Profilage voltage-dépendants expression d'ARNm de potassium dans les neurones Canal nigrales utilisant une seule cellule de RT-PCR

Summary

Les neurones sont d'abord caractérisé électrophysiologique. Puis le cytoplasme du neurone enregistré est aspiré et soumis à une transcription inverse-PCR afin de détecter l'expression des ARNm des enzymes de synthèse des neurotransmetteurs, des canaux ioniques et les récepteurs.

Abstract

Dans le système nerveux central des mammifères, les différents types de neurones avec diverses caractéristiques moléculaires et fonctionnelles sont entremêlés les uns avec les autres, difficiles à séparer et également pas facilement identifiables par leur morphologie. Ainsi, il est souvent difficile d'analyser l'expression génique dans un type de neurone spécifique. Ici, nous documenter une procédure qui combine les techniques de la cellule entière patch clamp enregistrement avec une seule cellule de réaction transcription inverse polymérase (SCRT-PCR) pour le profil d'expression d'ARNm dans différents types de neurones dans le locus niger substantielle. Les techniques électrophysiologiques sont d'abord utilisés pour enregistrer les propriétés neurophysiologiques et fonctionnelle des neurones individuels. Ensuite, le cytoplasme des neurones seule électrophysiologiquement caractérisé nigrales est aspiré et soumis à des SCRT-PCR pour obtenir des profils d'expression d'ARNm des enzymes de synthèse de neurotransmetteurs, les récepteurs et canaux ioniques. La sélectivité et une sensibilité élevées rendent cette méthode particulièrement utile lorsque l'immunohistochimie ne peut pas être utilisée en raison d'un manque d'anticorps approprié ou le niveau faible expression de la protéine. Cette méthode est également applicable à des neurones dans des zones du cerveau.

Protocol

1. La préparation de tranches de cerveau

1. Jeunes (15-40 jours) mâles et femelles Sprague-Dawley sont utilisés. (Nous utilisons également ce même protocole chez la souris.) Sous anesthésie profonde uréthane, les animaux sont décapités et le cerveau est rapidement disséqué. Puis de 300 um d'épaisseur des tranches de cerveau contenant la partie coronale midrostral du locus niger sont coupés sur une vibratome Leica (VT-1200S). La tranche de coupe procédure est effectuée dans une glace froide, saccharose oxygénée couper solution contenant (en mm): 220 de saccharose, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 _NaHCO3, 0,5 _{CaCl2, MgCl2} 7, 10 D- glucose. Il fait barboter avec un mélange de 95% de CO O ₂ / 5% ₂ pour garder oxygénée et maintenir le pH à 7,4. Conserver la solution de coupe glacée pendant toute la procédure.
2. Les tranches de cerveau sont incubés dans une chambre d'incubation rempli d'un liquide céphalo-rachidien oxygénée artificiel (ACSF) contenant (en mM): 125 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 _NaHCO3, 2,5 _CaCl2, 1,3 MgCl _2, 10 D-glucose. Il fait barboter avec un mélange de 95% de CO O ₂ / 5% ₂ pour garder oxygénée et maintenir le pH à 7,4. La température d'incubation est de 34 ° C pendant 45 min puis à température ambiante jusqu'à ce que la tranche de cerveau est transférée à la chambre d'enregistrement.

2. Empreintes électrophysiologique des neurones nigrales

1. Une tranche de cerveau est transféré à une chambre d'enregistrement patch clamp continuellement perfusées avec le aCSF oxygénée à 32 ° C.
2. Pipettes de patch sont retirés de l'autoclave borosilicate (KG-33) tube capillaire en verre (1,10 mm di, 1,65 mm de diamètre extérieur, le roi de précision en verre, de Claremont, Californie) à l'aide d'un tire-PC-10 (Narishige, Tokyo, Japon) et rempli de solution intracellulaire préparés avec de la DNase-eau sans RNase (Fisher Scientific) (contenant 135 mM de KCl, 0,5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl _2, pH ajusté à 7,3). Les pipettes de patch ont des résistances de 2-3 MQ dans le bain.
3. La substantia nigra est identifié en fonction de sa localisation anatomique distincte (Fig. 1A1-2). Sous la direction visuelle d'un microscope vidéo (Olympus BX51W1) équipé d'une optique Nomarski et 60X objectif à immersion d'eau, de grandes cellules dans la substance noire pars compacta (SNC) et la substantia nigra pars reticulata (SNR) (possible neurones DA et les neurones GABA) sont sélectionnés pour l'enregistrement. Conventionnel giga-ohms étanchéité configuration cellule entière est obtenue (Fig. 1B1). Courant analyses pince de serrage et de tension peut être effectuée. Afin de minimiser la dégradation de l'ARNm, l'enregistrement électrophysiologique doit être brève (≤ 5 min). Une option consiste à enregistrer seulement la membrane et les propriétés de dopage de fournir des empreintes digitales électrophysiologiques pour les neurones des intérêts (Fig. B2-3). Cet enregistrement ne prend que brève environ 1 min.

3. L'aspiration Cytoplasme

1. Après les empreintes digitales et la caractérisation électrophysiologique des neurones GABA et SNr DA, la bouche d'aspiration douce est appliquée pour aspirer le cytoplasme. Le noyau de la cellule peut aussi être aspiré, résultant de la contamination d'ADN génomique. L'étanchéité ne doit pas être brisée; les débris contraire extracellulaires dont l'ARNm peut être aspiré dans la pipette de patch et de contaminer le contenu de la cellule. L'intégrité de l'étanchéité est bonne tant que l'augmentation du courant de maintien à -70 mV ne dépasse pas 100 pA.
2. Ensuite, le contenu de la cellule aspiré est expulsé dans un tube de 0,2 ml par PCR en cassant la pointe de la pipette et une faible pression positive. Un contenu cellulaire est recueilli dans un tube PCR. Après avoir accepté le contenu de la cellule, le tube collecteur PCR, pré-refroidi sur la glace, est immédiatement placé dans un congélateur à -20 ° C.
3. Afin d'exclure la contamination de débris extracellulaires qui peuvent contenir des ARNm, la pipette de patch est descendue dans le tissu sans réellement aspirer le cytoplasme, puis le contenu de la pipette est soumis à la RT-PCR.

4. La transcription inverse (RT)

1. Après avoir recueilli le contenu des cellules à partir d'un nombre raisonnable de neurones, habituellement 10-20, RT devrait commencer immédiatement pour minimiser la dégradation des ARNm.
2. Puisque la quantité de contenu de la cellule à partir d'un seul neurone est trop petit, la procédure d'isolement d'ARN n'est pas effectuée. Pour retirer l'ADN génomique contaminant potentiels, le contenu de la cellule aspiration est d'abord digéré par la DNase I (5 uL DNase I et 1,6 uL de tampon DNase I, 5 min à 25 ° C). Puis DNase I est inactivé par addition de 1,2 uL 25 mM d'EDTA et incubation à 75 ° C pendant 5 min.
3. L'ADNc est synthétisé en utilisant l'exposant III de la transcriptase inverse des cellules à base-Direct kit de synthèse d'ADNc (Invitrogen, tableau 1). Premier volet d'ADNc est synthétisé à 50 ° C pendant 50 min, puis la réaction est inactivée par incubation à 85 ° C pendant 5 min et 1 ul RNase H est d'ajoutered à digérer ARNm (37 ° C pendant 20 min.) L'ADNc simple brin est stocké à -20 ° C pour l'amplification PCR tard.
4. L'élimination complète de l'ADN génomique est vérifiée par RT-moins de contrôle dans lequel la transcriptase inverse est omis alors que tous les composants de la réaction d'autres ont été exactement les mêmes.

5. Deux stade de l'amplification par PCR

1. Des amorces ont été conçues selon les séquences dans GenBank. Autant que possible, intron s'étend paires d'amorces ont été utilisées qui permettent de détecter la contamination d'ADN génomique. La paire d'amorces de séquences sont répertoriées dans le tableau 2. L'efficacité des paires d'amorces doivent d'abord être vérifié par les ARNm ensemble du cerveau qui produisent des produits positifs. Toutes les amorces sont synthétisées par Integrated DNA Technologies (Cedar Rapids, Iowa, Etats-Unis).
2. Dans la première phase, 5 ul de l'ADNc 30 uL est amplifié pendant 35 cycles en présence du couple d'amorces (tableau 2). Le protocole de cyclage thermique du thermocycleur (Mastercycler, Eppendorf, tableau 1) est de 2 min à 94 ° C pour la dénaturation initiale, puis 35 cycles de 15 s à 94 ° C pour dénaturer, 30 s à 55 ° C à recuire, et 45 s à 72 ° C afin de prolonger, suivis de 7 min pour une extension finale. Taq ADN polymérase, désoxynucléotides triphosphates (dNTPs), et tous les autres éléments nécessaires à l'amplification par PCR sont fournis par un mélange PCR super (Invitrogen, tableau 1)
3. Dans la deuxième étape de PCR, le produit de 1 pl de la 1 ^ère étape d'amplification PCR est utilisé comme modèle et la paire d'amorces même que celui utilisé dans la première étape est utilisé (tableau 2). 40 cycles sont organisées avec le temps d'extension réduite à 30 s. Le même PCR Super Mix est utilisé.
4. Les produits de PCR de l'amplification 2 ^ème étape sont séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 2,5%, visualisée par le bromure d'éthidium (0,05 mg/100 ml de gel) ou gelgreen sous lumière UV, et photographié (fig. B4). Les bandes positives sont ensuite découpés, extraits en utilisant un kit d'extraction Qiagen (tableau 1) et séquencé et comparé avec les séquences publiées des gènes cibles.

6. Les résultats représentatifs:

La dopamine (DA) des neurones dans le substantia nigra pars compacta et pars reticulata et les neurones voisins de projection GABA dans la substantia nigra pars reticulata ont distinctes caractéristiques électrophysiologiques (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011).. Comme le montre la Fig. 1B2, SNR neurones GABA présentent dopage à haute fréquence spontanée autour de 10 Hz. Les pics ont une durée de base d'environ 1 ms. Sur hyperpolarisante injection de courant, SNR neurones GABA afficher un affaissement faibles dépolarisants en réponse à hyperpolarisante injection de courant, indiquant une faible expression du courant I _h dans ces neurones (fig. 1B2). En revanche, les neurones DA nigrales présentent des basses fréquences (autour de 2 Hz) des pointes spontanées qui ont une durée de base autour de 3 ms. Neurones DA montrent également qu'un affaissement prononcé en réponse à hyperpolarisante injection de courant, indiquant une forte expression de I _h de courant (Fig. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011).

SCRT-PCR détecté l'ARNm pour l'acide glutamique décarboxylase 1 (GAD1, l'enzyme clé pour la synthèse de GABA et un marqueur de neurones GABA) dans électrophysiologique des neurones identifiés SNr GABA, mais pas dans les neurones DA (fig. 1B4, 5). En revanche, les SCRT-PCR détecté l'ARNm de la tyrosine hydroxylase (TH, enzyme clé pour la synthèse de dopamine et un marqueur de neurones DA) en électrophysiologie identifié SNC et SNr neurones DA, mais pas dans les neurones GABA (fig. 1B4, 5). Alors SCRT-PCR résultats confirment l'identification de neurones électrophysiologiques. Ensuite, SCRT-PCR a été utilisé pour le profil de l'expression de la tension sous-unités activées KV3 canal, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4. Ces sous-unités contribuent à former voltage-dépendants canaux K ⁺ de propriétés diverses selon la composition sous-unité (Ding et al. 2011). Dans l'exemple SNr GABA neurone Fig. 1B4, ARNm de Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés. Dans l'exemple SNr DA neurone indiqué dans Fig.1B5, seulement Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés. Dans nos données en commun, Kv3.1 a été plus fréquemment détectés dans les neurones GABA SNr que dans les neurones DA nigrales, indiquant un niveau élevé d'expression des Kv3.1 dans les neurones rapide dopage SNr GABA (Ding et al. 2011).

Figure 1. Identification électrophysiologique des neurones GABA SNr et nigrales neurones DA A:.. Les zones nigrales peuvent être identifiés par leur localisation anatomique distincte A1 indique l'emplacement de la SNC et SNR dans une coronale Nissl teinté section capturé avec un objectif 1X. La zone encadrée est CAPTURED avec un objectif 10X et affiché dans le milieu, comme indiqué par la flèche. La SNC-cellulaire riche et pauvre en cellules SNR sont clairement visibles. A2 indique l'emplacement de la SNC et SNR en direct, coupe coronale non colorées capturées avec un objectif 4X. La SNC-cellulaire riche et pauvre en cellules SNr sont aussi clairement identifiables. VTA, l'aire tegmentale ventrale. B1 montre un SNR GABA neurone pièce étant serrée dans la cellule entière mode. B2 montre les propriétés typiques électrophysiologiques des neurones GABA SNr en mode pince enregistrement en cours. Ces incendies spontanés neurones potentiels d'action à haute fréquence de courte durée et ont une faible réponse, je sag _h à médiation hyperpolarisante injection de courant. B3 montre typique de propriétés électrophysiologiques des neurones DA nigrales en mode pince enregistrement en cours. Ils incendie spontané à faible fréquence de potentiels d'action de longue durée et ont un éminent I _h à médiation affaissement (tête de flèche) réponse à hyperpolarisante injection de courant. Ainsi, SNR neurones GABA et les neurones dopaminergiques nigrales sont clairement identifiés électrophysiologique. B4 montre une image du gel des SCRT-PCR à partir d'un neurone électrophysiologiques identifié SNr GABA. Glutamate décarboxylase 1 (GAD1) ​​mais pas de l'ARNm de la tyrosine hydroxylase (TH) ARNm a été détecté. ARNm de Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés dans ce neurone SNr GABA. B5 montre SCRT-PCR de détection des ARNm de canal neuronale KV3 dans un neurone SNr DA. ARNm TH mais pas l'ARNm GAD1 a été détecté dans une électrophysiologique des neurones identifiés SNr DA. ARNm de Kv3.2, Kv3.3 et Kv3.4 ont été détectés dans cette SNr DA neurone. B6 montre les données regroupées.

7. Potentiel de faux négatifs et de faux résultats positifs

Basé sur notre expérience, plusieurs facteurs peuvent conduire à des faux négatifs SCRT-PCR. Ces facteurs comprennent l'échec de l'aspiration quantité suffisante du cytoplasme à cause de colmatage pointe de la pipette de patch, la contamination de RNase, et inefficace amorces de PCR. Colmatage Patch pointe de la pipette en général peut être vu sur le moniteur vidéo et indiqué par un accès accru de résistance. Contamination de RNase peuvent être évités par la désactivation complète et porter des gants. L'efficacité d'amorces PCR doivent être testés en utilisant l'ARN total à partir d'un tissu cérébral poinçon (Zhou et al 2008;.. Ding et al 2011).

Depuis que nous utilisons toujours la DNase d'abord traiter nos échantillons avant la RT, nous n'avons pas rencontré de faux résultats positifs. Théoriquement, sans digestion par la DNase, la contamination d'ADN génomique et donc fausse détection positive peut se produire lorsque le gène est intron ou la paire d'amorces ne couvre pas la région intron.

Discussion

La combinaison de l'enregistrement de patch clamp en tranches de cerveau avec des SCRT-PCR, nous avons démontré ici fournissent une excellente méthode pour étudier les profils d'expression d'ARNm pour les canaux ioniques, récepteurs et des enzymes clés de la synthèse des neurotransmetteurs dans les neurones individuellement caractérisés. Ceci est particulièrement utile lorsque la protéine en question ne peuvent être détectées et localisées à l'aide d'autres méthodes telles que l'immunohistochimie en raison du niveau d'expression faible et / ou de l'absence d'anticorps appropriés (Surmeier et al 1996;.. Zhou et al 2009). La haute sensibilité et de sélectivité des SCRT-PCR permettent la détection des ARNm de faible abondance (Surmeier et al. 1996). De plus, cette méthode permet la corrélation de l'expression génique avec des propriétés électrophysiologiques et fonctionnelles dans les neurones caractérisé individuellement (Liss et al 2001;. Zhou et al 2008, 2009;. Ding et al 2011).. Basé sur des preuves littérature et notre expérience, cette méthode est applicable à tous les types de neurones dans le système nerveux.

Materials

Table 1. Key reagents and equipment

Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR