Summary
我们描述了一个多重PCR快速检测沙门氏菌血清型肠炎，哈达尔，海德堡和鼠伤寒沙门氏菌。具体的沙门氏菌血清型，可确定的目标是多重PCR技术，以独特的O -抗原生物合成集群和一个给定的血清型的鞭毛的基因和序列。血清型，然后分配到一个隔离基础上的具体化，规模扩增产物（PCR产物）对应的目标等位基因外观的沙门氏菌。
Abstract
当前商业PCR的测试， 确定沙门氏菌靶基因，该属植物所特有的。但是，有两个品种，6个亚种，超过2500 种沙门氏菌血清型，而不是所有的都在他们的意义，等于对公众健康。例如，发现S。肠道亚种 IIIA亚利桑那州的一个表上鸡蛋层农场相比是微不足道的孤立的S.肠道亚种我沙门肠炎，沙门氏菌病的挂表鸡蛋消费的首要原因。血清型抗原的差异，在脂多糖（LPS）（O抗原）和鞭毛（H1和H2抗原）的基础上确定。这些抗原的差异与此表型的基因及相关基因的等位基因多样性的外观。
我们已经开发出一种allelotyping，多重PCR键上的四个主要南之间的遗传差异在家禽肠道亚种我血清型的发现和与重大人类疾病在美国相关。 PCR引物对目标的关键基因，或到一个特定的沙门氏菌血清型的独特序列，旨在产生一个大小为特定的基因或等位基因的扩增 。，沙门氏菌血清型分配到隔离PCR检测结果，结合具体脂多糖鞭毛蛋白基因的等位基因。本文中描述的多重PCR的具体检测的S.肠道亚种我血清型肠炎，哈达尔，海德堡，和鼠伤寒沙门氏菌。
在这里，我们将演示如何使用多重PCR反应，以确定为沙门氏菌的血清型隔离。
Protocol
1。 PCR模板的制备
注：为了尽量减少PCR结转污染，重要的是要保持几个重要的PCR从一个物理分离的关键步骤：1）模板（DNA）的准备工作，2）PCR设置，和3）凝胶电泳。此外，还建议使用屏障提示，以防止pipetters文化或试剂污染。
- 从一个单一的孤立的殖民地隔离，接种1毫升卢里亚Bertani肉汤或其他复杂的介质（脑心浸液，Superbroth 等 ） ，沙门氏菌。培养过夜在37 ° C。
- 1毫升无菌1.5毫升容量离心管，离心细菌的细胞悬液，在4500〜2分钟XG。沉淀细胞。
- 弃上清，悬浮细胞沉淀在室温为10分钟，100％的乙醇和设置在1毫升。前（4500 XG，2分钟）。颗粒细胞，取出1毫升PBS上清，悬浮细胞。
- 离心机细胞（4500 XG，2分钟），弃上清和悬浮细胞，在1毫升无菌DH 2 O
- 最终的细胞悬液，1 / 20稀释DH 2 O（5μl/95μL生署2 O），并保存在-20 ° C 。在-20 ° C的全细胞PCR模板的保质期是一个月左右。
2。 PCR检测设置
注意：需要在PCR / UV工作站专用的最好做一个物理上独立的房间进行PCR反应混合物（模板，缓冲区，oligonucletoideprimers，核苷酸和Taq DNA聚合酶）的制备和配药。
注：PCR扩增成立房间还必须指定-20 ° C冰箱储存PCR试 剂（缓冲区，寡核苷酸引物和核苷酸），酶和模板自成体系，专用pipetter PCR设置，一次性乳胶手套实验室大衣，阻隔提示，酶标板，玻璃毛细管，离心管，净化表面的漂白剂10％。使用专用的pipetter设置（P10，P100和P1000）免除PCR试剂。此吸管设置必须永远离开工作站设置。
注：获得分子生物学PCR级DH 2 O和分装1毫升到1.5毫升容量的离心管。免除每次使用后，以避免可能的交叉污染，分装 生署2。类似的方法，建议与其他PCR试剂。
注：与紫外光照射和/或10％漂白水擦拭表面使用前的净化工作区。在执行PCR检测设置，穿实验室外套和乳胶手套。最小化来回从PCR扩增交通设置PCR反应在thermocylcer和PCR产物（扩增）琼脂糖凝胶上分离培养的领域。如果你去到PCR设置区域，处置一双乳胶手套，你正在穿，穿上一双新的手套。
- 请在DH 2 O浓度5X10 -4米的主引股票稀释1 / 20，DH 2 O（5μl/95μL生署2 O 25微米）引物。表1描述了每个鞭毛打字引物的寡核苷酸序列。
- 从-20 ° C冰箱检索PCR试剂和模板，并允许试剂和样品在冰上解冻。 Taq DNA聚合酶，直到需要留在冷冻。
- 免除allelotyping PCR反应在表1中所描述的混合试剂。
- 免除到每个10圆底井PCR反应混合物9μl，在无菌，96孔，聚苯乙烯微孔板，在列的顶部（如A1），并开始向下移动列的顶下。
- 加入1μL生署2 9μLPCR混合物（无DNA控制）的第一口井（A1），阳性对照模板（0.5μLI /克，米打字引物，鼠伤寒沙门氏菌和肠炎; r/z10打字引物海德堡和哈达尔和1,2 / E，N，x分型引物，鼠伤寒沙门氏菌和哈达尔）微升至9日在第2次PCR拌匀（B1）的，1μL大肠杆菌K12DH5α中的在第三口井9毫升（C1）的PCR混合物。
- 对于每个额外的井（D1 - H1的A2，B2），加1μL解冻的样品模板9μLPCR反应混合物。对于I / G，M allelotyping PCR技术，S.沙门鼠伤寒沙门氏菌（I）和肠炎（G，M）作为阳性对照， 沙门氏菌血清型海德堡（R）和哈达尔（Z10）R / Z 10 allelotyping多重PCR阳性对照。
- 放入指定的爱达荷州技术Rapidcycler（8）持有10μL容量的玻璃毛细管。
- 一旦持有人担保，加载每个PCR反应混合物的玻璃毛细管触摸到毛细管微孔板底部井。持有人倾斜，使液体向下移动管，并提供空间之间的两端和前热封丁烷火炬玻璃管密封的毛细血管两端的PCR混合物。
- 放入爱达荷州技术Rapidcycler毛细管和持有和使用表1中描述的不同allelotyping引物运行的PCR热循环方案。
- 凝胶电泳步骤的热循环程序完成时继续执行。
3。凝胶电泳
注意：穿不同的白大褂电泳实验室使用指定的和一次性乳胶手套一双新。
注：戴防紫外线护目镜或面罩，总是处理溴化乙锭，特别是琼脂糖凝胶手套。
- 准备100毫升熔融1.5％（W / V）分子生物学级琼脂糖1xTAE（或1X TBE）电泳缓冲液多次在定期的视觉设置为2-5分钟的间隔在20％的功率有微波炉加热的琼脂糖悬浮（7）检查。熔化琼脂糖，直到它达到平衡的水浴温度设定在60℃水浴。
- 设置梳浇筑前熔化琼脂糖凝胶模具。选择一个有足够的牙胶梳产生足够的控制，样品，并至少有3分子量标准的目的和琼脂糖凝胶中的配售井。
- 添加溴化乙锭的2μL（10毫克/毫升）100毫升熔融1.5％（W / V）1xTAE琼脂糖（或简称TBE），轻轻漩涡瓶混合，避免产生气泡，轻轻倒入瓶中的内容到15 10厘米琼脂糖凝胶的凝胶模具中。用卫生纸或纸巾的边缘，在琼脂糖凝胶中删除任何气泡。
- 让凝胶在室温下模具，直到琼脂糖凝固（约30-45分钟）。转移与凝胶梳潜水，水平电泳室，含有1X TAE（或1X TBE）电泳缓冲液的凝胶托盘。轻轻取出梳子从琼脂糖凝胶。
- 检查的凝胶托盘相对的阴极或阳极电泳室，以确保这个极点在凝胶底部的位置。注意：请记住带负电荷的DNA向阴极迁移（即“红色”）。
- 预混料200μLDNA分子量标记6X DNA上样染料与40μL（0.25微克/微升）。 4.8μL预混的DNA分子量标记第十四负载第一，中间和最后一个井。
- 以及2起，并推进到每个后续以及由左到右，移动负载的PCR样本。避免加载任何含有分子量标准井的样品。
- 要加载在每个玻璃毛细管中的样品：
- 删除其持有和蚀刻毛细管与玻璃切割机的两端的每个毛细血管。
- 显着的毛细血管玻璃切割机两侧放置双手的拇指和食指上，单元的毛细血管。
- PCR反应混合物放置在年底相反毛细管分配器和缓缓转动柱塞顺时针旋转，直到液体在管的底部。
- 放入要加载以及毛细血管和慢慢转动顺时针方向转动柱塞免除琼脂糖以及聚蔗糖加权样本。要小心，不要穿刺以及与毛细管或转动太多过去，当最后的液体使毛细血管以及引入气泡。
- 一旦被加载，所有的样品和标准设定的恒压电源为90 V（9伏/厘米琼脂糖凝胶）。
- 停止电泳的黄色染料（Taurazine）前一次是从凝胶底部1厘米。
- 一旦完成电泳，凝胶转移到紫外透射可视化的DNA片段，分子量标准。对宝丽来胶片拍摄的图像，使用橙色玻璃过滤器（设置：2个和4.5 Ÿ）宝丽来相机或热敏打印机使用的CCD相机和打印图像的数字图像。
- 放置在10％为15-30分钟漂白的毛细血管的持有人。与卫生署2 O和回原位PCR设置房间空气干燥冲洗3次。
4。代表多重PCR检测结果
allelotyping 沙门氏菌的PCR结果株1-10显示在图1（3-12车道），解释如下。 O等位基因指定沙门氏菌隔离的基础上扩增（PCR产物）匹配大小的PCR控制和预测为O等位基因引物集（3）：B - 560bp，C1 - 340bp，C2 - 400 BP， D1 - 620 bp，而E1 - 280 BP。对于与O allelotyping PCR（图1A），我们分配的O等位基因B（车道10菌株 -13），C1（7-9车道），C2（泳道4，5），D1（泳道3），E1（6车道）的十个沙门氏菌株车道3-12测试。这些相同的沙门氏菌株进行了测试，在相同的顺序如图。 1A，为H1等位基因I，G，M，R; Z10（图1B，C），。再次，H1等位基因是分配给每个隔离依赖于存在一个匹配的扩增片段大小的PCR控制和预测为4 H1等位基因引物集（3）：I - 510 BP（图1B，2巷）; G，M - 310 BP（图1B，2巷），R - 170 BP（图1C，2巷）;和Z10 - 360 BP（图1C，2巷）。 H1的等位基因被分配到10 个沙门氏菌分离：I -隔离3和8（图1B，5和10车道），G，M - 1菌株和5（图1B，泳道3和7）， R株6和9（图1C，泳道8及11条）;和Z10株2，7，和10（图1C，车道4，9，12） 沙门氏菌隔离4负四个H1的测试等位基因。最后， 沙门氏菌株进行了测试1,2 H2等位基因的PCR; 1,5; 1,6; 1,7抗原复合物，E，N，X，E，N，Z15抗原复合物。引物为H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7复杂和H2 E，N，X，E，N，Z15复杂，产生290 bp和150 bp的扩增产物，分别为（3）。引物不能区分具体的H2等位基因，不论是在H2抗原复杂的分配一个明确的等位基因类型，当然。 1,2，隔离（3） 沙门氏菌株4，6，8-10 1,2与H2 H2等位基因阳性; 1,5; 1,6; 1,7抗原复合物，而菌株2和7例阳性E，N，X H2等位基因;，E，N抗原复合物，Z15（数据未显示）。虽然沙门氏菌株1，3，和5负两个H2抗原复合物，只有隔离1和5负H2的鞭毛蛋白，作为确定使用一个通用的H2鞭毛PCR（1）（数据未显示）。这些结果总结在表2推定的沙门氏菌血清型，分配给每个隔离。
图1。多重PCR，确定具体的O和H等位基因与S 哈达尔，海德堡和鼠伤寒沙门氏菌肠炎血清型肠炎 （一）O等位基因多重PCR。 （B，C）H1等位基因识别鞭毛蛋白等位基因多重PCR：I / G，M（B）和r/z10（三）。泳道1和13：100 bp的阶梯（Promega公司;麦迪逊，威斯康星州）;巷2：O等位基因多重PCR控制I / G，M（B）和B，C1，C2，D1，E（A），H1的等位基因H1等位基因r/z10（C），和车道3-12： 沙门氏菌株1-10（见表2）。
| PCR扩增预混试剂 | 热循环仪（Rapidcycler） | ||||
| 试剂 | 成分/浓度 | 金额 | 参数 | 预期大小 | |
| H1 I / G，M | |||||
| DH 2 O | 63μL | 计划1 | 94 ° C，1分钟 | ||
| 10X PCR缓冲液 | 20毫米氯化镁2 | 10μL | 计划2 | 94 ° C，1秒 | |
| 500 mMTris PH8 | 55℃1秒 | ||||
| 2.5 mg / ml的BSA | 72℃20秒 | ||||
| 5％聚蔗糖400 | 40个循环 | ||||
| 10 mMTartrazine | 斜率= 2.0 | ||||
| 底漆我（F）* | AACGAAATCAACAACAACCTGC | 2μL | 计划3 | 72℃4分钟 | 510 BP |
| 入门I（R）* | TAGCCATCTTTACCAGTTCCC | 2μL | |||
| 底漆G，M（F）* | GCAGCAGCACCGGATAAAG | 2μL | 310 BP | ||
| 底漆G，M（R）* | CATTAACATCCGTCGCGCTAG | 2μL | |||
| 二甲基亚砜 | 5μL | ||||
| 的dNTP | 10毫米 | 2μL | |||
| Taq酶 | 5个单位/μL | 2μL | |||
| 90μL | |||||
| H1 R / Z 10 | |||||
| DH 2 O | 55μL | 计划1 | 94 ° C，1分钟 | ||
| 10X PCR缓冲液 | 30毫米氯化镁2 | 10μL | 计划2 | 94 ° C，1秒 | |
| 500 mMTris PH8 | 55℃1秒 | ||||
| 2.5 mg / ml的BSA | 72℃20秒 | ||||
| 5％聚蔗糖400 | 40个循环 | ||||
| 10 mMTartrazine | 斜率= 2.0 | ||||
| 引物R（F）* | CCTGCTATTACTGGTGATC | 4μl | 计划3 | 72℃4分钟 | 170 BP |
| 引物R（R）* | GTTGAAGGGAAGCCAGCAG | 4μl | |||
| 引物 Z 10（F） * | GCACTGGCGTTACTCAATCTC | 4μl | 360 BP | ||
| 底漆Z 10（R）* | GCATCAGCAATACCACTCGC | 4μl | |||
| 二甲基亚砜 | 5μL | ||||
| 的dNTP | 10毫米 | 2μL | |||
| Taq酶 | 5个单位/μL | 2μL | |||
| 90μL | |||||
| PCR扩增预混试剂 | 热循环仪（Rapidcycler） | ||||
| 试剂 | 成分/浓度 | 金额 | 参数 | 预期大小 | |
| H2的1,2 / E，N，X | |||||
| DH 2 O | 63.6μL | 计划1 | 94 ° C，1分钟 | ||
| 10X PCR缓冲液 | 20毫米氯化镁2 | 10μL | 计划2 | 94 ° C，1秒 | |
| 500 mMTris PH8 | 55℃1秒 | ||||
| 2.5 mg / ml的BSA | 72℃20秒 | ||||
| 5％聚蔗糖400 | 40个循环 | ||||
| 10 mMTartrazine | 斜率= 2.0 | ||||
| 引物1,2（F） * | AGAAAGCGTATGATGTGAAA | 2μL | 计划3 | 72℃4分钟 | 290 BP |
| 引物1,2（R） * | ATTGTGGTTTTAGTTGCGCC | 2μL | |||
| 底漆发送，N，X（F）* | TAACTGGCGATACATTGACTG | 2μL | 150 BP | ||
| 底漆发送，N，X（R）1 | TAGCACCGAATGATACAGCC | 2μL | |||
| 二甲基亚砜 | 5μL | ||||
| 的dNTP | 10毫米 | 2μL | |||
| Taq酶 | 5个单位/μL | 2μL | |||
| 90μL | |||||
| 通用氢气 | |||||
| DH 2 O | 72μL | 计划1 | 94 ° C，1分钟 | ||
| 10X PCR缓冲液 | 30毫米氯化镁2 | 10μL | 计划2 | 94℃10秒 | |
| 500 mMTris PH8 | 45℃10秒 | ||||
| 2.5 mg / ml的BSA | 72℃35秒 | ||||
| 5％聚蔗糖400 | 40个循环 | ||||
| 10 mMTartrazine | 斜率= 2.0 | ||||
| 底漆fljB（F）* | CAAGTAATCAACACTAACAGTC | 2μL | 计划3 | 72℃4分钟 | 1500 BP |
| 底漆fljB（R）* | TTAACGTAACAGAGACAGCAC | 2μL | |||
| 的dNTP | 10毫米 | 2μL | |||
| Taq酶 | 5个单位/μL | 2μL | |||
| 90μL | |||||
表1。 沙门氏菌的flagellinallelotyping PCR协议组成，条件和预期的结果。
* PCR引物工作的股权集中度为25微米
| 隔离 | O等位基因 | H1的等位基因 | H2等位基因 | 血清型 | |||||||||
| 乙 | C1 | C2 | 首长级薪级第1点 | Ë | 我 | G，M | ř | Z10 | 1,2，1,5，1,6，1,7 | E，N，X，E，N，Z15 | 通用1 | ||
| 1 | - | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | 肠炎 |
| 2 | - | - | + | - | - | - | - | - | + | - | + | + | 哈达尔/伊斯坦布尔3 |
| 3 | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | + | 肯塔基州 |
| 4 | - | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - | + | 未知 |
| 5 | - | + | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - | 蒙得维的亚 |
| 6 | - | + | - | - | - | - | - | + | - | + | - | + | 2 Infantis或魏尔啸 |
| 7 | - | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | + | 姆班达卡 |
| 8 | + | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | + | 鼠伤寒沙门氏菌 |
| 9 | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | - + | 海德堡 | |
| 10 | + | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | + | 海法 |
表2。 Allelotyping PCR结果（图1）和沙门氏菌血清型指定的鉴定为O，H1和H2等位基因
> 1 H2 PCR扩增产生一个1.5 kb的扩增，所有拥有H2的鞭毛沙门氏菌，无论H2等位基因（1） 。这PCR是用来区分单相双相沙门氏菌 。
2 H2的多重PCR不能区分不同的等位基因的H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7抗原复合物（3）。
3 S 的噬菌体转换沙门哈达尔改变脂多糖O抗原产生血清型伊斯坦布尔。 Ø allelotyping PCR无法分辨这些细微的遗传/抗原的变化。
| 血清型1 | O等位基因 | H1的等位基因 | H2等位基因 | |||||||||
| 乙 | C1 | C2 | 首长级薪级第1点 | Ë | 我 | G，M | ř | Z10 | 1,2，1,5，1,6，1,7 | E，N，X，E，N，Z15 | 通用2 | |
| 加利福尼亚州 | + | - | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - |
| 鼠伤寒沙门氏菌 | + | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | + |
| 海德堡 | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | - | + |
| 海法 | + | - | - | - | - | - | - | - | + | + | - | + |
| 蒙得维的亚 | - | + | - | - | - | - | + | - | - | + | - | + |
| Othmarschen | - | + | - | - | - | - | + | - | - | - | - | - |
| Athinai | - | + | - | - | - | + | - | - | - | - | + | + |
| Papuana | - | + | - | - | - | - | - | + | - | - | + | + |
| 姆班达卡 | - | + | - | - | - | - | - | - | + | - | + | + |
| Chincol | - | - | + | - | - | - | + | - | - | - | + | + |
| 肯塔基州 | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - | + |
| 哈达尔/伊斯坦布尔3 | - | - | + | - | - | - | - | - | + | - | + | + |
| 肠炎 | - | - | - | + | - | - | + | - | - | - | - | - |
| 芙蓉 | - | - | - | + | - | + | - | - | - | + | - | + |
| Campinense | - | - | - | + | - | - | - | + | - | - | + | + |
| 洛美 | - | - | - | + | - | - | - | + | - | - | - | + |
| 波特兰 | - | - | - | + | - | - | - | - | + | + | - | + |
| 卢安达 | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - | + | + |
| Treguier | - | - | - | + | - | - | - | - | + | - | - | + |
| 西米 | - | - | - | - | + | - | - | + | - | - | + | + |
| Weltevreden | - | - | - | - | + | - | - | + | - | - | - | + |
| 克里斯蒂安斯塔德 | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | + | + |
| 比夫拉 | - | - | - | - | + | - | - | - | + | - | - | + |
表3。Allelotyping PCR检测所确定的沙门氏菌血清型
1以粗体突出的血清型是较常用的诊断或食品微生物学实验室中遇到的。
2 H2的PCR产生一个所有拥有H2的鞭毛的沙门氏菌的1.5 kb的扩增，不管H2等位基因（1 ）。这PCR是用来区分单相双相沙门氏菌 。
3 S 的噬菌体转换沙门哈达尔改变脂多糖O抗原产生血清型伊斯坦布尔。 Ø allelotyping PCR无法分辨这些细微的遗传/抗原的变化。
Discussion
大多数市售的PCR试 验检测沙门氏菌的目标属独特的基因（ 如入侵） 。然而，并非所有的沙门氏菌是导致人类或动物种群的流行疾病的能力是平等的。早期识别沙门氏菌脂多糖O抗原和flagellinH1和H2抗原的抗原差异导致分化成基于这些抗原的差异超过2500 血清型沙门氏菌。有46个不同的O抗原和86不同的鞭毛（H） 抗原属沙门氏菌中发现沙门氏菌可能拥有一（H1）或两个不同的（H1和H2 ）flagellins。今天的O，H1和H2抗原为2500 沙门氏菌血清型的不同组合确认。一个血清型，是基于个人的O和H抗原识别所得的抗原公式分配。抗原公式写为O：H1：H2和“ - ”，是指没有O -抗原阴性沙门氏菌鞭毛蛋白H1或H2和“NT”（非typeable）。例如，血清型鼠伤寒沙门氏菌被分配到一个S。肠道分离的抗原性配方B：我：1,2的肠炎是一个孤立的公式D1：G，M： - 。这种沙门氏菌人口的抗原变异是在核苷酸水平上，因此可以很容易地利用PCR扩增的差异的外在表现。
我们已经确定与特定的O和H等位基因的遗传差异，发展allelotyping PCR 检测 ，确定S. 肠炎血清型：肠炎，哈达尔，海德堡和鼠伤寒沙门氏菌（3）。正确分配和沙门氏菌的血清型的报告要求，测试与O相关联的所有等位基因：H1：为肠炎H2抗原公式（首长级薪级第1点：G，M： - ），哈达尔（C2：Z10：E，N，X），海德堡（二R：1,2），鼠伤寒沙门氏菌（B：我：1,2）。没有知识O等位基因或抗原，发现的H1克，M等位基因单独并不一定确定隔离其他的沙门氏菌血清型肠炎沙门氏菌：戈纳，加利福尼亚州和蒙得维的亚，也具有这种相同的等位基因。虽然allelotyping PCR技术最初是设计，检测中脱颖而出提及沙门氏菌血清型，这种测试可以找出另外19个血清型（见表3） 。最初的设计我们的allelotyping PCR检测O和H等位基因。在实践中，它已经变得更加实际和具有成本效益，为我们确定的O -抗原玻片凝集试验，使用O型特异性抗血清，而不是执行的O allelotyping PCR分离出沙门氏菌文化工作时。不过，我们建议使用O allelotyping PCR检测，如果你的实验室使用屏幕（2） 或输入沙门氏菌株FTA卡（6）提交本项PCR，并包括与样品的第一个屏幕中的沙门氏菌特异性PCR（4 ）。限制allelotyping PCR的只有那些被确定为沙门氏菌 PCR或生化/抗原测试样本。
在这篇文章中描述的协议已经使用爱达荷州技术Rapidcycler，热空气的热循环，允许一个规模低于许多加热块热循环时间的反应体积和运行反应条件进行了优化。为了适应这个协议与使用加热块热循环，可能需要优化反应条件，退火温度的降低/提高经验，调整引物浓度;或调整MgCl 2的浓度。例如，我们不得不适应的MJ研究的PTC - 200热循环如下协议。工作表1中描述的卷相同的反应，股市的工作concentrationof我引物稀释至2.5微米，退火温度降至55 ° C至45 ° C和变性的孵育时间，退火和延伸步骤I / G，M allelotyping PCR技术被延长至20秒。拥有适当的正面和负面的控制是必不可少的任何PCR最初的启动和优化，包括发布的协议。我们建议获取已知的沙门氏菌血清型，专门Anatum（E1：E，H：1,6），肠炎（首长级薪级第1点：G，M： - ），哈达尔（C2：Z10：E，N，X），海德堡（B： R ：1,2），蒙得维的亚（C1：G，M，S：1,2,7）和鼠伤寒沙门氏菌（B：我：1,2）;和实验室大肠杆菌 K12菌株（DH5α中，LE393，JM109等。 ）分别为本文中所描述的allelotyping PCR试验阳性和阴性对照。这些沙门氏菌血清型，将作为积极或消极的控制，取决于测试的等位基因。
，同时执行这和任何其他诊断PCR需要遵循一定的预防措施和指引。首先，物理分离模板制备，PCR设置，凝胶电泳的关键是防止可能的PCR结转污染和误报的错误报告。此外，加入适当的控制是有必要在任何常规PCR，确定这些控制出现的问题，因为他们和协助解释结果（5）。最重要的，一致性是至关重要的，尤其是关于扩增（PCR产物）扩增大小的检测andestimation电泳条件。为了说明这一点，我们特意暂停电泳早在图1A打算。分子量标准（泳道1和13）和阳性对照（2巷）没有充分分开，准确估计大小或观察那里有小的差异，在尺寸（〜50个基点）的DNA片段的分离。充分分离的DNA片段，尤其是分子量标准，是必不可少的报告阳性是依赖于扩增的大小和区分“真阳性”，有时是在日常运行的任何PCR（5观察非特异性扩增产物的准确估计）。例如，在图1B，7巷的大小（约700 bp）的非特异性扩增。电泳被终止太早，当染料前端的中途点，在琼脂糖凝胶，将有500 bp和700 bp的DNA片段之间的小分化。因此，在7巷样本已被错误地报告为阳性，我和G，M等位基因。
最后，需要认识到测试与任何相关的限制。几个H1/H2 allelotyping PCR没有歧视性的权力，以辨别微妙的遗传等位基因的差异，属于H2的1,2，1,5，1,6，1,7抗原复合物; E，N，X / E ，N，Z15抗原复合物和H1摹抗原复杂，其中包括G，M等位基因。一个或两个氨基酸的变化，占目前在这些鞭毛抗原不同表位。因此，很难为我们设计引物，就可以利用这些有时在鞭毛蛋白基因序列（3）单碱基对差异。例如，都柏林沙门氏菌血清型（首长级薪级第1点：G，P： - ）和伯塔（D1：F，G，T： - ）也与我们克PCR阳性，mallelotyping引物。 H2的allelotyping引物不能区分的鼠伤寒沙门氏菌（B：1,2：我）从拉各斯（B：我：1,5），海德堡（B：R：1,2）从布拉德福德（乙：R：1,5）， Winneba（B：R：1,6），或圣雷莫（乙：R：1,7），或哈达尔（C2：E，N，X：Z10）从Glostrup（C2：Z10：Z15 E，N，）。虽然遇到一些这些血清型的可能性：拉各斯，布拉德福德，Winneba，圣雷莫或Glustrup是远程的，它是一种可能性，并要求提供的测试限制或其他确证试验免责声明。
总之，这种基于PCR的血清分型迅速识别S.哈达尔，海德堡和鼠伤寒沙门氏菌， 肠炎血清型肠炎，和O，H1，H2等位基因与增设19个血清型。这种检测是一种快速，成本效益的替代传统的微生物方法血清型沙门氏菌。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作一直由美国农业部资助1999-35212-8680，2005-01378，并2010-04288-01，美国农业部方程式基金和格鲁吉亚的兽医农业研究资助国家的支持。本出版物中描述的协议，开发研究课程的一部分，基因4960H MIBO 4900L，BCMB 4960L，4960H BIOL在佐治亚大学的本科生使用几个分子流行病学研究项目的学生在毛雷尔实验室。我们要感谢支持我们的努力，将与研究本科教学，已经执行了毛雷尔和李实验室研究，许多本科生和我们的系主任，约翰Glisson。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Bertani | Fisher Scientific | (or any comparable source) | |
| Microfuge tubes | Fisher Scientific | 1.5 ml capacity | (or any comparable source) |
| Ethanol | Fisher Scientific | 200 proof | (or any comparable source) |
| dH2O | Sigma-Aldrich | Molecular Biology Grade | (or any comparable source; PCR only) |
| 10 x PCR Buffer: | Idaho Technologies | 20 mM MgCl2 | (buffer comes with BSA, Ficoll and Tartrazine) |
| 30 mM MgCl2 | |||
| 40 mM MgCl2 | |||
| PCR primers | |||
| DMSO | |||
| dNTP | Roche Group | (or any comparable source) | |
| Taq DNA Polymerase | Denville Scientific | (or any comparable source) | |
| Capillary pipettes | Idaho Technologies | 10 µl volume | |
| Rapid Cycler | Idaho Technologies | ||
| Agarose | Bio-Rad | Low EEO; Molecular Biology Grade | (or any comparable source) |
| 50 X TAE Buffer or 5X TBE Buffer | Fisher Scientific | (or any comparable source) | |
| Ethidium bromide | Bio-Rad | (or any comparable source) | |
| Horizontal, submersible gel electrophoresis chamber with gel mold | Bio-Rad | (or any comparable source) | |
| Power supply | Bio-Rad | (or any comparable source) | |
| Molecular Imager Gel Doc System | Bio-Rad | (or any comparable source) | |
| Table 4. Materials | |||
References
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