Summary
Denna artikel beskriver yta märkning och
Abstract
Embryonala epitel genomgå komplex deformationer (t.ex. böjning, vridning, vikning, och stretching) för att bilda den primitiva organ tidiga embryot. Spårning referenspunkternas markörer på ytan av dessa cellulära ark är en väletablerad metod för att uppskatta morfogenetiska storheter som tillväxt, kontraktion, och skjuvning. Men inte alla ytor märkning tekniker är lätt att anpassa till konventionell avbildning och har andra fördelar och begränsningar. Här beskriver vi två märkning metoder och illustrera nyttan av varje teknik. I den första metoden, finns hundratals fluorescerande etiketter tillämpas samtidigt på embryot med hjälp av magnetiska järn partiklar. Dessa etiketter används sedan för att kvantiteten 2-D vävnad deformationer under morfogenes. I den andra metoden, är frigolit mikrosfärer som används som kontrastmedel i icke-invasiv optisk koherens tomografi (OCT) imaging att spåra 3-D vävnad deformationer. Dessa tekniker har varit framgångsrikaly genomförts i vårt labb för att studythe fysiska mekanismer för tidig huvud gånger, hjärtat och hjärnans utveckling, och bör anpassas till en mängd processer utbud morfogenetiska.
Protocol
1. Allmänna Experimentell Förberedelser
- Förbered medelstora vävnadskultur i laminärt flöde huven.
- Späd Dulbecco ändrade Eagles Medium (DMEM) (1 L flaska med 4,5 g / L glukos, bikarbonat och L-glutamin). Tillsätt 10 ml penicillin / streptomycin / neomycin antibiotika.
- Ta 100 ml DMEM med en steril överföringspipett och ersätt med 100 ml chick serum.
- Alikvotera den DMEM/10% chick serum / 1% antibiotika till sterila 15 ml koniska flaskor och frysa.
- Förbered fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletteras med kalcium och magnesium. Blanda 100 ml 10X PBS, 900 ml avjoniserat vatten och 1 ml koncentrerad kalcium och magnesium (100 mg / ml CaCl 2 • 2H 2 O, 100mg/ml MgCl 2 • 6H 2 O).
- Inkubera ägg i en längsgående riktning till önskat stadium enligt Hamburger och Hamilton 1 (dvs 23-25 timmar för HH steg 5, eller 42-48 Timmar för HH steg 11-12).
- Ta bort embryon från ägget med hjälp av filtret metoden papperskassar.
- Spricka i botten av ägget på sidan av A150 mm petriskål. Dra isär skalet från botten och tömma innehållet i ägget i skålen.
- Ta bort tjockare, trögflytande äggvita från ägget med trubbiga pincett.
- Skär cirklar av Whatman # 2 filterpapper 2-3 cm. i diameter. Med ett och samma hål, hål i mitten av filtrerpapper. Placera en av filterpappret ringarna på gulan på ett sätt som håller embryot syns genom hålet i ringen.
- Skär runt den yttre diameter filtrerpappret med microscissors. Ta bort papperet från äggulan med fin pincett.
- Försiktigt skölja embryot i PBS för att ta bort anhängare äggula partiklar. (HH5 embryon kan behöva suga så länge som 15-20 minuter för att avlägsna rester av äggula). Ta bort filtret papper församling från badet och placera den ventrala sidan upp i en35 mm kulturen maträtt. Placera en andra filterpapper ringen ovanpå den första, sandwiching embryot mellan ringarna. Sätt en metallring runt utsidan av filtrerpappret smörgås (≈ 1,5 till 2 cm i diameter) för att säkra embryot.
- Sänk ner embryot i odlingsmedium. Verifiera korrekt morfologi och linda med en ljus fält mikroskop.
- Använd en pipett avdragare för att förbereda fina nålar spetsen glas (1,5 mm innerdiameter) (World precisionsinstrument, Sarasota FL) för senare vävnad dissektioner och märkning.
2. DII Märkning av HH Etapp 5 Embryon med magnetkamera järnpartiklar
- Tillsätt några droppar av mättat DII i alkohol för att en liten mängd järnpulver (järn reduceras, Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) i rumstemperatur och låt torka. (Detta medför oftast att partiklarna kakan ihop när alkoholen har avdunstat.) Använd spetsen på en drog mikropipett att bryta upp hopklumpade järnpartiklar,överföra dem till ett mikrocentrifugrör, och skölj dem flera gånger och täck med avjoniserat vatten.
- Att märka ektodermal celler i en HH steg 5 embryo, placera den skördade embryot (dvs hela filterpapper montering) ryggsidan upp i en 35 mm kultur skål täckt med ett generöst lager av kultur medier och sätta skålen i en dissekera mikroskop. Använd ett glas nål för att ta bort vitelline membranet och exponera ektodermal celler. (Var noga med att inte punkteras embryo.)
- Rita en kolumn av märkt järn partiklar (i avjoniserat vatten) i en pasteurpipett. Använda dissekera mikroskop, sänk pipettspetsen under vätskan ytan och position strax ovanför embryot. Rolling pipetten sakta fram och tillbaka mellan fingertopparna, trängs partiklarna ur pipiette och strö dem över embryot.
- När embryot är täckt med partiklar, försiktigt placera den i ett 37 ° C inkubator i ca 10 minuter. Ta embryo ur kuvösen enD Använd en stark magnet för att ta bort partiklar.
- Använd en fluorescerande mikroskop med tillhörande videokamera och lämpligt filter inställningar för att få både ljusa fält och fluorescerande bilder av embryot, som visas i figur 2A, B.
- Notera etiketten densitet. Om ett tätare fördelning önskas, använda ytterligare partiklar (enligt ovan) att märka embryot igen och förlänga inkubationstiden därefter. Om de etiketter som är för tät, tillsätt en liten mängd omärkta järnpartiklar till mikrocentrifugrör fyllt med redan har märkts partiklar och blanda röret innehållet. Upprepa märkning processen med ett nytt embryo och igen NOTE Tillverkare densitet.
3. Polystyren mikrosfär märkning för optisk koherens tomografi (OCT) avbildning av HH11-12 embryon
- Bered en lösning av svart 10 mikrometer diameter mikrosfärer (Polysciences Inc., Warrington, PA) i PBS i en 35 mm petriskål. (Pärlor bör vara tillräckligt stor för att skapa kontrast för oktoberavbildning, men liten nog så att pärla storlek på order av enskilda celler. Särskilda värden varierar beroende på upplösningen på din oktober systemet och vävnader som studeras). En droppe av stamlösningen (2,6% fast-latex) per mL PBS är oftast tillräckligt. Dra denna lösning i en 10cc spruta med en 22 gauge nål. Vortex lösningen i 30 sekunder för att säkerställa en enhetlig pärla distribution.
- Bevel tips av er dras glas nålar använder en dator hårddisk 2. Tips diameter bör vara tillräckligt stor för att pärlorna kan passa genom öppningen, men samtidigt, för att så små som möjligt minimera vävnadsskada såra under injektion.
- Fyll en avfasade glas nål med pärla lösning med hjälp av sprutan. Lätt knäpp på mikropipett för att säkerställa att lösningen har nått toppen.
- Med hjälp av en mikromanipulator, placera glaset nålen i samma synfält som ett embryo. Pärlor ska rinna ut ur pipettspetsen.
- Om ingen beads avsluta mikropipett kan det finnas en täppa. I detta fall, upprepa steg 3,2-3,4 med ett nytt glas nål.
- Om för många pärlor moln ditt synfält, kan din pipettspetsen vara för bred. Upprepa steg 3,2-3,4 med en ny pipett och ett nytt embryo.
- Sätt pipettspetsen in i lumen av hjärnan röret. Var noga med att inte tränga igenom ventrala golvet i vävnaden. Du kommer att se en övergående svullnad av vävnaden som pärlor och vätska in i lumen. Detta tyder på en lyckad intubering, nu, snabbt ta bort glaset nålen.
- Verifiera en tillräckligt sträng täthet i de inre lumen av hjärnan röret med hjälp av ett ljust fält mikroskop. Låt kulorna nöja 20 - 30 minuter innan du fortsätter till Sect. 4.
4. Datainsamling
* Följande metoder är väl lämpade för fluorescens märkning teknik som beskrivs ovan. Men med mikrosfär märkning tekniken kan pärlor få bort vid överföring av provermellan inkubatorer och bildsystem. I detta fall är det bäst att gå vidare till steg 4,2 (som undviker prov rörelse / agitation helt och hållet). I båda metoderna är embryon odlade medan nedsänkt i flytande odlingsmedium. Om embryot inte är helt under vatten (vilket är fallet med några konventionella tekniker vävnadsodling) är vävnad geometri kraftigt förändrad av onormalt hög belastning ytspänning och fördelningar stam kommer att misslyckas med att korrekt fånga normal 3-D morfogenes 3, 4. Dessutom dränka vävnad förhindrar den ljusa kontrast observerades vid den flytande-gas-gränssnitt under oktober avbildning från fördunklande embryonala morfologi och koordinater markör.
- Embryo Culture (allmän)
- Efter förvärvet din första bilder (ljusa fält, fluorescens, eller oktober), i upp till sju 35 rätter mm kultur (med embryon) i en 150 mm petriskål och placera hela församlingen i en liten plastpåse. Tillsätt ett par droppar av avjoniserat vatten i påsen för luftfuktningoch fyll påsen med 95% O 2 / 5% CO 2 blandning. Placera embryon till inkubator vid 37 ° C (kö Stabiletherm, Asheville, NC) för den önskade tiden till nästa avbildning tidpunkterna. Med denna metod kan experiment utföras på flera embryon i samma dag.
- Time-lapse kultur (automatiserad)
- Placera din märkt embryon i ett Delta T Dish (35 mm ytterdiameter, 23 mm centrala bländare med koniska sidoväggen, 0.17mm tjockt glas, Bioptechs, Butler, PA) som innehåller 1,2 ml odlingsmedium.
- Täck skålen med ett glaslock hålls vid 37 ° C med en Bioptechs Delta T4 Controller Kultur skålen (för att undvika kondens). Superfuse embryot med 95% O 2 / 5% CO 2 gasblandning levereras från en Mini-pump Variabel Flow-enhet (Fisher Scientific). Innan det når embryo, värme och fukta gas bubbla igenom det avjoniserat vatten på en varm (<100 ° C) värmeplatta. En schematisk av denna experimentella set-up visas i figur 1.
- Ställ in programmet att automatiskt hämta bilder på användardefinierade tidsintervall. För våra fluorescensmikroskop använder vi Openlab programvara (PerkinElmer, Waltham, MA), och för vår oktober-system använder vi svepte källa Thorlabs programvara (Newton, NJ). Eftersom denna metod är för närvarande endast kan hantera ett tidsförlopp experiment vid en tid är det oftast bäst att låta dessa typer av kulturer att köra över en natt. Man kan kringgå denna begränsning genom att installera en automatiserad översättningsbara skede kompatibel med både hårdvara och mjukvara för Imaging System 5.
5. Representativa resultat:
Etiketter spåras automatiskt (med hjälp av Volocity, PerkinElmer) eller manuellt (med hjälp av manuell Tracking plugin i ImageJ, NIH) i varje försök. I fluorescerande märkning teknik, använder vi Matlab rutin gridfit att passa 2D-ytor genom markör koordinater, vilket gör morfogenetiska yta stammar skall beräknas 6, 7. Standard ekvationer används för att omvandla dessa värden till en relevant embryonala koordinatsystem. Alternativt kan i oktober tekniken, är ytor som genereras från segmenterade bildvolymer (erhålls via standard program som Matlab eller Caret 8) och stammar skall beräknas i riktning mot högsta eller lägsta krökning av provet 9.
Vi använde vår teknik järn partikel att märka och spåra rörelse ektodermal celler under huvudet gånger bildas i början kycklingembryo. Som visas i Figur 2A var fluorescerande celler fördelade över hela embryot. Ljusa fält och fluorescerande bilder av embryot fångades vid olika intervaller under ex ovo kultur. Rörelser spårade etiketter (Fig. 2B, C) användes sedan för att beräkna den föränderliga distributioner morfogenetiska påfrestningar under huvudet gånger bildning (Fig. 2D-F).
t "> Likaså var vår polystyren mikrosfär teknik som används för att spåra vävnad rörelser i mitten hindbrain gränsen i början av chick hjärnan. Som framgår av Figur 3 BD, var sträng motioner spåras för 6 timmar och stammar som kännetecknar vävnad deformation i de längsgående och omkretsen riktningar beräknades från markören koordinater. att denna metod kan hantera tydligt 3-D deformationer som pärlor tenderar att hålla sig till alla sidor av inre lumen i hjärnan (Fig. 3A) Anm.
Figur 1. Schematisk av set-up för time-lapse vävnadskultur.
Figur 2. Kvantifiera 2-D vävnad deformationer i början kycklingembryo använda spårade fluorescerande etiketter. (A) Sammanslagen ljusa fält / fluorescerande bild av HH steg 5 embryo efter avlägsnande av järn partiklar. DII-labelED ektodermal celler (röd) är fördelade över hela embryot. (B, C) rörelse märkta celler spåras med hjälp av ImageJ. Etikett förskjutningar beräknades i embryot koordinater (X, Y). Observera att A och B är samma bild. (DF) Contour tomter i utveckling längs stam-distributioner under huvudet gånger bildas. Längsgående Lagrangian stammar har beräknats i förhållande till HH stadium 5 (dvs. A och B) efter (D) 75 min (E) 120 min, och (F) 165 min för inkubation. Dessa stammar kännetecknar längden förändringar av linje element ursprungligen orienterad längs Y-axeln (i steg 5 embryot). Ytterligare information om hur du använder spåras etiketten koordinater för att beräkna morfogenetiska stammar kan hittas i Filas et al. (2007) 6 och Varner et al. (2010) 7. Observera att C och F är samma bild. Skala bar = 500 ìm.
Figur 3. Kvantifiera 3-D vävnad deformations i början chick hjärnan. (A) Polystyren mikrosfärer som följer rygg (svart pil) och ventrala (vit pil) sidorna av hjärnan röret är lätt att urskilja från omgivande vävnader i tvärgående kors section.Ventral synpunkter oktober rekonstruktioner visar mikrosfär platser nära mitten hindbrain gränsen vid (B) HH12 och efter (C) 6 h inkubering (M: mitthjärnan, H: hindbrain). Flera grupper av pärlor beskrivs för att belysa den totala deformation av vävnad. (D) Longitudinella (E ZZ) och perifera (E θθ) Lagrangian stammar har beräknats från dessa deformationer. Positiva längsgående och negativa perifera stammar i mitten hindbrain gränsen speglar en axiell förlängning och omkretsen förkortning av denna region under kultur. Ytterligare information om beräkning av morfogenetiska stammar för komplexa ytor under morfogenes kan hittas i Filas et al. (2008) 9. Skala bar = 200 ìm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Två vävnad märkning tekniker presenteras för ex ovo kultur tidiga kycklingembryon. Den första använder fluorescerande lipofila färger levereras via magnetiska järnpartiklar att samtidigt etikett hundratals celler. Men denna metod som för närvarande inte kompatibla med optisk koherens tomografi, som fluorescerande färger i allmänhet visar lite kontrast från omgivande vävnader med 10 oktober. Därför visar vi en alternativ teknik med hjälp av polystyren mikrosfärer att märka vävnader för time-lapse oktober analys. Denna teknik ger 3-D datamängder, men man måste vara uppmärksam att inte rubba kulorna från vävnaden. Antingen med en av dessa metoder i lämpliga experimentella inställning bör tillhandahålla tillförlitlig vävnad märkning och ex ovo utveckling i tidiga embryon. Båda metoderna använder lättillgängliga och relativt billiga material (t.ex. järnpulver, polystyren mikrosfärer) och aktivera vävnad deformation att kvantifieras under morfogenes. Denvävnad markörer i båda fallen kan enkelt och reproducerbart tillämpas på embryonala vävnader och inte kräver specialiserad utrustning, vilket gör dessa experiment tillgängliga för nykomlingar på fältet. Visualisera och analysera resulterande data (t.ex. genom att beräkna morfogenetiska stam kartor) bör hjälpa belysa mekanik morfogenes i modellsystem 6, 7, 9, 11, 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av NIH bidrag R01 GM075200 och R01 HL083393 (LAT). Vi erkänner gemenskap stöd för BAF från NIH T90 DA022871 och Mallinckrodt Institutet för radiologi, och för VDV från Grant 09PRE2060795 från American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM — high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments, Inc. | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences, Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
- Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
- Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
- Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
- Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
- Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
- Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
- Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
- Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).
