Summary
이 문서는 표면 레이블 및 설명
Abstract
배아 상피 조직은 초기 배아의 원시 장기를 형성하기 위해 복잡한 deformations (예, 굽힘 비틀림, 접이식, 그리고 스트레칭) 받다. 이러한 세포 시트의 표면에 fiducial 마커를 추적하는 것은 같은 성장, 수축 및 전단 등 morphogenetic 수량을 계산하는 잘 구축 방법입니다. 그러나, 모든 표면 분류 기술은 기존 영상 modalities에 쉽게 적응하고 서로 다른 장점과 한계를 가지고있다. 여기, 우리는 두 가지 분류 방법을 설명하고 각 기술의 유틸리티를 보여줍니다. 첫 번째 방법에서는 형광 라벨의 수백 자기 철분 입자를 사용하여 배 (胚)에 동시에 적용됩니다. 이러한 라벨은 다음 morphogenesis 중에 2 - D 조직 deformations 수량하는 데 사용됩니다. 두 번째 방법에서는 폴리스티렌 microspheres는 3 - D 조직 deformations를 추적하는 비침습 광학 일관성 tomography (-10 월) 이미지의 대비 요원으로 사용됩니다. 이 기술은 성공적인 것으로정 일찍 머리를 접어, 심장, 뇌 개발의 물리적 메커니즘을 studythe하기 위해 실험실에서 구현하고, 다양한 범위 morphogenetic 프로세스에 적용할 수 있어야합니다.
Protocol
1. 일반 실험 준비
- 층류 흐름 후드의 조직 문화 매체를 준비합니다.
- Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM) (1 4.5g / L 포도당과 L 병, 나트륨 중탄산염, 그리고 L - 글루타민)을 희석. 10 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 네오 마이신 항생제를 추가합니다.
- 멸균 전송 피펫과 DMEM의 100 ML을 제거하고 여자는 혈청 100 ML로 바꿉니다.
- 나누어지는 무균 15 ML 원뿔 튜브 및 동결에 DMEM/10 %의 여자는 혈청 / 1 %의 항생제.
- 인산염을 준비 칼슘과 마그네슘으로 보충 식염수 (PBS)는 버퍼. 100 ML 10X PBS, 900 ML 탈이온수, 그리고 농축 칼슘, 마그네슘 용액 (100 MG / ML CaCl 2 • 2 시간 2 O, 100mg/mL MgCl 2 • 6H 2 O) 1 ML을 섞는다.
- 햄버거와 해밀턴 1 (즉, 23-25 HH 단계 5 시간 또는 42에 의해 정의된 원하는대로 무대에 세로 방향으로 알을 품어HH 단계 11-12)에 대한 -48 시간.
- 필터 종이 캐리어 방법을 사용하여 난자에서 배아를 제거합니다.
- a150 mm 페트리 접시의 측면에있는 계란의 바닥 균열. 바닥에서 쉘 사이를 분열 시키려고하고 그릇에 계란의 내용을 비웁니다.
- 무딘 집게를 사용하여 계란의 두꺼운, 점성 횐자위를 제거합니다.
- 워트 먼지 # 2 필터 종이 2-3센티미터의 원을 잘라. 직경 인치 필터 종이의 중앙에 하나의 구멍 펀치, 펀치 구멍을 사용합니다. 반지의 중앙 구멍을 통해 보이는 배아를 유지하는 방식으로 노른자에있는 필터 종이 반지 중 하나를 놓으십시오.
- microscissors와 필터 용지의 외경 주위 컷. 미세 집게와 노른자에서 종이를 제거합니다.
- 부드럽게 자기편 노른자 입자를 제거하는 PBS에서 배아를 씻어. (HH5 배아는 잔류 노른자를 제거하는 15-20분 한 때를 벗길 필요가 있습니다.) 목욕탕에서 필터 종이 어셈블리를 제거에서 복부 측면을 장소35mm 문화 요리. 고리 사이의 배아를 sandwiching 처음으로 위에 두 번째 필터 종이 반지를, 놓으십시오. 배아를 확보하기 위해 - 필터 종이 샌드위치 (2cm 직경 ≈ 1.5)의 외부 주위에 금속 반지를 끼면.
- 문화 매체의 잠수함 배아합니다. 명시야 현미경으로 적절한 형태 및 배아 단계를 확인합니다.
- 이후 조직의 해부 및 라벨에 대한 좋은 팁 유리 바늘 (1.5 mm 내경) (세계 정밀 계측기, 사라소타 FL)를 준비하는 피펫 풀러를 사용합니다.
2. 자기 철 입자를 사용하여 HH 단계 DiI 라벨링 5 태아
- 상온에서 철 가루의 작은 수량 (철분 감소, Mallinckrodt 베이커 주식 회사, Phillipsburg, NJ)에 알코올에 포화 DiI 몇 방울을 추가하고 말리면. (이것은 일반적으로 알코올이 증발되면 함께 케이크에 입자가 발생합니다.) clumped 철분 입자를 헤어지게하는 뽑아 micropipette의 팁을 사용microcentrifuge 튜브로 전송하고, 그들에게 여러 번 씻어 탈이온수로 커버.
- HH 단계 5 배아에서 ectodermal 전지 라벨, 문화 미디어의 풍부한 레이어 덮여 35mm 문화 접시에있는 (즉, 전체 필터 종이 조립) 등의 측면을 수확 배아를 놓고 해부 현미경으로 접시를 넣어. vitelline 멤브레인를 제거하고 ectodermal 세포를 폭로 유리 바늘을 사용합니다. (하지 피어스의 배아를 해.)
- 파스퇴르 피펫으로 표시 철 입자 (탈이온수의)의 칼럼을 그립니다. 해부 현미경, 잠수함에게 바로 배아 위의 액체 표면과 위치 아래에 피펫 팁을 사용합니다. 손가락 사이를 천천히 앞뒤로 피펫을 롤링, pipiette의 입자를 밀다 및 배아에 걸쳐 그들을 뿌린다.
- 일단 배아는 신중하게 약 10 분 동안 37 ° C 배양기에 배치, 입자로 덮여 있습니다. 인큐베이터 밖으로 배아를 타고D 입자를 제거하는 강력한 자석을 사용합니다.
- 그림 2A, B.에 나타난 밝은 분야와 배아의 형광 이미지 모두를 얻기 연결된 비디오 카메라와 적절한 필터 설정과 형광 현미경을 사용하여
- 라벨 밀도를합니다. 밀도 분포가 원하는 경우, 다시 배아를 라벨과 그에 따라 보육 시간을 연장 (위에서 설명한 것처럼) 추가 입자를 사용합니다. 라벨이 너무 밀도있다면, 이미 표시된 입자 가득한 microcentrifuge 튜브에 레이블이 지정되지 않은 철 입자의 작은 수량을 추가하고 튜브 내용을 섞는다. 새로운 배아로 분류 과정을 반복하고 다시 레이블 밀도를 적어 둡니다.
3. HH11 - 12 배아의 광 결맞음 Tomography (-10 월) 이미징을위한 폴리스티렌 Microsphere 라벨
- 35mm 배양 접시에있는 PBS에 검은 10 μm의 직경 microspheres (Polysciences 주식 회사, Warrington, PA)의 솔루션을 준비합니다. (비즈는 OCT에 대한 대비를 생성할 수있을만큼 커야합니다이미징하지만, 충분한 크기 비드 개별 세포의 순서에 그러한 작은. 특정 값)가 OCT 시스템의 해상도에 따라 다를 수 있으며 조직은 연구되고. PBS의 ML 당 재고 솔루션 중 하나 드롭 (2.6 % 고체 - 라텍스)는 일반적으로 충분합니다. 22 게이지 바늘을 사용하여 10cc 주사기로이 솔루션을 당기세요. 균일한 비드 유통을 보장하기 위해 30 초 동안 소용돌이 솔루션입니다.
- 베벨 컴퓨터 하드 드라이브 2를 사용하여 뽑아 유리 바늘의 팁. 팁 직경 구슬은 오프닝을 통해 들어갈 수있는 정도로 커야합니다,하지만 동시에, 가능한 한 작은 주입하는 동안 조직 지을만한 상처를 최소화합니다.
- 주사기를 사용하여 비드 솔루션 beveled 유리 바늘을 입력합니다. 가볍게는 솔루션 끝에 도달했음을 보장하기 위해 micropipette 버려.
- micromanipulator 사용하여 배아로보기 같은 분야에서 유리 바늘을 넣으십시오. 구슬은 피펫 팁 밖으로 흐르는되어야합니다.
- 아니 비 경우DS는 micropipette을 종료, 덩어리가있을 수 있습니다. 이 경우에는 반복 새로운 유리 바늘로 3.2-3.4 단계를 반복합니다.
- 너무 많은 구슬이보기의 필드를 구름 경우, 피펫 팁이 너무 광범위한 수 있습니다. 반복 새 피펫 새로운 배아와 3.2-3.4 단계를 반복합니다.
- 두뇌 튜브의 루멘에 피펫 팁을 넣습니다. 아니라 조직의 복부 층 피어스해야합니다. 구슬과 유체는 루멘을 입력으로 당신은 조직의 과도 팽창을 볼 수 있습니다. 이것은 성공적인 삽관법을 나타냅니다, 이제 신속하게 유리 바늘을 제거합니다.
- 명시야 현미경을 사용하여 뇌 튜브의 내부 루멘에 충분한 비드 밀도를 확인합니다. 종파로 진행하기 전에 30 분 - 비즈가 20 쉬라 구. 4.
4. 데이터 수집
* 다음과 같은 방법이 잘 위에서 설명한 형광 라벨 기법에 적합합니다. 샘플을 전송할 때 그러나 microsphere 라벨 기술과 구슬이 이동시키다 수 있습니다incubators 및 이미징 시스템 사이. 이 경우는 4.2 (운동 / 교반 모두 샘플을 피할 수있는) 단계를 진행하는 것이 좋습니다. 액체 배지에 빠져들면서 두 가지 방법에서, 배아는 양식입니다. 배아가 완전히 (일부 기존의 조직 문화 기술과 케이스가 등) 침수되지 않을 경우, 조직 형태가 크게 비정상적으로 높은 표면 장력로드 및 변형 배포판에 의해 변경 것은 정확하게 일반적인 3 - D morphogenesis 3, 4를 캡처되지 않습니다. 또한, 조직을 잠수함이 잠수하는 것은 배아 형태학 및 마커 좌표를 왜곡시키지에서 OCT 이미징 동안 액체 가스 인터페이스에서 관찰 밝은 명암을 방지합니다.
- 배아 문화 (일반)
- 첫 번째 이미지 (명시야, 형광, 또는 -10 월) 취득 후, 150mm 페트리 접시에서 일곱 35mm 문화 요리 (배아)를 지시하고 작은 비닐 봉투에있는 모든 어셈블리를 놓으십시오. 가습을 위해 가방에 탈이온수의 방울 정도를 추가그리고 95 % O 5분의 2 %의 CO 2 혼합과 자루를 채우십시오. 37 인큐베이터에 배아를 놓고 ° C 다음 이미징 timepoint까지 원하는 시간 (대기열 Stabiletherm, 애쉬빌, 노스캐롤라이나). 이 방법을 사용하여 실험 당일 여러 배아에서 수행할 수 있습니다.
- 시간 경과 문화 (자동)
- 문화 매체의 1.2 ML을 포함, 델타 T 요리 (Bioptechs, 버틀러, PA 35mm 외경, 테이퍼 측면 벽과 23mm 중앙 개구, 0.17mm 두께의 유리)로 표시 배아를 놓습니다.
- 37 보관 유리 뚜껑있는 접시를 커버 ° C Bioptechs 델타 T4 문화 요리 컨트롤러를 (결로 방지)를 사용합니다. 95 % O 2 / 미니 펌프 가변 흐름 장치 (피셔 과학)에서 제공하는 5 % CO 2 가스 혼합물로 배아를 Superfuse. 이전에 배아, 열을 도달하고 따뜻한 (<100 ° C) 뜨거운 접시에 탈이온수를 통해 버블링하여 가스 ...을 축이다. 이 실험 s의 개략도동부 표준시 - 업은 그림 1에 표시됩니다.
- 자동으로 사용자가 지정한 시간 간격으로 이미지를 얻기위한 소프트웨어를 설정합니다. 우리의 형광 현미경을 위해, 우리는 Openlab 소프트웨어 (PerkinElmer, Waltham, MA)를 사용하여, 우리 OCT 시스템, 우리는 들어올렸다 소스 Thorlabs 소프트웨어 (뉴튼, NJ)를 사용합니다.이 방법은 현재 한 시간 경과 실험을 처리 때만 사용되기 때문에 시간, 그것은 문화의 이러한 유형은 하룻밤 실행할 수 있도록하는 것이 좋습니다. 하나는 이미징 시스템 5 하드웨어 및 소프트웨어 모두와 호환 자동 번역 무대를 설치하여 이러한 제한을 우회 수 있습니다.
5. 대표 결과 :
레이블은 각 실험에서 자동 추적 (Volocity를 사용하여 PerkinElmer) 또는 수동 (ImageJ에서 수동 추적 플러그인을 사용하여 NIH)입니다. 형광 라벨 기법에서는, 우리는 가능 마커 좌표를 통해 2D 표면에 맞게 Matlab 루틴의 gridfit를 사용하여 morphogenetic 표면 변종은 6, 7을 계산합니다. 표준 방정식은 관련 배아 좌표 시스템에 이러한 값을 변환하는 데 사용됩니다. 또는 OCT 기술에서 표면 분할 이미지 볼륨 (예 : Matlab이나 캐럿 8로 표준 소프트웨어를 통해 획득)과 종자에서 생성된 샘플은 9 최대 또는 최소 곡률 방향으로 계산하실 수 있습니다.
우리는 초기에 여자의 배아에서 머리 접어 형성하는 동안 ectodermal 세포의 움직임을 라벨과 추적하기 위해 철 입자 기술을 사용합니다. 마찬가지로 그림 2A에 묘사된, 찬란 표시된 세포는 배아 전체에 걸쳐 분포하고 있었어요. 명시야 및 배아의 형광 이미지는 전부 비켜 문화 중 서로 다른 간격으로 점령했다. 추적 라벨 (그림 2B, C)의 동작은 다음 머리 접어 형성 동안 진화 morphogenetic 변형 배포판 (그림 2D - F)를 계산하는 데 사용되었습니다.
t는 "> 마찬가지로, 우리의 폴리스티렌 microsphere 기술은 초기에 여자의 두뇌의 중간 hindbrain 경계에서 조직의 움직임을 추적하는 데 사용되었다.으로서 그림 3 BD에 표시된 비드 움직임은 종방향 및 조직 변형을 특성화 6 시간 변종에 대한 추적했다 원주 방향은 마커 좌표에서 계산되었다. 참고 구슬은 두뇌의 내부 루멘 (그림 3A)의 모든 측면에 집중하는 경향으로이 방법은 독특한 3 - D deformations을 처리할입니다.
그림 1. 시간 저속 조직 문화의 설정의 도식.
그림 2. 추적 형광 라벨을 사용하여 초기 여자의 배아에서 2 - D 조직 deformations을 Quantifying. 철 입자의 제거 후 HH 단계 5 배 (胚)의 (A) 합병 필드 밝은 / 형광 이미지. DiI - 라벨에드 ectodermal 세포 (적색)은 전체 배아를 통해 배포됩니다. (B, C)라고 표시된 세포의 움직임은 ImageJ를 사용하여 추적했다. 라벨 변위는 배아 좌표 (X, Y)으로 계산되었습니다. A와 B가 같은 이미지가됩니다. (DF) 머리 배 형성시 종방향 변형 배포판을 진화의 윤곽 플롯. 세로 Lagrangian의 변종은 (D) 75 분 후 (즉, A와 B) (E) 120 분, 그리고 부화의 (F) 165 분 스테이지 5 HH에 상대적으로 계산했다. 이 변종은 Y - 축을 따라 원래 지향 라인 요소의 길이 변화를 (5 단계 배아에서) 특징. 추적 라벨을 사용하면 morphogenetic의 긴장을 계산하는 좌표에 대한 더 자세한 사항은 Filas 외. (2007) 6 바너 외. (2010) 7 찾을 수 있습니다. C와 F가 같은 이미지가됩니다. 스케일 바 = 500 μm의.
그림 3. 3 - D 조직 D를 Quantifying초기 여자의 두뇌에 eformations. (A) 뇌 관의 폴리스티렌 지느러미 (검은색 화살표)을 준수 microspheres 및 복부 (흰색 화살표) 양측은 OCT의 reconstructions의 가로 교차 section.Ventral보기에 조직을 둘러싼에서 쉽게보고 알 수있는하는 것은 중반 hindbrain 경계 근처 microsphere 위치를 표시 (B) HH12에서 후 (C) 부화 6 시간 (M : midbrain, H : hindbrain). 구슬의 여러 그룹이 조직의 전반적인 변형을 강조 설명되어 있습니다. (D) 세로 (E ZZ)와 원주 (E θθ) Lagrangian의 종자가 이러한 deformations으로부터 계산되었다. 중간 hindbrain 경계에서 긍정과 부정 세로 원주 계통 문화 동안이 지역의 길어 축 및 원주 단축을 반영합니다. morphogenesis 동안 복잡한 표면에 대한 morphogenetic의 종자를 계산에 대한 자세한 내용은 Filas 외. (2008) 9에서 찾을 수 있습니다. 스케일 바 = 200 μm의.
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Discussion
두 조직 분류 기술은 초기에 여자는 태아의 전 비켜 문화 제공됩니다. 첫 번째는 동시에 세포의 수백 라벨 자기 철 입자를 통해 제공되는 형광 염료 lipophilic를 사용합니다. 형광 염료는 일반적으로 10월 10일를 사용하여 주변 조직에서 약간의 대비를 보여주 그러나이 방법은 현재 광학 일관성의 tomography와 호환되지 않습니다. 따라서, 우리는 시간 경과 OCT 분석을위한 조직을 레이블에 폴리스티렌 microspheres를 사용하여 다른 방법을 보여줍니다. 이 기술은 3 - D 데이터 세트를 산출하지만, 관리는 조직에서 구슬을 이동시키다하지 않도록해야합니다. 적절한 실험 설정에서 이러한 방법 중 하나를 사용하면 초기 배아에서 신뢰할 수있는 조직 라벨 및 전 비켜 개발을 제공해야합니다. 두 가지 방법이 쉽게 사용할 수, 상대적으로 저렴한 비용으로 재료 (예, 철 분말, 폴리스티렌 microspheres)를 사용하고 morphogenesis 동안 계량하는 조직 변형을 가능하게합니다.두 경우 모두에서 조직 마커는 배아 조직에 적용하고 전문적인 장비가 필요하지 않습니다, 현장에서 이민자 이러한 실험 이용할 수 있도록 쉽고 reproducibly 수 있습니다. 머릿속 및 결과 데이터 (예 : 컴퓨팅 morphogenetic 스트레인지도하여) 분석하면 모델 시스템 6, 7, 9, 11, 12 morphogenesis의 메커니즘을 조명 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R01 GM075200 및 R01 HL083393 (LAT)에 의해 지원되었다. 우리는 NIH T90 DA022871와 방사선과의 Mallinckrodt 연구소에서 BAF를위한 친목 지원을 인정하고, 미국 심장 협회에서 부여 09PRE2060795에서 VDV하십시오.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM — high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments, Inc. | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences, Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
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- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
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