Summary
تلوين الأجسام المضادة من
Abstract
بطن العذراء ذبابة الفاكهة هو نظام أنشئ نموذج لدراسة التشكل الظهارة وتطوير morphologies جنسيا ديمبرافيك 1-3. خلال pupation ، الذي يمتد نحو 96 ساعة (عند 25 درجة مئوية) ، والسكان من الخلايا المتكاثرة تخيلي استبدال البشرة اليرقات لإنشاء شرائح البالغين في البطن. تخيلي هذه الخلايا ، ولدت خلال مرحلة التطور الجنيني ، كما توجد أزواج الوحشي للأعشاش أرومة منسجة في كل جزء من البطن اليرقات. أربعة أزواج من أعشاش أرومة منسجة تؤدي إلى إهاب الظهرية الكبار (أعشاش الظهري الأمامي والخلفي) ، وإهاب بطني (أعشاش بطني) وspiracles المرتبطة بكل قطعة (منتفس أعشاش) 4. puparation على هذه الخلايا مضاعفا (مميزة من حيث حجم أكبر من اليرقات المتعددة الصبغيات موظفين المدنيين المحليين خلايا البشرة) بدء عملية النمطية للهجرة ، والانتشار واستبدال موظفين المدنيين المحليين. ويمكن استخدام مختلف الأدوات الجزيئية والجينية للتحقيق في مسارات مساهمات الجينية التي تساهم في التشكل من البطن الكبار. عادة يتم تحليل الظواهر الكبار النهائي تشريح التالية من البشرة البطن الكبار. ومع ذلك ، والتحقيق في العمليات الجزيئية الكامنة وراء يتطلب تحليلات المناعى للظهارة العذراء ، والتي تشكل تحديات فريدة من نوعها. زمنيا التشكل الحيوي والتفاعلات من المجموعتين السكانيتين الظهارية مميزة (اليرقات وتخيلي) توليد الأنسجة الهشة عرضة لفقدان الخلية المفرطة خلال تشريح ومعالجة لاحقة. وقد طورنا أساليب التشريح ، التثبيت ، وتصاعد والتصوير من ذبابة الفاكهة abdominem ظهارة العذراء للدراسات المناعى التي تولد متسقة عينات عالية الجودة مناسبة لالمجهري الفلورسنت مبائر أو القياسية.
Protocol
1. اليوم 1
قبل البدء :
ينبغي الحفاظ على صحة السكان من الذباب باستخدام بروتوكولات زراعة القياسية : إزالة البالغين من زجاجات أو قوارير بعد 3-4 أيام من وضع البيض ، والسماح التنمية والمضي قدما في درجة حرارة ثابتة حتى يتجول 3 اليرقات طور مرحلي بدء pupariation الثالثة. يتم وضع علامة على انتقال اليرقات / العذراء قبل تشكيل prepupae (نظرت 0 بعد ساعات من تشكيل puparium - APF). وتتميز الشرانق متحركة من كبار السن الشرانق التي تلون بها من البيض واليرقات التي لم تبدأ بعد pupariation التي مستطيل وشكلها مستدير ، وبروز لspiracles الأمامي.
ستحتاج إلى :
- فرشاة طلاء لجمع الشرانق
- إنشاء غرفة رطبة لزراعة الشرانق : طبق بيتري اصطف مع منشفة ورقية مرطبة ومغطاة رقة الترشيح ملحوظا لنقاط زمنية مختلفة من التركيب الوراثي ، وجمع أو الجنس من الشرانق
- 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لغسل الشرانق
جمع وزراعة والتدريج الشرانق
- استخدام الفرشاة المبللة إزالة بلطف 0hr APF الشرانق من زجاجات ثقافة / قنينات ووضعها في غطاء حجرة رطبة.
- باستخدام فرشاة الرسام وبرنامج تلفزيوني 1X غسل بلطف لإزالة الحطام الشرانق من القضية خادرة
- إذا كان ضروريا لفرز الشرانق حسب نوع الجنس. يمكن استخدام primordia الغدد التناسلية من الشرانق لفرز الجنسين. وprimordia التناسلية الذكور هي زوج من الأقراص الشفافة الوحشي ينظر اليه بسهولة من خلال ما يقرب من إهاب العذراء 03/02 باستمرار طول الجسم 5. وprimordia التناسلية الأنثى هي أصغر وليس تحديدها بسهولة.
- وضع الشرانق في الموقف المسمى بشكل مناسب في الغرفة الرطبة والعودة الى درجة حرارة ثابتة. الثقافة إلى نقطة زمنية التنموية المناسبة.
2. 2 اليوم : تشريح وتثبيت الحضانة والابتدائي الأضداد
قبل البدء :
ستحتاج إلى :
- تشريح stereomicroscope
- ملقط جراحي
- مبضع الجراحة مع رقم 11 ريش
- اثنين من الاكتئاب الزجاج تسعة أطباق جيدا (كورنينج المنتج # 7220-85)
- تملأ الآبار من صحن واحد مع 1X PBS : هذا هو الطبق الشطف لتنظيف الشرانق تشريح
- ملء طبق من الآبار الثانية مع العازلة التثبيت
- الغرفة الرطبة للحضانة الأضداد. نستخدم صناديق بلاستيكية شطيرة اغلاقها باحكام اصطف مع المناشف الورقية المبللة.
- العازلة التثبيت : 1X PBS ، بارافورمالدهيد 4 ٪ ، وحمض deoxycholic 0.2 ٪ (على permeabilization)
- منصة التشريح : مسح شريحة المجهر مع قطعة من الشريط على الوجهين انضمت الى جانب واحد
- 1X PBS
- P100 P200 أو pipettor
تشريح
- باستخدام ملقط إزالة بلطف one الشرانق في وقت ووضعها على منصة التشريح مع نهاية الأمامي من الشرانق التي تواجه أوسع عرض الشريط. إذا الشرانق والرطب بشكل مفرط ، أولا وصمة عار لهم الجافة باستخدام منشفة ورقية.
- قبل الشرانق انضمت تماما على الشريط ، واستخدام الفرشاة لوضع لهم.
- السماح للعذارى في الهواء الجاف والتمسك الشريط (5-10 دقائق)
- مع مشرط الجراحة تشريح كل الشرانق ثنائيا. هذا هو أفضل إنجاز مع خفض سريع واحد من الأمام إلى نهاية الخلفي من الشرانق. إذا فعلت بشكل صحيح ، فإن خفض شطر الأمامية والخلفية على حد سواء spiracles أزواج. تشريح لا يزيد عن 10 الشرانق في وقت والغسيل والتنظيف العينات بسرعة اللازمة لمنع الضرر للبروتين الأنسجة.
- باستخدام فرشاة الرسام ، ونقل كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني 1X لكل الشرانق تشريح للتخفيف عليهم من الشريط.
التنظيف ، وتثبيت الحضانة والابتدائي الأضداد
- مع زوج من ملقط الجراحة فهم نصف خادرة الفردية الأمامية وتزج فورا في بئر للطبق الشطف. ينبغي الاستعاضة عن منصة التشريح بواسطة الطبق الشطف على المسرح المجهر. وينبغي أن يترك القضية الشرانق على العينة حتى يتم استكمال تجهيز العينات وتكون جاهزة للتركيب.
- في حين لا يزال يمسك النصف خادرة استخدام pipettor لغسل بلطف بعيدا الأنسجة الداخلية من البطن. يمكن الضغط كثيرا أثناء الغسل تؤدي إلى فقدان الخلايا الظهارية.
- نقل على الفور النصف خادرة نظيفة لتثبيت العازلة في درجة حرارة الغرفة وعملية الباقية نصفين خادرة بالمثل. مع أن الممارسة ، تشريح وغسل نصفي خادرة 20 تستغرق أقل من 5 دقائق.
- السماح لاحتضان الشرانق في تثبيت العازلة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 (واحد) ساعة.
- شطف الشرانق 3X الثابتة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني 1X
- قد تتم معالجتها على الفور عينات لالمناعية أو قد تكون مخزنة في الإيثانول بنسبة 100 ٪ عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر دون فقدان الخلايا أو التفاعل حاتمة.
- لتخزين العينات وعينات تتوازن من خلال تخفيفسلسلة من برنامج تلفزيوني : EtOH (3:1 ، 1:1 ، 1:3) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في كل تمييع قبل الانتقال إلى EtOH 100 ٪.
- يجب أن تكون العينات إعادة معايرتها في برنامج تلفزيوني من خلال سلسلة لعكس قبل معالجة المناعية.
- كتلة العينات في برنامج تلفزيوني 1X (تستكمل مع ألبومين المصل البقري 2 ٪) لمدة 1 (واحد) قبل ساعة بالإضافة إلى الأجسام المضادة الأولية.
- احتضان مع الأجسام المضادة الأولية المخفف الى التركيز المناسب في برنامج تلفزيوني 1X طوال الليل في 4 درجات مئوية دون هزاز.
3. يوم 3 : الحضانة الضد الثانوي ، التركيب والتصوير
قبل البدء :
ستحتاج إلى :
- اثنين ملقط جراحي
- تصاعد وسائل الإعلام (الجلسرين ، Vectashield [المتجهات مختبرات] ، أو Slowfade الذهب [Invitrogen])
- الاكتئاب جيدا الشرائح المجهر (0.8 ملم)
- Coverslips (24 × 40 ملم)
الثانوية حضانة الأضداد وتصاعد :
- غسل العينات 3X 10 دقيقة مع كل برنامج تلفزيوني 1X
- كتلة العينات في برنامج تلفزيوني 1X (تستكمل مع ألبومين المصل البقري 2 ٪) لمدة 1 (واحد) قبل ساعة بالإضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية.
- احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف إلى التركيز المناسب في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة في الظلام لساعات دون هزاز (ثلاثة) 3.
- غسل العينات 3X 10 دقيقة مع كل برنامج تلفزيوني 1X
- إذا كان ذلك مناسبا ، ملون مباين الشرانق (مثال صمة عار علينا النوى مع دابي [4 '،6 - diamidino - 2 - phenylindole] مخففة في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة).
- يوازن العينات (لا تقل عن 30 دقيقة) في وسائل الإعلام المناسبة قبل التركيب.
- إعداد شريحة العينة. في التشكل من الشرانق يمنع تصاعد مسطحة. هي التي شنت في البئر عينات من شريحة الاكتئاب (الشريحة قطرة) للتصوير. 75 100ul مكان من وسائل الإعلام في تصاعد الاكتئاب أيضا. يمكن تركيب عدة عينات على شريحة واحدة.
- يجب إزالة حالة خادرة من العينات قبل التركيب. فهم حالة الفرد خادرة يجري الأمامية تأكد من عدم فهم الغشاء الداخلي العذراء.
- مع الزوج الثاني من ملقط فهم بلطف الغشاء الداخلي العذراء من قبل رئيس وإزالته من حالة العذراء.
- نقل على الفور إلى عينة من الاكتئاب وكذلك متابعة معالجة عينات إضافية.
- باستخدام الملقط أو موقف المسبار عينات بشكل موحد في الاكتئاب جيدا مع السطح الوحشي مواجهة. ويمكن إزالة فقاعات الهواء في بعض الأحيان مع التحقيق.
- انخفاض بلطف ساترة على العينات مع الحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء
4. ممثل النتائج :
إعداد العينات باستخدام هذا البروتوكول الإبقاء على التشكل الإجمالي من البطن الكبار. قد يكون من المتوقع مداخن الصورة لتوليد صورة ثنائية الأبعاد أو جعلها 3 - D يمكن تطبيقها لتحقيق طوبولوجيا البطن.
الشكل 1. وكانت تصور في 26 ساعة بعد تشكيل puparium (APF) مع الماوس المضادة للWG (4D4 : أيوا ورم هجين البنك الدولي) : منتجات التجزئة في جينات ذبابة الفاكهة البروتين الشرانق مجنح والتعبير Engrailed (UAS - GFP اون gal4). ومكافحة GFP. التكبير 10x ، هو الأمامي الأيسر والظهري متروك. وcounterstained Nucleii مع دابي.
وكان من المتوقع حوالي 50 رزمة من الصور (ΔZ بين شرائح غير 2.5μm).
Discussion
ويمكن استخدام التقنيات المعروضة في هذا الفيديو لإعداد عذارى ذبابة الفاكهة من مجموعة متنوعة من النقاط الزمنية التنموية. الشرانق معالجتها خلال الفترة من 24 ساعة إلى 32 ساعة APF APF هي الأكثر عرضة لفقدان الخلية من الظهارة. استخدام المنظفات (مثل 100 - X تريتون وتوين 20) خلال الخطوات حضانة طويلة يزيد من احتمال فقدان الخلية وبالتالي لا يوصى. بدلا من ذلك ، يتم استخدام حمض deoxycholic باعتبارها خطوة المنظفات خلال التثبيت الأولي. يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في برنامج تلفزيوني 1X دون المنظفات. بالإضافة إلى ذلك ، هزاز عينات خلال الخطوات حضانة طويلة يزيد من فقدان الخلية ويجب تجنبها.
ولا يمكن تصوير العينات باستخدام تقنيات الفحص المجهري متحد البؤر. ويمكن أيضا ومع ذلك ، ذبابة الفاكهة الشرانق معالجتها كما هو موضح يمكن تصوير المجهري باستخدام الإضاءة هيكلة النظام العائد جودة الصورة مشابهة لتقنيات مبائر.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة من مؤسسة العلوم الوطنية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection stereomicroscope | |||
| Surgical forceps | |||
| Surgical scalpel with number 11 blades | |||
| Nine-well glass depression dishes | Corning | 7220-85 | |
| Humid chamber for culturing pupae | |||
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| #11 surgical scalpel | |||
| double-sided tape | |||
| Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization) | |||
| p100 or p200 pipettor | |||
| Depression well microscope slides (0.8 mm) |
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
