Perfil de tensão-gated Expressão mRNA canais de potássio em neurônios da substância negra usando uma única célula RT-PCR Técnicas

Summary

Neurônios são os primeiros caracterizada eletrofisiologicamente. Em seguida, o citoplasma do neurônio gravado é aspirado e submetido a transcrição reversa-PCR para detectar a expressão de mRNAs de enzimas neurotransmissor síntese, canais iônicos e receptores.

Abstract

No sistema central de mamíferos nervoso, diferentes tipos de neurônios com diversas características moleculares e funcionais são misturados uns com os outros, difícil separar e também não são facilmente identificados pela sua morfologia. Assim, é muitas vezes difícil de analisar a expressão de gene em um tipo de neurônio específico. Aqui nós documentamos um procedimento que combina de célula inteira correção técnicas de gravação de fixação com uma única célula reverter reação em cadeia da polimerase (SCRT-PCR) para expressão de mRNA perfil em diferentes tipos de neurônios no nigra substancial. Técnicas eletrofisiológicas são utilizados pela primeira vez para registrar as propriedades neurofisiológicas e funcionais de neurônios individuais. Então, o citoplasma de uma única eletrofisiologicamente caracterizada neurônios da substância negra é aspirado e submetido a SCRT-PCR para obter perfis de expressão de RNAm para as enzimas de síntese de neurotransmissores, receptores e canais iônicos. A alta seletividade e sensibilidade tornam este método particularmente útil quando imunohistoquímica não pode ser usado devido à falta de anticorpos adequado ou baixo nível de expressão da proteína. Este método também é aplicável aos neurônios em outras áreas do cérebro.

Protocol

1. Preparação fatia do cérebro

1. Jovens (15-40 dias de idade) do sexo masculino e feminino Sprague-Dawley são usados. (Nós também usamos esse mesmo protocolo em camundongos.) Sob anestesia profunda de uretano, os animais são decapitados eo cérebro é rapidamente dissecados. De 300 m de espessura fatias do cérebro que contém a parte coronal midrostral da substantia nigra são cortados em um vibratome Leica (VT-1200S). A fatia de corte procedimento é realizado em uma gelada, sacarose oxigenado alta corte solução contendo (em mM): 220 sacarose, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 0,5 CaCl _2, 7 MgCl _2, 10 D- glicose. É borbulhava com uma mistura de 95% O CO ₂ / 5 _2% para manter oxigenada e manter o pH em 7,4. Manter a solução de corte de gelo frio durante todo o procedimento.
2. As fatias de cérebro são incubados em uma câmara de incubação preenchido com um fluido cerebrospinal oxigenado artificial (ACSF) contendo (em mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH ₂ PO _4, 25 NaHCO _3, 2,5 CaCl _2, 1,3 MgCl _2, 10 D-glicose. É borbulhava com uma mistura de 95% O CO ₂ / 5 _2% para manter oxigenada e manter o pH em 7,4. A temperatura de incubação é de 34 ° C por 45 min e, em seguida, em temperatura ambiente até que a fatia do cérebro é transferido para a câmara de gravação.

2. Fingerprinting eletrofisiológicas de neurônios da substância negra

1. Uma fatia do cérebro é transferido para uma câmara de gravação de patch-clamp continuamente perfundido com a ACSF oxigenada a 32 ° C.
2. Pipetas patch são retirados autoclavado borosilicato (KG-33) tubo de vidro capilar (1,10 mm id, 1,65 mm de diâmetro externo, o rei de precisão de vidro, Claremont, CA), utilizando um extrator de PC-10 (Narishige, Tóquio, Japão) e preenchido com solução intracelular preparado com DNase-RNase água (Fisher Scientific) (contendo 135 mM KCl, 0,5 mM EGTA, 10 HEPES mM, 1,5 mM MgCl _2, pH ajustado para 7,3). As pipetas de correção tem resistências de 2-3 mohms no banho.
3. A substância negra é identificada de acordo com sua localização anatômica distintos (Fig. 1A1-2). Sob a orientação visual de um vídeo-microscópio (Olympus BX51W1) equipado com Nomarski óptica e objetiva de imersão 60X de água, grandes células da substância negra pars compacta (SNc) e substantia nigra pars reticulata (SNR) (neurônios possível DA e neurônios GABA) são selecionados para a gravação. Convencionais giga-ohm apertado selo de configuração de célula inteira é obtida (Fig. 1B1). Análises pinça de corrente e voltagem clamp pode ser realizada. Para minimizar a degradação do mRNA, a gravação eletrofisiológico deve ser breve (≤ 5 min). Uma opção é gravar somente a membrana e propriedades spiking de fornecer impressões digitais eletrofisiológico para os neurônios de interesses (Fig. B2-3). Esta gravação breve leva apenas cerca de 1 min.

3. Aspiração citoplasma

1. Depois de fingerprinting eletrofisiológicos e caracterização de SNR GABA e neurônios DA, de sucção da boca suave é aplicada para aspirar o citoplasma. O núcleo da célula também pode ser aspirado, resultando na contaminação do DNA genômico. A vedação não deve ser quebrado; detritos de outra forma extracelular incluindo mRNA pode ser sugado para a pipeta patch e contaminar o conteúdo da célula. A integridade da vedação é bom, desde que o aumento na corrente segurando a -70 mV não exceda 100 pA.
2. Em seguida, o conteúdo da célula aspirado é expulso em um tubo de 0,2 mL PCR, quebrando a ponta da pipeta e uma pressão pequena positivo. Conteúdo de uma célula é coletado em um tubo de PCR. Depois de aceitar o conteúdo da célula, a coleta de tubos PCR, pré-resfriado em gelo, é imediatamente colocado em um freezer -20 ° C.
3. Para impedir a contaminação de detritos extracelulares que podem conter mRNAs, a pipeta patch é baixado para o tecido sem realmente aspiração citoplasma e, em seguida, o conteúdo da pipeta é submetido a RT-PCR.

4. Transcrição reversa (RT)

1. Depois de recolher o conteúdo da célula a partir de um número razoável de neurônios, geralmente 10-20, RT deve começar imediatamente para minimizar a degradação dos mRNAs.
2. Uma vez que a quantidade do conteúdo da célula a partir de um único neurônio é muito pequeno, RNA procedimento de isolamento não é executada. Para remover o DNA genômico potenciais contaminantes, o conteúdo da célula é aspirada primeiro digerido pelo DNase I (5 mL DNase I e 1,6 mL DNase I Buffer, 5 min a 25 ° C). Então DNase I é inativada pela adição de 1,2 mL 25 mM EDTA e incubado a 75 ° C por 5 min.
3. cDNA é sintetizado usando o SuperScript III da transcriptase reversa baseada em células-Direct kit de síntese de cDNA (Invitrogen, Tabela 1). Primeiro domínio cDNA é sintetizado a 50 ° C por 50 min, então a reação é inativada por incubação a 85 ° C por 5 min e 1 mL de RNase H é adicionared para digerir mRNA (37 ° C por 20 min). O cDNA de fita simples é armazenado a -20 ° C para a amplificação PCR mais tarde.
4. Remoção completa do DNA genômico é verificada por RT-minus controle em que a transcriptase reversa é omitida, enquanto todos os componentes de reação outros eram exatamente as mesmas.

5. Dois estágios de amplificação PCR

1. Primers foram desenhados de acordo com as seqüências no GenBank. Sempre que possível, intron-spanning pares de primers foram usados ​​que ajudam a detectar a contaminação do DNA genômico. Seqüências de primers estão listadas na Tabela 2. A eficácia dos pares de primer deve ser o primeiro verificado pelo mRNAs cérebro inteiro que produzem produtos positivo. Todos os primers são sintetizados por Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, EUA).
2. Na primeira fase, 5 mL de 30 mL cDNAs é amplificado por 35 ciclos com a presença do par de primer (Tabela 2). O protocolo de ciclagem térmica do termociclador (Mastercycler, Eppendorf, Tabela 1) é de 2 min a 94 ° C para a desnaturação inicial, em seguida, 35 ciclos de 15 s em 94 ° C para desnaturar, 30 s, a 55 ° C para recozer, e 45 s em 72 ° C para estender, seguido por 7 min para uma extensão final. Taq DNA polimerase, trifosfatos desoxinucleotídeo (dNTPs), e todos os outros componentes necessários para a amplificação PCR são fornecidos por um super PCR mix (Invitrogen, Tabela 1)
3. Na segunda etapa da PCR, o produto de 1 mL da 1 ^ª etapa de amplificação por PCR é usado como modelo eo par de primer mesmo utilizado no primeiro estágio é utilizado (Tabela 2). 40 ciclos são executados com o tempo de extensão reduzida para 30 s. O mesmo PCR mix super é usado.
4. Produtos de PCR de amplificação do estágio ² º estão separados por eletroforese em gel de agarose 2,5%, sendo visualizado por brometo de etídio (0,05 mg/100 mL gel) ou gelgreen sob luz UV e fotografado (Fig. B4). As bandas positivos são então cortadas, extraído usando um kit Qiagen extração (Tabela 1) e sequenciado, e comparadas com as seqüências publicadas dos genes-alvo.

6. Resultados representativos:

A dopamina (DA) neurônios na substância negra pars compacta e pars reticulata e os vizinhos neurônios de projeção GABA na substância negra pars reticulata têm distintas características eletrofisiológicas (Zhou et al 2006;. Ding et al 2011).. Como mostrado na figura. 1B2, os neurônios SNR GABA apresentam picos de alta freqüência espontânea em torno de 10 Hz. Os picos têm uma duração base de cerca de 1 ms. Após hiperpolarizantes injeção de corrente, os neurônios GABA SNR exibir um sag fraco despolarizantes em resposta a hiperpolarizantes injeção de corrente, indicando uma fraca expressão da I _h atuais nestes neurônios (Fig. 1B2). Em contraste, os neurônios nigral DA apresentam baixa freqüência (cerca de 2 Hz) picos espontâneos que têm uma duração base de cerca de 3 ms. Neurônios DA também mostram uma queda acentuada em resposta à injeção de corrente hiperpolarizante, indicando uma forte expressão de I _h corrente (Fig. 1B3) (Zhou et al 2006;.. Ding et al 2011).

SCRT-PCR detectaram mRNA para descarboxilase do ácido glutâmico 1 (GAD1, a enzima chave para a síntese de GABA e um marcador de neurônios GABA) em eletrofisiologicamente identificados SNR GABA neurônios, mas não em DA neurônios (Fig. 1B4, 5). Em contraste, SCRT-PCR detectaram mRNA de tirosina hidroxilase (enzima TH, a chave para a síntese de dopamina e um marcador de neurônios DA) na SNc eletrofisiologicamente identificados e neurônios SNR DA, mas não em neurônios GABA (Fig. 1B4, 5). Então SCRT-PCR resultados confirmam a identificação neurônio eletrofisiológico. Em seguida, SCRT-PCR foi usado para o perfil da expressão de tensão ativado Kv3 subunidades canal Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4. Estas subunidades contribuem para formar voltagem dependentes K ⁺ canais de diversas propriedades dependendo da composição de subunidades (Ding et al. 2011). No exemplo SNR GABA neurônio mostrado na figura. 1B4, mRNAs para Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 foram detectados. No exemplo SNR DA neurônio mostrado na Fig.1B5, apenas Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 foram detectados. Em nossos dados agrupados, Kv3.1 foi mais frequentemente detectado em neurônios GABA SNR do que nos neurônios nigral DA, indicando um maior nível de expressão de Kv3.1 no fast-spiking SNR GABA neurônios (Ding et al. 2011).

Figura 1. Identificação eletrofisiológicas de neurônios GABA SNR e neurônios nigral DA A:.. Nigral áreas podem ser identificados por sua localização anatômica distintos A1 mostra a localização da SNc e SNR em uma seção Nissl manchada coronal capturado com um objetivo 1X. A área foi encaixotado CAPTURed com uma objetiva de 10X e exibidas no meio, como indicado pela seta. A SNc células-ricos e pobres células SNR são claramente visíveis. A2 mostra a localização da SNc e SNR em um ao vivo, sem manchas seção coronal capturado com um objetivo 4X. A SNc células-ricos e pobres células SNR também são claramente identificáveis. VTA, área tegmental ventral. B1 mostra um SNR GABA remendo neurônio sendo preso no todo-cell modo. B2 mostra as propriedades típicas eletrofisiológicas de neurônios GABA SNR no modo actual de fixação de gravação. Esses neurônios fogo potencial de ação espontânea de alta freqüência de curta duração e têm uma resposta fraca Eu sag _h mediada para hiperpolarizantes injeção de corrente. B3 shows típicos propriedades eletrofisiológicas de neurônios nigral DA no modo actual de fixação de gravação. Eles fogo espontâneo potenciais de baixa freqüência de ação de longa duração e têm um proeminente eu sag _h-mediada (cabeça de seta) resposta ao hiperpolarizantes injeção de corrente. Assim, os neurônios GABA SNR e neurônios dopaminérgicos da substância negra são claramente identificados eletrofisiologicamente. B4 mostra uma imagem de gel SCRT-PCR produtos de um eletrofisiológico identificou SNR GABA neurônio. Descarboxilase glutamato 1 (GAD1) ​​mRNA, mas não tirosina hidroxilase mRNA (TH) foi detectado. mRNAs para Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 foram detectados neste GABA SNR neurônio. B5 mostra SCRT-PCR detecção de mRNAs canal neuronal Kv3 em um neurônio DA Snr. MRNA TH mas não mRNA GAD1 foi detectado em um eletrofisiologicamente identificados SNR DA neurônio. mRNAs para Kv3.2, Kv3.3 e Kv3.4 foram detectados neste DA SNR neurônio. B6 mostra dados agrupados.

7. Potencial de falsos negativos e falsos resultados positivos

Com base em nossa experiência, vários fatores podem levar a resultados falso negativos SCRT-PCR resultados. Esses fatores incluem insuficiência na aspiração quantidade suficiente do citoplasma, devido à correção da pipeta entupimento da ponta, a contaminação RNase e ineficiente primers PCR. Remendo entupimento ponteira geralmente pode ser visto no monitor de vídeo e indicado pela resistência maior acesso. RNase contaminação pode ser evitada através de uma desactivação completa e luvas. PCR eficácia do primer deve ser testada usando RNA total a partir de um tecido cerebral punch (Zhou et al 2008;.. Ding et al 2011).

Uma vez que usamos sempre DNase primeiro tratamos nossos amostras antes de RT, não temos encontrado resultados falso-positivos. Teoricamente, sem digestão DNase, a contaminação do DNA genômico e, assim, a detecção de falsos positivos pode ocorrer quando o gene é intronless ou o par de primer não abrange a região intron.

Discussion

A combinação de gravação de patch-clamp na fatia do cérebro com SCRT-PCR demonstramos aqui fornecem um excelente método para investigar os perfis de expressão de RNAm para canais iônicos, receptores e enzimas-chave para a síntese de neurotransmissores nos neurônios individualmente caracterizado. Isso é particularmente útil quando a proteína em questão não podem ser detectadas e localizadas através de outros métodos, tais como imunohistoquímica, devido ao nível de baixa expressão e / ou falta de anticorpos adequado (Surmeier et al 1996;.. Zhou et al 2009). A alta sensibilidade e seletividade de SCRT-PCR permite a detecção de mRNAs baixa abundância (Surmeier et al. 1996). Além disso, este método permite a correlação da expressão do gene com propriedades eletrofisiológicas e funcionais nos neurônios individualmente caracterizado (Liss et al 2001;. Zhou et al 2008, 2009;. Ding et al 2011).. Com base em evidências da literatura e nossa experiência, este método é aplicável a todos os tipos de neurônios no sistema nervoso.

Materials

Table 1. Key reagents and equipment

Table 2. Primer pairs for rat neuronal Kv3 channel, tyrosine hydroxylase (TH) and glutamic acid decarboxylase 1 (GAD1) mRNAs for scRT-PCR