Summary
Cet article décrit l'étiquetage de surface et
Abstract
Embryonic épithélium subir des déformations complexes (par exemple flexion, de torsion, le pliage et étirement) pour former les organes primitifs de l'embryon précoce. Suivi des marqueurs fiduciaires sur les surfaces de ces feuilles cellulaire est une méthode bien établie pour l'estimation des quantités morphogénétiques tels que la croissance, la contraction et de cisaillement. Cependant, toutes les techniques de marquage de surface sont facilement adaptables aux modalités d'imagerie conventionnelles et possèdent différents avantages et ses limites. Ici, nous décrivons deux méthodes de marquage et d'illustrer l'utilité de chaque technique. Dans la première méthode, des centaines de marqueurs fluorescents sont appliquées simultanément à l'embryon en utilisant des particules de fer magnétique. Ces étiquettes sont ensuite utilisés pour la quantité déformations des tissus en 2-D lors de la morphogenèse. Dans la seconde méthode, microsphères de polystyrène sont utilisés comme agents de contraste chez les non-invasive tomographie par cohérence optique (OCT) d'imagerie pour suivre les déformations des tissus en 3-D. Ces techniques ont été couronnés de succèsment mis en œuvre dans notre laboratoire pour studythe mécanismes physiques de la tête fois au début, le cœur et le développement du cerveau, et devrait être adaptable à une large processus morphogénétiques gamme.
Protocol
1. Préparation générale expérimentale
- Préparer un milieu de culture de tissus dans la hotte à flux laminaire.
- Diluer milieu Dulbecco modifié Eagle (DMEM) (bouteille de 1 L avec 4,5 g / L de glucose, bicarbonate de sodium et de L-glutamine). Ajouter 10 ml de pénicilline / streptomycine / néomycine antibiotiques.
- Retirer 100 ml de DMEM avec une pipette de transfert stérile et la remplacer par 100 ml de sérum de poulet.
- Aliquoter le poussin DMEM/10% de sérum / antibiotiques 1% dans 15 ml stériles fioles coniques et congeler.
- Préparer un tampon phosphate salin (PBS) additionné de calcium et de magnésium. Mélanger 100 ml de PBS 10X, 900 ml d'eau déminéralisée, et 1 ml d'une solution concentrée de calcium et de magnésium (100 mg / mL CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/mL MgCl 2 • 6H 2 O).
- Incuber les œufs dans une orientation longitudinale au stade désiré tel que défini par Hamburger et Hamilton 1 (ie 23-25 heures pour la scène HH 5, ou 42-48 Heures pour les étapes HH 11-12).
- Retirer les embryons de l'oeuf en utilisant la méthode du papier filtre transporteur.
- Crack du fond de l'œuf sur le côté du A150 mm boîte de Petri. Séparez la coquille du fond et de vider le contenu de l'œuf dans le plat.
- Retirez le plus épais, visqueux, l'albumine de l'œuf à l'aide des pinces émoussé.
- Couper des cercles de papier Whatman n ° 2 du papier filtre à 2-3 cm. de diamètre. En utilisant une seule perforation, trous de perforation dans le milieu du papier filtre. Placer l'un des anneaux de papier filtre sur le jaune d'une manière qui empêche l'embryon visible à travers le trou central dans le ring.
- Couper autour du diamètre extérieur du papier filtre avec microciseaux. Retirez le papier du jaune d'oeuf avec une pince fine.
- Rincer délicatement l'embryon dans le PBS pour éliminer les particules jaunes adhérentes. (HH5 embryons peuvent avoir besoin de tremper aussi longtemps que 15-20 minutes pour enlever le jaune résiduelle). Retirez l'assemblage du papier filtre du bain et le placer face ventrale dans un35 mm boîte de culture. Placer un anneau de papier second filtre au sommet de la première, l'embryon en sandwich entre les anneaux. Mettez un anneau de métal autour de l'extérieur du sandwich papier-filtre (≈ 1,5 à 2 cm de diamètre) pour sécuriser l'embryon.
- Immerger l'embryon dans le milieu de culture. Vérifiez la morphologie correcte et le stade embryonnaire, avec un microscope à champ clair.
- Utiliser un extracteur de pipette pour la préparation fines aiguilles de verre pointe (1,5 mm de diamètre interne) (Instruments de précision mondiale, Sarasota FL) pour les dissections ultérieures et l'étiquetage des tissus.
2. DiI étiquetage des HH Étape 5 embryons en utilisant des particules de fer magnétique
- Ajouter quelques gouttes de DiI saturées dans l'alcool à une petite quantité de poudre de fer (fer réduit, Mallinckrodt Baker, Inc, Phillipsburg, NJ) à température ambiante et laisser sécher. (Cela provoque généralement des particules à s'agglomérer ensemble une fois l'alcool s'est évaporé.) Utilisez la pointe d'une micropipette tiré pour disperser les particules de fer agglomérées,les transférer dans un tube à centrifuger, et rincez-les plusieurs fois et couvrir avec de l'eau déminéralisée.
- Pour marquer les cellules ectodermiques à un stade embryonnaire HH 5, place de l'embryon récolté (ie, l'assemblée entière du papier filtre) face dorsale dans une boîte de culture de 35 mm recouvert d'une couche généreuse de milieux de culture et de mettre le plat sous un microscope à dissection. Utiliser une aiguille de verre pour enlever la membrane vitelline et d'exposer les cellules ectodermiques. (Prenez soin de ne pas l'embryon percer.)
- Dessinez une colonne de particules de fer marqués (dans de l'eau déminéralisée) dans une pipette Pasteur. Utilisation du microscope à dissection, submerger la pipette sous la surface du liquide et la position juste au-dessus de l'embryon. Rouler la pipette avant et en arrière entre les doigts, se bousculent les particules de la pipiette et saupoudrez-les dans l'embryon.
- Une fois que l'embryon est recouvert de particules, soigneusement le placer dans un incubateur à 37 ° C pendant environ 10 minutes. Prenez l'embryon hors de l'incubateur uned utiliser un aimant puissant pour éliminer les particules.
- Utiliser un microscope à fluorescence avec caméra vidéo ci-jointe et les paramètres de filtre approprié pour acquérir à la fois sur le terrain lumineux et images fluorescentes de l'embryon, comme le montre la figure 2A, B.
- Notez la densité étiquette. Si une distribution plus dense est souhaitée, utiliser des particules supplémentaires (comme décrit ci-dessus) à l'étiquette de l'embryon à nouveau et prolonger le temps d'incubation en conséquence. Si les étiquettes sont trop denses, ajoutez une petite quantité de particules de fer sans étiquette à l'microtube rempli de particules déjà étiquetés et mélanger le contenu du tube. Répétez le processus d'étiquetage avec un nouvel embryon et encore noter la densité étiquette.
3. Étiquetage des microsphères de polystyrène pour tomographie en cohérence optique (OCT) Imagerie de HH11-12 embryons
- Préparer une solution de noir 10 microns de diamètre des microsphères (Polysciences Inc, Warrington, PA) dans du PBS dans un plat de Pétri de 35 mm. (Perles devrait être assez grand pour générer de contraste pour l'OCTd'imagerie, mais assez petit de telle sorte que la taille de cordon est de l'ordre des cellules individuelles. Des valeurs spécifiques varient en fonction de la résolution de votre système PTOM et les tissus étudiés). Une goutte de la solution mère (2,6% de matières solides en latex) par ml de PBS est généralement suffisante. Tirez cette solution dans une seringue de 10cc à l'aide d'une aiguille de calibre 22. Vortex la solution pendant 30 secondes afin d'assurer une distribution uniforme de perles.
- Biseau les bouts de vos aiguilles de verre tiré en utilisant un disque dur d'ordinateur 2. Diamètre de la pointe doit être suffisamment grand que les perles peuvent avoir accès par l'ouverture, mais dans le même temps, aussi petit que possible afin de minimiser les tissus blessés pendant l'injection.
- Remplir une aiguille de verre biseauté avec la solution billes à l'aide de la seringue. Légèrement film de la micropipette pour s'assurer que la solution a atteint l'extrémité.
- L'utilisation d'un micromanipulateur, placer l'aiguille de verre dans le même champ de vision que l'embryon. Perles devrait être s'écoulant de la pointe de la pipette.
- Si aucun beaExit DS de la micropipette, il peut y avoir un sabot. Dans ce cas, répétez les étapes 3.2 à 3.4 avec une aiguille de verre neuf.
- Si un trop grand nombre de nuages perles de votre champ de vision, votre pointe de la pipette peut être trop large. Répétez les étapes 3.2 à 3.4 avec une nouvelle pipette et un nouvel embryon.
- Insérez la pointe de la pipette dans le lumen du tube cerveau. Soyez sûr de ne pas percer le plancher ventral du tissu. Vous verrez un œdème transitoire des tissus comme des perles et du liquide pénétrer à l'intérieur. Cela indique une intubation réussie, maintenant, rapidement, retirez l'aiguille de verre.
- Vérifiez une densité suffisante de billes dans la lumière interne du tube de cerveau à l'aide d'un microscope en champ clair. Laissez les perles se contenter de 20 - 30 minutes avant de procéder à Sect. 4.
4. Acquisition de données
* Les méthodes suivantes sont bien adaptés pour la technique de marquage fluorescent décrit ci-dessus. Cependant, avec la technique de marquage des microsphères, des perles peut déloger lors du transfert des échantillonsentre les incubateurs et les systèmes d'imagerie. Dans ce cas il est préférable de passer à l'étape 4.2 (ce qui évite l'échantillon mouvement / l'agitation au total). Dans les deux méthodes, les embryons sont cultivés tandis immergé dans un milieu de culture liquide. Si l'embryon n'est pas complètement immergé (comme c'est le cas avec certaines des techniques conventionnelles de culture de tissus), la géométrie des tissus est considérablement altérée par anormalement élevée des charges de tension de surface et des distributions de contrainte ne parviendra pas à saisir avec précision la normale en 3-D morphogenèse 3, 4. Par ailleurs, submergeant le tissu empêche le contraste lumineux observés à l'interface liquide-gaz pendant imagerie OCT de masquer la morphologie embryonnaire et coordonne marqueur.
- Culture d'embryon (général)
- Après l'acquisition de votre premières images (champ clair, fluorescence, ou PTOM), mis en place à sept 35 boîtes de culture mm (avec des embryons) dans un plat de Pétri de 150 mm et le lieu de l'assemblée entière dans un petit sac en plastique. Ajouter quelques gouttes d'eau déminéralisée pour le sac d'humidificationet de remplir le sac avec un O à 95% 2 / 5% CO 2 mélange. Placer les embryons dans l'incubateur à 37 ° C (Queue Stabiletherm, Asheville, Caroline du Nord) pour le temps désiré jusqu'à la prochaine date jalon d'imagerie. En utilisant cette méthode, les expériences peuvent être effectuées sur des embryons multiples dans la même journée.
- Time-lapse de la culture (automatisé)
- Placez votre embryons étiquetés dans un plat Delta T (35 mm de diamètre extérieur, 23 mm d'ouverture centrale avec paroi latérale effilée, 0.17mm d'épaisseur de verre; Bioptechs, Butler, Pennsylvanie) contenant 1,2 ml de milieu de culture.
- Couvrir le plat avec un couvercle en verre maintenu à 37 ° C en utilisant un contrôleur Bioptechs Delta T4 boîte de culture (pour éviter la condensation). Superfuse l'embryon avec un O à 95% 2 / 5% CO 2 mélange de gaz fourni à partir d'un dispositif de mini-pompe débit variable (Fisher Scientific). Avant d'atteindre l'embryon, chauffer et humidifier le gaz par barbotage dans l'eau déminéralisée sur une chaude (<100 ° C) plaque chauffante. Un schéma de ce s expérimentaleet-up est montré dans la figure 1.
- Mettre en place le logiciel d'acquérir automatiquement des images à intervalle de temps spécifié par l'utilisateur. Pour notre microscope à fluorescence, nous utilisons le logiciel Openlab (PerkinElmer, Waltham, MA), et pour notre système OCT, nous utilisons balayé sources Thorlabs logiciels (Newton, NJ). Parce que cette méthode n'est actuellement capable de gérer une time-lapse expérience à un moment, il est souvent préférable de permettre à ces types de cultures afin de fonctionner pendant la nuit. On pourrait contourner cette limitation en installant un stade automatisé traduisible compatible avec les matériels et logiciels du système d'imagerie 5.
5. Les résultats représentatifs:
Les étiquettes sont suivis automatiquement (en utilisant Volocity, PerkinElmer) ou manuellement (en utilisant le plugin Manuel de suivi dans ImageJ, NIH) dans chaque expérience. Dans la technique de marquage fluorescent, nous utilisons la routine Matlab gridfit pour s'adapter surfaces 2D dans les coordonnées de marqueur, ce qui permet souches de surface morphogénétiques à calculer 6, 7. Équations standard sont utilisés pour transformer ces valeurs dans un système de coordonnées embryonnaire pertinents. Alternativement, dans la technique des PTOM, les surfaces sont générées à partir des volumes image segmentée (obtenu via un logiciel standard comme Matlab ou Caret 8) et les souches peuvent être calculés dans le sens de courbure maximum ou minimum de l'échantillon 9.
Nous avons utilisé notre technique de particules de fer pour l'étiquette et de suivre le mouvement des cellules ectodermiques lors de la formation plier en tête de l'embryon de poulet au début. Comme le montre la Figure 2A, les cellules marquées par fluorescence ont été distribués partout l'embryon entier. Fond clair et des images fluorescentes de l'embryon ont été capturés à différents intervalles pendant la culture in ovo ex. Les mouvements des étiquettes suivi (Fig. 2B, C) ont été ensuite utilisées pour calculer les distributions évoluent souche morphogénétiques pendant la formation de la tête double (Fig. 2D-F).
t "> De même, notre technique de microsphères de polystyrène a été utilisé pour suivre les mouvements des tissus, à la limite mi-rhombencéphale du cerveau chiches tôt. Comme le montre la figure 3 BD, les motions perles ont été suivis pendant 6 heures et caractériser la déformation des tissus souches dans le sens longitudinal et directions circonférentielles ont été calculés à partir des coordonnées des marqueurs. Notez que cette méthode est capable de traiter distinctement en 3-D des déformations que les billes ont tendance à coller à tous les côtés de la lumière interne du cerveau (figure 3A).
Figure 1. Schéma du set-up pour la culture de tissus time-lapse.
Figure 2. Quantifier 2-D des déformations des tissus dans l'embryon de poulet au début en utilisant le suivi des marqueurs fluorescents. (A) lumineuse Fusionné champ / fluorescentes l'image de la scène HH 5 embryons après l'enlèvement de particules de fer. DII-étiquetteéd cellules ectodermiques (rouge) sont distribués à travers l'embryon entier. (B, C) Le mouvement de cellules marquées était suivi à l'aide ImageJ. Déplacements d'étiquettes ont été calculés en coordonnées embryon (X, Y). Notez que A et B sont de la même image. (DF) des parcelles de contour de l'évolution des distributions de contrainte longitudinale pendant la formation de la tête pli. Longitudinale des souches de Lagrange ont été calculés par rapport à l'étape 5 HH (ie, A et B) après (D) 75 min, (E) 120 min, et (F) 165 min d'incubation. Ces souches de caractériser les variations de longueur des éléments de ligne originellement orientée selon l'axe Y (dans l'étape 5 embryons). De plus amples détails sur l'utilisation de l'étiquette suivie pour calculer les coordonnées des souches morphogénétiques peuvent être trouvés dans Filas et al. (2007) 6 et Varner et al. (2010) 7. Notez que C et F sont de la même image. Barre d'échelle = 500 pm.
Figure 3. Quantifier 3-D des tissus deformations chiche dans le cerveau au début. (A) microsphères de polystyrène qui adhèrent à l'(flèche noire) dorsale et ventrale (flèche blanche) parois du tube du cerveau sont facilement discernables dans les tissus environnants transversale vues section.Ventral de reconstructions octobre montrent endroits microsphères près de la limite mi-rhombencéphale en (B) HH12 et après (C) 6 h d'incubation (M: le mésencéphale, H: rhombencéphale). Plusieurs groupes de perles sont décrites pour mettre en évidence la déformation globale du tissu. (D) longitudinale (E ZZ) et circonférentielle (E θθ) souches de Lagrange ont été calculés à partir de ces déformations. Positive et négative longitudinale souches circonférentielle à la limite mi-rhombencéphale reflètent une axiale allongement et le raccourcissement circonférentiel de cette région pendant la culture. De plus amples détails sur le calcul des souches morphogénétiques pour les surfaces complexes durant la morphogenèse peut être trouvée dans Filas et al. (2008) 9. Barre d'échelle = 200 pm.
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Discussion
Deux techniques de marquage des tissus sont présentés pour la culture ex ovo d'embryons de poulet au début. La première utilise les colorants lipophiles fluorescents livrés par des particules de fer magnétique à la fois l'étiquette des centaines de cellules. Cependant, cette méthode n'est actuellement pas compatible avec la tomographie par cohérence optique, comme des colorants fluorescents montrent généralement peu de contraste dans les tissus environnants en utilisant le 10 octobre. Ainsi, nous montrons une technique alternative utilisant microsphères de polystyrène à l'étiquette de tissus pour time-lapse d'analyse octobre Cette technique donne des ensembles de données 3-D, mais il faut prendre soin à ne pas déloger les perles du tissu. Utiliser un ou l'autre de ces méthodes dans le cadre expérimental approprié devrait fournir un étiquetage fiable des tissus et ex ovo de développement dans les embryons précoces. Les deux méthodes utilisent facilement disponibles et relativement peu coûteux des matériaux (par exemple, la poudre de fer, microsphères de polystyrène) et permettre la déformation des tissus pour être quantifié lors de la morphogenèse. L'marqueurs tissulaires dans les deux cas peuvent être facilement et de façon reproductible appliquée aux tissus embryonnaires et ne nécessitent pas d'équipement spécialisé, ce qui rend ces expériences accessibles aux nouveaux arrivants dans le domaine. Visualisation et analyse des données résultant (par exemple, par les cartes informatiques souche morphogénétiques) devrait aider à éclairer les mécanismes de la morphogenèse dans votre système modèle 6, 7, 9, 11, 12.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH R01 et R01 GM075200 HL083393 (LAT). Nous reconnaissons le soutien de bourses pour les FBA du NIH et le T90 DA022871 Mallinckrodt Institute of Radiology, et pour VDV d'octroi 09PRE2060795 de la American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM — high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments, Inc. | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences, Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
- Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
- Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
- Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
- Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
- Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
- Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
- Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
- Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).
