- PBS içinde embriyo yapışık sarısı parçacıkları çıkarmak için hafifçe yıkayın. (HH5 embriyolar kalan yumurta sarısı kaldırmak için 15-20 dakika gibi uzun emmek için gerekebilir). Banyosundan filtre kağıdı aksamını çıkarın ve bir ventral tarafta yere kadar35 mm kültürü çanak. Halkalar arasında embriyo sandviç ilk tepesinde ikinci bir filtre kağıdı yüzük, yerleştirin. Embriyo güvenliğini sağlamak için filtre kağıdı sandviç (2 cm çapında ≈ 1.5) dışında etrafında bir metal halka koyun.
- Batmak kültür ortamında embriyo. Uygun morfolojisi ve parlak bir alan mikroskobu ile embriyonik aşamada olun.
- Sonraki doku diseksiyonu ve etiketlenmesi için, ince uçlu cam iğneler (1.5 mm iç çapı) (Dünya Hassas Aletler, Sarasota FL) hazırlamak için bir pipet çektirmesi kullanın.
2. Manyetik Demir Parçacıklar kullanarak HH Sahne DII Etiketleme 5 Embriyolar
- Demir tozu oda sıcaklığında küçük bir miktar (demir azalmış, Mallinckrodt Baker, Inc Phillipsburg, NJ) doymuş DII birkaç damla alkol ekleyin ve kurumaya bırakın. (Bu genellikle alkol buharlaştı sonra birlikte pasta parçacıkların neden olur.) Kümesinin demir parçacıkları break up çekti mikropipet ucu kullanınbir mikrosantrifüj tüpe aktarmak ve onları birkaç kez yıkayın ve deiyonize su ile kaplayın.
- HH evre 5 embriyo ektodermal hücreler etiketlemek için, kültür ortamı cömert bir tabaka ile kaplı 35 mm kültür kaplarına (yani, tüm filtre kağıdı montaj) dorsal tarafına hasat edilen embriyo yeri ve diseksiyon mikroskop altında çanak koymak. Vitellin membran kaldırmak ve ektodermal hücreler ortaya çıkarmak için cam bir iğne kullanın. (Delmeyin embriyo dikkat edin.)
- Pasteur pipeti içine etiketli demir partikülleri (deiyonize su) bir sütun çizin. Diseksiyon mikroskobu, batığın embriyo üzerinde sadece sıvı yüzey ve pozisyon altında pipet kullanılması. Yavaş yavaş parmaklarınızın arasında ileri ve geri pipet Rolling pipiette parçacıkların dışarı çekmeye çabalamaktadır ve embriyo üzerinden serpin.
- Embriyo kez dikkatli bir şekilde yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C inkübatör, parçacıklar ile kaplıdır. Bir kuluçka embriyo alınd parçacıklar kaldırmak için güçlü bir mıknatıs kullanın.
- Şekil 2A, B. gösterildiği gibi, parlak alan ve embriyo floresan görüntüler elde etmek için ekli video kamera ve uygun filtre ayarları ile floresan mikroskop kullanın
- Etiket yoğunluğu dikkat edin. Yoğun dağılımı isteniyorsa, yine embriyo etiket ve buna göre kuluçka süresini uzatmak için (yukarıda açıklandığı gibi) ek parçacıkları kullanabilirsiniz. Etiketleri çok yoğun iseniz, zaten etiketli parçacıkları ile dolu mikrosantrifüj tüp etiketsiz demir parçacıkları küçük bir miktar ekleyin ve tüp içeriği karıştırın. Yeni bir embriyo ile etiketleme işlemi tekrarlayın ve etiket yoğunluğu tekrar not edin.
3. HH11-12 embriyoların Optik Koherens Tomografi (OCT) Görüntüleme Polistiren Microsphere Etiketleme
- 35 mm petri PBS içinde siyah 10 mm çap mikroküreler (Polysciences A.Ş., Warrington, PA) bir çözüm hazırlayın. (Boncuk Ekim kontrast üretmek için yeterince büyük olmalıdırgörüntüleme, ama yeterli boncuk boyutu, tek tek hücrelerin sipariş üzerine olduğu gibi küçük. Belirli değerler) OCT sistemi çözünürlüğe bağlı olarak değişir ve dokuların çalışılmaktadır. PBS ml başına stok solüsyonu Bir damla (2.6% katıların-lateks) genellikle yeterlidir. Bu çözüm 22 iğne kullanarak 10cc bir şırıngaya çekin. Vorteksleyin düzgün bir boncuk dağılımını sağlamak için 30 saniye için bir çözüm.
- Konik bir bilgisayarın sabit sürücü 2 kullanılarak çekilmiş cam iğne uçları. İpucu çapı boncuk delikten sığabilecek kadar büyük olmalıdır, ama aynı zamanda, mümkün olduğu kadar küçük enjeksiyon sırasında doku yaralama en aza indirmek için.
- Şırınga kullanarak boncuk çözüm eğimli cam iğne ile doldurun. Çözüm ucu ulaştığını sağlamak için hafifçe mikropipet fiske.
- Bir mikromanipülatör kullanarak, aynı alan içinde embriyo olarak görmek cam iğne yerleştirin. Boncuk pipet ucu dışarı akan olmalıdır.
- Eğer hiçbir beads mikropipet çıkmak, bir yapışmasına neden olabilir. Bu durumda, yeni bir cam iğne ile 3.2-3.4 adımları tekrarlayın.
- Çok sayıda boncuk görüş alanında bulutu, pipet ucu çok geniş olabilir. Yeni bir pipet ve yeni bir embriyo ile 3.2-3.4 adımları tekrarlayın.
- Beyin tüp lümenine pipet ucu takın. Doku ventral katında delmek için emin olun. Boncuklar ve sıvı lümen girerken dokusunun geçici bir şişlik göreceksiniz. Bu başarılı bir entübasyon gösterir; şimdi, hızlı cam iğneyi çıkarın.
- Parlak bir alan mikroskobu kullanarak beyin tüpün iç lümen yeterli bir boncuk yoğunluğu olun. Tarikatı için geçmeden önce 30 dakika - 20 boncuk razı olsun. 4.
4. Veri Toplama
* Aşağıdaki yöntemlerden de yukarıda açıklanan floresan etiketleme tekniği için uygundur. Ancak, örnekleri aktarırken Microsphere etiketleme tekniği ile, boncuk bağdakiinkübatör ve görüntüleme sistemleri arasında. Bu durumda (hareket / ajitasyon tamamen örnek önler) 4.2 adıma geçmek için en iyisidir. Her iki yöntemde de, sıvı kültür ortamında batık ise embriyoların kültürü vardır. Embriyo tamamen sular altında (bazı geleneksel doku kültürü teknikleri ile olduğu gibi) değilse, doku geometri, büyük ölçüde anormal derecede yüksek yüzey gerilimi yükleri ve gerilme dağılımları değişmiş doğru normal 3-D morfolojilerinden 3, 4 yakalamak için başarısız olacaktır . Ayrıca, doku daldırarak embriyonik morfolojisi ve işaretleyici koordinatları obscuring OCT görüntüleme sırasında sıvı-gaz arayüzünde görülen parlak kontrast önler.
- Embriyo Kültürü (genel)
- Yedi 35 mm kültür kaplarına (embriyolar) ilk görüntüler (parlak alan, floresan, ya da Ekim) aldıktan sonra, 150 mm Petri kabında koymak ve küçük bir plastik torba içinde tüm montaj yerleştirin. Nemlendirme için çanta deiyonize su damlaları bir çift ekleçanta ve% 95 O 2 /% 5 CO 2 karışımı ile doldurun. Embriyoların 37 kuvöz içine yerleştirin ° C (Kuyruk sonraki görüntüleme timepoint kadar istenilen zaman Stabiletherm, Asheville, NC). Bu yöntemi kullanarak, deneyler aynı gün içinde birden fazla embriyolar üzerinde olabilir.
- Time-lapse kültür (otomatik)
- 1.2 ml kültür ortamı içeren bir delta T Bulaşık Bioptechs Butler, PA 35 mm dış çapı, konik yan duvar 23 mm merkezi diyafram, 0.17mm kalınlığında cam içine etiketli embriyolar yerleştirin.
- 37 tutulur bir cam kapak ile çanak Kapak ° C Bioptechs Delta T4 Kültür Bulaşık Controller (yoğunlaşma önlemek için). % 95 O 2 / Mini-Pompa Akış cihazı (Fisher Scientific) verilen% 5 CO 2 gaz karışımı embriyo Superfuse. Önce ulaşan embriyo, ısı ve sıcak bir (<100 ° C) sıcak levha deiyonize su ile köpüren bir gaz nemlendirme. Bu deneysel s şematiket-up Şekil 1'de gösterilmiştir.
- Yazılım, kullanıcı tarafından belirlenen zaman aralıklarında otomatik olarak görüntüler elde etmek için ayarlayın. , Bizim floresan mikroskop için, biz openlabın yazılımı (Perkin Elmer, Waltham, MA) kullanın ve bizim OCT sistemi için, biz süpürüldü kaynak Thorlabs yazılımı (Newton, NJ) kullanın. Bu yöntem şu anda sadece bir time-lapse deneyi taşıma kapasitesine sahip olduğundan bir süre, bu tür kültürlerin bir gecede çalışmasına izin vermek için genellikle en iyisidir. Bir görüntüleme sistemi 5 hem de donanım ve yazılım ile uyumlu bir otomatik çevrilebilir sahne yükleyerek bu sınırlama aşmak.
5. Temsilcisi Sonuçlar:
Etiketler her bir deney için otomatik olarak izlenir (Volocity kullanarak, Perkin Elmer) veya manuel (ImageJ Manuel İzleme eklentisi kullanarak, NIH). Floresan etiketleme tekniği, biz sağlayan marker koordinatları ile 2 boyutlu yüzeyler sığdırmak için Matlab rutin gridfit morfogenetik yüzey suşları 6, 7 hesaplanacaktır. Standart denklemler embriyonik ilgili bir koordinat sistemi içine bu değerleri dönüştürmek için kullanılır. Alternatif olarak, OCT tekniği, yüzeyler, bölümlenmiş görüntü birimleri (Matlab veya Caret 8 standart yazılımı ile elde edilen) ve suşları oluşturulur örnek 9 maksimum veya minimum eğrilik yönde hesaplanabilir.
Biz erken civciv embriyo baş kat oluşumu sırasında ektodermal hücrelerin hareket etiket ve takip etmek için demir partikül tekniği kullanılmıştır. Şekil 2A tasvir gibi, floresan ile işaretlenmiş hücreler tüm embriyo genelinde dağıtıldı. Ex ovo kültürü boyunca farklı aralıklarla Parlak alan ve embriyo floresan görüntüler ele geçirildi. Daha sonra paletli etiketler (Şekil 2B, C) hareketleri baş kat oluşumu sırasında gelişen morfogenetik gerilme dağılımları (Şekil 2D-F) hesaplamak için kullanılır.
t "> Benzer şekilde, bizim polistiren Microsphere tekniği erken civciv beynin orta Beyin sınır doku hareketlerini takip etmek için kullanılmıştır. Şekil 3 BD gösterildiği gibi, 6 saat ve suşları için uzunlamasına ve doku deformasyonu karakterize boncuk hareketleri takip edilmiştir dairesel yönde işaretleyici koordinatları hesaplanmıştır. Not boncuk beynin iç lümen (Şekil 3A) tüm tarafların yapışma eğilimi olarak bu yöntem belirgin bir 3-D deformasyonlar taşıma kapasitesine sahip olduğunu.
Şekil 1 set-up time-lapse doku kültürü için şematik.
Şekil 2. 2-B doku deformasyonları miktarının takip floresan etiketleri kullanarak erken civciv embriyo. HH evre 5 embriyo demir parçacıkları çıkarılmasından sonra (A) Birleştirilmiş alanında parlak / fluoresan görüntü. DII-etiketed ektodermal hücreler (kırmızı) tüm embriyo dağılmış. (B, C) etiketli hücreleri hareket ImageJ kullanılarak takip edildi. Etiket değiştirmeler embriyo koordinatları (X, Y) hesaplandı. A ve B aynı görüntü olduğunu unutmayın. (DF) boyuna gerilme dağılımları baş kat oluşumu sırasında gelişen Kontur araziler. Boyuna Lagrange suşları, (D) 75 dk sonra (örneğin, A ve B), (E) 120 dakika ve inkübasyon (F) 165 dk 5. aşamada HH göreceli hesaplanan edildi. Bu suşlar, Y-ekseni boyunca başlangıçta odaklı bir çizgi elemanları uzunluğu değişiklikler (evre 5 embriyo) karakterize eder. Filas ve arkadaşları (2007) 6 ve Varner ve ark (2010) 7 morfogenetik suşlar takip etiketi kullanarak hesaplamak için koordinatları hakkında daha fazla bilgi bulunabilir. C ve F aynı görüntü olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu = 500 mm.
Şekil 3. 3-D doku miktarının derken civciv beyin eformations. (A) Polistiren dorsal (siyah ok) uymak mikroküreler ve ventral (beyaz ok) beyin tüp taraf OCT rekonstrüksiyonlar enine section.Ventral kez dokuları çevreleyen kolayca ayırt orta Beyin sınır yakınındaki Microsphere yerlerde (C), (B) HH12 ve daha sonra 6 saat inkübasyon (M: orta beyin, H: Beyin). Boncuk doku genel deformasyon vurgulamak için çeşitli gruplar özetlenmiştir. (D) Boyuna (D zz) ve çevresel (E θθ) Lagrange suşları bu deformasyonlar hesaplandı. Pozitif orta Beyin sınır boyuna ve olumsuz çevresel suşları kültür sırasında bu bölgede bir uzatma eksenel ve çevresel kısalma yansıtmaktadır. Filas ve ark (2008) 9 morfolojilerinden sırasında karmaşık yüzeyler için morfogenetik suşları hesaplarken hakkında daha fazla bilgi bulunabilir. Ölçek çubuğu = 200 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İki doku etiketleme teknikleri, erken civciv embriyo ex ovo kültürü için sunulmuştur . Ilk hücre aynı anda yüzlerce etiket, manyetik demir parçacıkları ile teslim floresan lipofilik boyalar kullanır. Ancak, bu yöntem, floresan boyalar genellikle 10 Eki kullanarak çevre dokulara çok az kontrast gösterdiği gibi, şu anda optik koherens tomografi ile uyumlu değildir . Bu nedenle, biz time-lapse OCT analizi için doku etiket polystyrene küreler kullanarak alternatif bir yöntemdir. Bu teknik, 3-boyutlu veri setleri verimleri ama doku boncuk çıkarmak için bakım alınmalıdır. Uygun deneysel bir ortamda, bu yöntemlerden birini kullanarak güvenilir erken embriyolar doku etiketleme ve ex ovo gelişimi sağlamak olmalıdır . Her iki yöntem de hazır, nispeten düşük maliyetli malzemeleri (örneğin, demir tozu, polistiren mikroküreler gibi) kullanımı ve morfolojilerinden sırasında sayısal doku deformasyon sağlamak.Her iki durumda da doku işaretleyicileri embriyonik dokulara uygulanan ve özel ekipman gerektirmez, bu deneyler alanında yeni gelenler için erişilebilir hale kolay ve tekrarlanabilir olabilir. Görselleştirme ve ortaya çıkan veriler (örneğin, bilgisayar morfogenetik gerginlik haritaları) analiz model sistemi 6, 7, 9, 11, 12 morfolojilerinden mekaniği aydınlatmak yardımcı olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe, R01 GM075200 ve R01 HL083393 (LAT) tarafından desteklenmiştir. Biz BAF için burs desteği kabul NIH T90 DA022871 ve Mallinckrodt Radyoloji Enstitüsü ve Amerikan Kalp Birliği hibe 09PRE2060795 VDV için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM — high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments, Inc. | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences, Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
- Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
- Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
- Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
- Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
- Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
- Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
- Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
- Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).
