Summary
न्यूरॉन्स को पहली बार electrophysiologically विशेषता है. फिर दर्ज न्यूरॉन से cytoplasm से aspirated है और प्रतिलेखन - पीसीआर विश्लेषण रिवर्स neurotransmitter संश्लेषण एंजाइमों, आयन चैनल, और रिसेप्टर्स के लिए mRNAs की अभिव्यक्ति का पता लगाने के अधीन है.
Abstract
स्तनधारी केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में, विविध आणविक और कार्यात्मक विशेषताओं के साथ न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार के साथ एक दूसरे को अलग करने के लिए मुश्किल और भी उनके आकारिकी द्वारा आसानी से पहचान नहीं intermingled रहे हैं. इस प्रकार, यह अक्सर मुश्किल होता है एक विशिष्ट न्यूरॉन प्रकार में जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण है. यहाँ हम एक प्रक्रिया है कि एकल कोशिका रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन प्रोफ़ाइल mRNA अभिव्यक्ति के लिए पर्याप्त nigra में न्यूरॉन्स के विभिन्न प्रकार में रिएक्शन (scRT पीसीआर) के साथ पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग तकनीकों को जोड़ती है दस्तावेज़. Electrophysiological तकनीकों के लिए पहली बार व्यक्तिगत न्यूरॉन्स के neurophysiological और कार्यात्मक गुणों रिकॉर्ड के लिए उपयोग किया जाता है. फिर, एक electrophysiologically विशेषता nigral न्यूरॉन्स के cytoplasm से aspirated और scRT-पीसीआर विश्लेषण के अधीन neurotransmitter संश्लेषण एंजाइमों, रिसेप्टर्स, और आयन चैनल के लिए mRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्राप्त है. उच्च चयनात्मकता और संवेदनशीलता के लिए इस पद्धति का विशेष रूप से उपयोगी है जब immunohistochemistry उपयुक्त एंटीबॉडी या कम प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर की कमी के कारण नहीं किया जा सकता है. इस विधि को भी अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में न्यूरॉन्स के लिए लागू है.
Protocol
1. मस्तिष्क टुकड़ा तैयारी
- युवा (15-40 दिन पुराने) पुरुष और महिला चूहों Sprague-Dawley किया जाता है. गहरी urethane संज्ञाहरण के तहत (हम भी चूहों में यह एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग), जानवरों decapitated और मस्तिष्क जल्दी से बाहर dissected है. फिर 300 सुक्ष्ममापी मोटी राज्याभिषेक मस्तिष्क substantia nigra के midrostral भाग युक्त स्लाइस एक Leica vibratome (VT - 1200s) पर काट रहे हैं. 220 sucrose, KCl 2.5, 1.25 नाह 2 4 PO, 25 NaHCO 3, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, 10 डी: प्रक्रिया काटने टुकड़ा एक बहुत ठंडा, oxygenated उच्च युक्त (मिमी में) समाधान काटने sucrose में प्रदर्शन ग्लूकोज. यह 95% O 2 / 5% सीओ 2 oxygenated रखने और 7.4 पर पीएच बनाए रखने का एक मिश्रण के साथ bubbled है. काटने बर्फ ठंड समाधान प्रक्रिया के दौरान रखें.
- मस्तिष्क स्लाइसें एक ऊष्मायन एक oxygenated कृत्रिम मस्तिष्कमेरु (aCSF) तरल पदार्थ युक्त (मिमी में) के साथ भरा कक्ष में incubated हैं: NaCl 125, 2.5, KCl 1.25 2 नाह पीओ 4, 25 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2, 1.3 से 2 MgCl, 10 डी शर्करा. यह 95% O 2 / 5% सीओ 2 oxygenated रखने और 7.4 पर पीएच बनाए रखने का एक मिश्रण के साथ bubbled है. ऊष्मायन तापमान 34 डिग्री सेल्सियस के लिए 45 मिनट के लिए और फिर कमरे के तापमान पर जब तक मस्तिष्क टुकड़ा रिकॉर्डिंग कक्ष में स्थानांतरित कर रहा है.
2. Nigral न्यूरॉन्स की electrophysiological फिंगरप्रिंटिंग
- एक मस्तिष्क टुकड़ा एक पैच दबाना रिकॉर्डिंग लगातार 32 में oxygenated aCSF के साथ perfused चैम्बर डिग्री सेल्सियस के लिए स्थानांतरित कर रहा है
- पैच pipettes autoclaved (केजी-33) borosilicate गिलास केशिका टयूबिंग (1.10 मिमी आईडी, 1.65 मिमी आयुध डिपो, राजा परिशुद्धता ग्लास, Claremont, CA के) एक खींचने पीसी 10 (Narishige, टोक्यो, जापान) का उपयोग कर से खींच रहे हैं और intracellular समाधान के साथ भरा DNase - RNase मुक्त (फिशर साइंटिफिक) पानी (135 मिमी KCl 0.5 मिमी EGTA, 10 मिमी HEPES, 1.5 मिमी 2 MgCl, 7.3 करने के लिए समायोजित पीएच युक्त) के साथ तैयार है . पैच pipettes 2-3 MΩ के स्नान में resistances है.
- substantia nigra अपनी विशिष्ट संरचनात्मक स्थान (छवि 1A1-2) के अनुसार पहचान की है. एक वीडियो (BX51W1 ओलिंप) खुर्दबीन Nomarski प्रकाशिकी और 60x पानी विसर्जन, substantia nigra pars compacta दक्षिणी नौसेना कमान () और substantia nigra में लेंस बड़े कोशिकाओं के साथ सुसज्जित के दृश्य मार्गदर्शन के अंतर्गत pars reticulata (SNR) का चयन कर रहे हैं (संभव डीए न्यूरॉन्स और GABA न्यूरॉन्स) रिकार्डिंग के लिए. परम्परागत giga ओम तंग सील विन्यास पूरे सेल (1B1 छवि) प्राप्त की है. वर्तमान दबाना और वोल्टेज क्लैंप विश्लेषण किया जा सकता है. MRNA गिरावट को कम करने के लिए, electrophysiological रिकॉर्डिंग संक्षिप्त (≤ 5 मिनट). एक विकल्प के लिए सिर्फ झिल्ली और spiking गुण रिकॉर्ड के हितों के न्यूरॉन्स (छवि 3 बी 2) के लिए electrophysiological उँगलियों के निशान प्रदान की है. यह संक्षिप्त रिकॉर्डिंग के बारे में केवल 1 मिनट लगते हैं.
3. Cytoplasm आकांक्षा
- Electrophysiological और SNR GABA और डीए न्यूरॉन्स के फिंगरप्रिंटिंग लक्षण वर्णन के बाद, कोमल मुंह चूषण cytoplasm महाप्राण (व्यंजन) लागू किया जाता है. सेल नाभिक भी, aspirated हो सकता है जीनोमिक डीएनए संदूषण में जिसके परिणामस्वरूप. तंग सील नहीं तोड़ा जाना चाहिए, अन्यथा कोशिकी mRNA सहित मलबे पैच पिपेट में चूसा जा सकता है और कक्ष सामग्री दूषित है. तंग सील की अखंडता -70 एम वी पर पकड़े वर्तमान में वृद्धि के रूप में लंबे समय के रूप में अच्छा है 100 फिलीस्तीनी अथॉरिटी से अधिक नहीं करता है.
- फिर से aspirated कक्ष सामग्री एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में विंदुक टिप और एक छोटे से सकारात्मक दबाव को तोड़ने से निष्कासित कर दिया है. एक पीसीआर ट्यूब में एक सेल की सामग्री एकत्र की है. कक्ष सामग्री को स्वीकार करने के बाद, संग्रह पीसीआर ट्यूब, बर्फ पर पूर्व - ठंडा, तुरंत -20 ° सी फ्रीजर में रखा जाता है.
- कोशिकी मलबे कि mRNAs को शामिल कर सकते हैं के प्रदूषण नियम, पैच विंदुक ऊतक में वास्तव में cytoplasm aspirating बिना उतारा है और तब विंदुक सामग्री RT-पीसीआर के अधीन है.
4. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी)
- न्यूरॉन्स, आमतौर पर 10-20 की एक उचित संख्या से सेल सामग्री इकट्ठा करने के बाद, आरटी तुरंत शुरू करने के लिए mRNAs का क्षरण कम से कम करना चाहिए.
- चूंकि एक न्यूरॉन से कक्ष सामग्री की मात्रा बहुत छोटा है, शाही सेना अलगाव प्रक्रिया नहीं किया जाता है. संभावित contaminating जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए, aspirated कक्ष सामग्री पहले DNase मैं (5 μL DNase और मैं 1.6 μL DNase मैं बफर, 25 में 5 मिनट ° सी) द्वारा पचता है. फिर DNase मैं 1.2 μL 25 मिमी EDTA जोड़ने और 75 पर 5 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस incubating से निष्क्रिय है.
- सीडीएनए सुपरस्क्रिप्ट क्ष्क्ष्क्ष् ट्रांसक्रिपटेस आधारित कक्ष डायरेक्ट सीडीएनए संश्लेषण किट रिवर्स (Invitrogen, तालिका 1) का उपयोग करने के लिए संश्लेषित है. पहले सीडीएनए कतरा 50 संश्लेषित है ° सी 50 मिनट के लिए, तो प्रतिक्रिया ऊष्मायन द्वारा 85 पर निष्क्रिय है ° सी के लिए 5 मिनट और 1 μL RNase एच जोड़नेएड mRNA (37 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट के लिए) को पचाने के लिए. एकल असहाय सीडीएनए -20 डिग्री सेल्सियस पर बाद पीसीआर प्रवर्धन के लिए भंडारित किया है.
- जीनोमिक डीएनए की पूरी हटाने RT-शून्य नियंत्रण है जिसमें रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस छोड़ा गया है जबकि अन्य सभी की प्रतिक्रिया घटक बिल्कुल वही थे द्वारा सत्यापित है.
5. दो चरण पीसीआर प्रवर्धन
- प्राइमर्स GenBank में दृश्यों को अनुसार डिजाइन किए गए थे. जब भी संभव हो, intron फैले प्राइमर जोड़े को इस्तेमाल किया गया है कि मदद जीनोमिक डीएनए संदूषण का पता लगाने. प्राइमर जोड़ी दृश्यों तालिका 2 में सूचीबद्ध हैं. पहले प्राइमर जोड़े के प्रभाव पूरे मस्तिष्क mRNAs कि सकारात्मक उत्पादों उपज द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए. सभी प्राइमरों एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजी (Coralville, आयोवा, संयुक्त राज्य अमेरिका) के द्वारा संश्लेषित कर रहे हैं.
- पहले चरण में 30 μL cDNAs के 5 μL 35 चक्र के लिए प्राइमर जोड़ी (तालिका 2) की उपस्थिति में परिलक्षित होता है. थर्मल cycler के थर्मल साइकिल प्रोटोकॉल (MasterCycler, Eppendorf, तालिका 1) 94 ° प्रारंभिक विकृतीकरण के लिए सी, तो 94 में 35 15 के चक्र डिग्री सेल्सियस denature करने के लिए, 55 में 30 एस डिग्री सेल्सियस पानी रखना करने के लिए 2 मिनट है, और एस 72 पर 45 ° सी विस्तार के लिए अंतिम विस्तार के लिए 7 मिनट द्वारा पीछा किया Taq डीएनए पोलीमरेज़, deoxynucleotide triphosphates (dNTPs), और अन्य सभी पीसीआर प्रवर्धन के लिए आवश्यक घटक एक पीसीआर सुपर मिश्रण (Invitrogen, तालिका 1) द्वारा उपलब्ध कराए गए हैं.
- दूसरे चरण पीसीआर में, 1 से 1 सेंट चरण पीसीआर प्रवर्धन μL के उत्पाद को टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है और पहले चरण में एक ही प्राइमर इस्तेमाल किया जोड़ी (तालिका 2) प्रयोग किया जाता है. 40 चक्र 30 से छोटा विस्तार समय के साथ चलाए जा रहे हैं एस एक ही पीसीआर सुपर मिश्रण किया जाता है.
- 2 एन डी मंच प्रवर्धन से पीसीआर उत्पादों 2.5% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग कर रहे हैं, पराबैंगनी प्रकाश के तहत ethidium (0.05 mg/100 जेल एमएल) ब्रोमाइड या gelgreen द्वारा कल्पना है, और फोटो खिंचवाने (B4 छवि). सकारात्मक बैंड तो बाहर काट रहे हैं, Qiagen निष्कर्षण (तालिका 1) किट और अनुक्रम का उपयोग कर निकाला और लक्ष्य जीन प्रकाशित दृश्यों के साथ तुलना में .
6. प्रतिनिधि परिणाम:
substantia nigra pars compacta और reticulata pars और पड़ोसी substantia nigra में GABA प्रक्षेपण न्यूरॉन्स में dopamine न्यूरॉन्स (डीए) pars reticulata electrophysiological अलग विशेषताओं (झोउ एट अल 2006.; डिंग एट अल 2011) है. के रूप में छवि में दिखाया गया है. 1B2, SNR GABA न्यूरॉन्स 10 हर्ट्ज के आसपास प्रदर्शन उच्च आवृत्ति सहज spiking . spikes के 1 एमएस के चारों ओर एक आधार अवधि है. वर्तमान इंजेक्शन hyperpolarizing पर, SNR GABA न्यूरॉन्स वर्तमान इंजेक्शन hyperpolarizing के जवाब में एक कमजोर depolarizing शिथिलता प्रदर्शित करते हैं, मैं इन न्यूरॉन्स में वर्तमान घंटे (1B2 छवि) के एक कमजोर अभिव्यक्ति का संकेत है. इसके विपरीत, nigral डीए न्यूरॉन्स कम आवृत्ति प्रदर्शन (2 हर्ट्ज के आसपास) सहज spikes है कि 3 एमएस के चारों ओर एक आधार अवधि है. डीए न्यूरॉन्स भी वर्तमान इंजेक्शन hyperpolarizing के जवाब में स्पष्ट शिथिलता दिखाने के लिए, मैं घंटे (1B3 छवि) वर्तमान (झोउ एट अल 2006., 2011 डिंग एट अल.) के एक मजबूत अभिव्यक्ति का संकेत है.
scRT-पीसीआर electrophysiologically पहचान SNR GABA न्यूरॉन्स में glutamic एसिड 1 decarboxylase (GAD1 GABA और GABA न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर के संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण एंजाइम) के लिए mRNA का पता चला, लेकिन नहीं डीए न्यूरॉन्स (छवि 1B4, 5 ). इसके विपरीत, scRT-पीसीआर tyrosine hydroxylase के लिए mRNA का पता चला (TH, dopamine और डीए न्यूरॉन्स के लिए एक मार्कर के संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण एंजाइम) electrophysiologically पहचान दक्षिणी नौसेना कमान और SNR डीए न्यूरॉन्स में, लेकिन नहीं GABA न्यूरॉन्स (छवि 1B4, 5). तो scRT - पीसीआर परिणाम electrophysiological न्यूरॉन पहचान की पुष्टि. अगला, scRT - पीसीआर वोल्टेज सक्रिय चैनल Kv3 सब यूनिटों, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 और Kv3.4 की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए इस्तेमाल किया गया था. ये सब यूनिटों वोल्टेज gated कश्मीर फार्म योगदान + सबयूनिट संरचना (डिंग एट अल.) 2011 के आधार पर विविध गुणों का चैनल. उदाहरण में SNR GABA न्यूरॉन चित्र में दिखाया गया है. 1B4, Kv3.1, Kv3.2 Kv3.3, और Kv3.4 लिए mRNAs पाया गया. उदाहरण में SNR डीए न्यूरॉन Fig.1B5 में दिखाया गया है, केवल Kv3.2 Kv3.3, और Kv3.4 पाया गया. हमारे pooled डेटा में, Kv3.1 अधिक बार nigral डीए न्यूरॉन्स में से था SNR GABA न्यूरॉन्स में पाया, एक उच्च Kv3.1 के तेजी से spiking SNR GABA न्यूरॉन्स (डिंग एट अल. +२,०११) में अभिव्यक्ति के स्तर का संकेत है.
चित्रा 1. SNR GABA न्यूरॉन्स और nigral डीए न्यूरॉन्स के electrophysiological पहचान: nigral क्षेत्रों उनके अलग संरचनात्मक स्थान से पहचाना जा सकता A1 एक राज्याभिषेक Nissl से सना हुआ एक 1X उद्देश्य से कब्जा कर लिया अनुभाग में दक्षिणी नौसेना कमान और SNR के स्थान को दर्शाता है. बॉक्स्ड क्षेत्र captur थाएड के साथ एक 10X उद्देश्य और मध्य में प्रदर्शित के रूप में तीर द्वारा संकेत. सेल अमीर दक्षिणी नौसेना कमान और सेल गरीब SNR स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं A2 एक रहते हैं, बेदाग राज्याभिषेक एक 4X उद्देश्य से कब्जा कर लिया अनुभाग में दक्षिणी नौसेना कमान और SNR के स्थान से पता चलता है. सेल अमीर दक्षिणी नौसेना कमान और सेल गरीब SNR भी स्पष्ट रूप से पहचान योग्य हैं. VTA, वेंट्रल tegmental क्षेत्र B1 एक SNR GABA न्यूरॉन पूरे सेल मोड में clamped पैच से पता चलता है B2 SNR वर्तमान क्लैंप रिकॉर्डिंग मोड में GABA न्यूरॉन्स की ठेठ electrophysiological गुणों से पता चलता है. इन न्यूरॉन्स आग सहज कम अवधि के उच्च आवृत्ति संभावित कार्रवाई और एक कमजोर मैं घंटे की मध्यस्थता शिथिलता वर्तमान इंजेक्शन hyperpolarizing करने के लिए प्रतिक्रिया है B3 वर्तमान क्लैंप रिकॉर्डिंग मोड में nigral डीए न्यूरॉन्स की विशिष्ट electrophysiological गुणों से पता चलता है है . वे लंबी अवधि के सहज कम आवृत्ति कार्रवाई क्षमता आग और एक प्रमुख मैं घंटे की मध्यस्थता (तीर सिर) शिथिलता वर्तमान इंजेक्शन hyperpolarizing के जवाब है. इस प्रकार, SNR GABA न्यूरॉन्स और nigral dopamine न्यूरॉन्स स्पष्ट रूप से electrophysiologically की पहचान कर रहे हैं B4 एक electrophysiological पहचान SNR GABA न्यूरॉन से scRT पीसीआर उत्पादों की एक जेल तस्वीर दिखाता है. . ग्लूटामेट decarboxylase 1 (GAD1) mRNA लेकिन कोई Tyrosine hydroxylase mRNA (HI) का पता चला था. Kv3.1, Kv3.2 Kv3.3, और Kv3.4 के लिए mRNAs इस SNR GABA न्यूरॉन में पाया गया B5 scRT-पीसीआर SNR डीए न्यूरॉन में neuronal Kv3 चैनल mRNAs का पता लगाने से पता चलता है.. TH mRNA लेकिन कोई GAD1 mRNA एक electrophysiologically पहचान SNR डीए न्यूरॉन में खोजा गया था. Kv3.3 Kv3.2, और Kv3.4 के लिए mRNAs इस SNR डीए न्यूरॉन pooled डेटा से पता चलता है बी -6 में पाया गया.
7. संभावित नकारात्मक झूठी और झूठी सकारात्मक परिणाम
हमारे अनुभव के आधार पर, कई कारकों नकारात्मक झूठी scRT-पीसीआर परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. इन कारकों विंदुक टिप clogging, RNase संदूषण, और अक्षम पीसीआर प्राइमरों पैच कारण cytoplasm के लिए पर्याप्त राशि aspirating में विफलता शामिल हैं. पैच विंदुक टिप clogging आम तौर पर वीडियो मॉनीटर पर देखा जा सकता है और वृद्धि हुई उपयोग प्रतिरोध द्वारा संकेत दिया. RNase संदूषण पूरी तरह क्रियाशीलता छोड़ना और दस्ताने पहनने से बचा जा सकता है. पीसीआर प्राइमर प्रभाव मस्तिष्क के ऊतकों पंच से कुल शाही सेना का उपयोग करके परीक्षण किया जाना चाहिए (झोउ एट अल 2008, 2011 डिंग एट अल.).
चूंकि हम हमेशा DNase का उपयोग करने के लिए पहली बार आरटी पहले हमारे नमूने का इलाज करने के लिए, हम झूठी सकारात्मक परिणाम नहीं सामना करना पड़ा है. सिद्धांततः, DNase पाचन के बिना, जीनोमिक डीएनए संदूषण और इस तरह झूठी सकारात्मक पहचान होने पर हो सकती है जब जीन intronless या प्राइमर जोड़ी है intron क्षेत्र नहीं अवधि करता है.
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Discussion
scRT-पीसीआर के साथ पैच मस्तिष्क टुकड़ा में क्लैंप रिकॉर्डिंग के संयोजन हम यहाँ आयन चैनल, रिसेप्टर्स, और व्यक्तिगत विशेषता न्यूरॉन्स में neurotransmitter संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण एंजाइमों के लिए mRNA अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच के लिए एक उत्कृष्ट विधि प्रदान प्रदर्शन किया. यह विशेष रूप से उपयोगी है जब प्रश्न में प्रोटीन और पता नहीं कम अभिव्यक्ति के स्तर और / या उपयुक्त एंटीबॉडी के अभाव के कारण immunohistochemistry रूप में अन्य विधियों का उपयोग कर स्थानीयकृत कर सकते हैं (1996 Surmeier एट अल;. झोउ एट अल 2009). उच्च चयनात्मकता और scRT पीसीआर की संवेदनशीलता कम बहुतायत mRNAs (१९९६ Surmeier एट अल.) का पता लगाने की अनुमति देते हैं. इसके अलावा, इस पद्धति की अनुमति देता है व्यक्तिगत विशेषता न्यूरॉन्स में electrophysiological और कार्यात्मक गुण (लिस एट अल 2001. झोउ एट अल 2008, 2009, 2011 डिंग एट अल.) के साथ जीन अभिव्यक्ति के संबंध है. साहित्य सबूत और हमारे अनुभव के आधार पर, इस विधि का नर्वस सिस्टम में हर न्यूरॉन प्रकार के लिए लागू है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम एनआईएच R01DA021194 और R01NS058850 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
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Table 1. Key reagents and equipment
Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCRReferences
- J, Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription. EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).
- Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons. J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).
- Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -M. Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).
- Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -M. An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons. J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).
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- Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -M. Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata. J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).
