Summary
抗体染色
Abstract
果蝇蛹腹部为上皮细胞的形态发生和发展 1-3性二态形态研究建立的模型系统。在化蛹，跨度约96小时（在25 ° C），成虫细胞增殖人口取代幼虫表皮产生成人腹部分部。这些成虫细胞，胚胎发育过程中出生的，存在对每个幼虫腹节侧histoblast巢。四双histoblast巢会引起成年背角质层（前部和后部的背巢），腹面角质层（腹侧巢），并与各分部（气门巢 ）4相关的气孔。 puparation后，这些二倍体细胞（按大小区分多倍体幼虫的表皮细胞，晶状体上皮细胞）开始的晶状体上皮细胞的增殖，迁移和更换的陈旧观念的过程。可以采用不同的分子和遗传工具，调查涉及成人的腹部形态发生的遗传途径的贡献。极致的成人表型是典型的分析成人腹部表皮以下的夹层。然而，调查的基本分子过程需要蛹上皮细胞的免疫组织化学分析，这为我们带来了独一无二的的挑战。时间上的动态形态发生和两个不同的上皮人口（幼虫和成虫）的相互作用生成一个脆弱的组织，容易清扫和后续处理过程中细胞过度损失。我们已经制定了清扫，固定，安装和果蝇蛹abdominem上皮细胞生成适合焦或标准的荧光显微镜的一贯的高品质样本的免疫组织化学研究的成像方法。
Protocol
1。第1天
开始之前：
健康人群中的苍蝇应保持使用标准培养协议：删除后3-4天的鸡蛋打好，并允许发展在一个恒定的温度徘徊，直到第三龄幼虫启动pupariation瓶或小瓶成人。幼虫/蛹过渡的标志是形成prepupae（0小时后，认为puparium形成，薏仁）。不动的蛹是他们的白的色彩从旧的蛹和幼虫尚未开始了他们的长椭圆形，圆润的造型和前气孔突pupariation的尊敬。
你将需要：
- 一个收集蛹的油漆刷
- 内衬一个培养皿中培养蛹湿热试验箱：湿纸巾，滤纸收集，基因型或蛹的性别不同时间点标记
- 1X磷酸盐缓冲液（PBS洗涤蛹）
收集，培育和分期蛹
- 使用湿画笔轻轻取出培养瓶/瓶0hr薏仁蛹和它们放置在湿热试验箱的盖子。
- 使用画笔和1X PBS轻轻洗蛹，从蛹的情况下删除的碎片
- 如果需要排序按性别蛹。蛹性腺原基可用于排序的男女。男性性腺原基是一双很容易通过的约2 / 3，上下身体的长度5蛹角质层的半透明光盘的外侧。女性的性腺原基较小，不容易确定。
- 蛹放置在适当标记的位置，在潮湿的室内恒温返回。文化发展到适当的时间点。
2。第2天：清扫，固定和初级抗体孵育
开始之前：
你将需要：
- 解剖立体显微镜
- 手术钳
- 外科手术刀与数11刀片
- 两个9以及玻璃抑郁菜（7220-85＃康宁产品）
- 填写一个菜用1X PBS井：这是冲洗清洁解剖蛹菜
- 第二盘与固定缓冲填充井
- 湿热试验箱抗体孵育。我们使用塑料密封的夹层内衬与湿纸巾盒。
- 固定缓冲液：1X PBS，4％多聚甲醛，0.2％去氧胆酸（通透）
- 夹层平台：坚持一方的双面胶带清除显微镜幻灯片
- 1X PBS
- P100或P200移液器
解剖
- 使用镊子轻轻取出一次蛹之一，他们面临的最广泛的磁带宽度蛹的前端放在夹层平台。如果蛹过分潮湿，印迹他们干用纸巾。
- 蛹之前已经完全坚持到磁带上，用画笔位置。
- 允许蛹空气干燥，并坚持到磁带（5-10分钟）
- 与外科手术刀解剖双边每个蛹。前蛹后用一个单一的快速削减，这是最好的。如果正确完成，削减将平分前部和后部的气孔对。剖析作为洗涤和清洁的样品迅速是必要的，以防止蛋白水解损害组织的时间不超过10蛹。
- 使用画笔，转让少量的1X PBS每个解剖蛹放松他们从磁带。
清洁，固定和初级抗体孵育
- 随着对手术钳抓住个别蛹一半前方和立即沉浸在一个良好的清洗盘。应改为显微镜舞台上的漂洗菜夹层平台。蛹的情况下，应保留的样本，直到处理完成后，和样品准备安装。
- 虽然仍然抓蛹一半使用移液器轻轻洗去腹部的内部组织。在清洗过程中的太多的压力也可导致上皮细胞的损失。
- 立即转移清洁蛹一半固定缓冲液在室温下，同样的过程中剩余的蛹半。应采取与实践，清扫和清洗20蛹半不到5分钟。
- 允许蛹到固定缓冲区为1（一）小时，在室温下孵育。
- 在1X PBS冲洗固定蛹3X五分钟
- 样品可立即进行免疫组化处理，或可存储100％的乙醇在-20 ° C至3个月，不丧失的细胞或抗原表位反应。
- 要储存样品，平衡通过稀释样品PBS的系列：在室温为20分钟，每个稀释度的温度前，转移到100％乙醇的乙醇（3:1，1:1，1:3）。
- 样品必须重新平衡通过反向系列免疫组织化学处理前的PBS。
- 除了初级抗体之前阻止样品1（一）小时1X PBS（2％牛血清白蛋白补充）。
- 孵育抗体在夜间在1X PBS稀释至适当浓度4 °没有摇摆彗星。
3。第3天：中抗体孵化，安装和成像
开始之前：
你将需要：
- 两个手术钳
- 安装介质（甘油，矢量Vectashield [实验室]，或Slowfade黄金[Invitrogen公司]）
- 萧条以及显微镜载玻片（0.8毫米）
- 盖玻片（24 × 40毫米）
二抗孵育和安装：
- 洗净样品3X 10分钟，用1X PBS
- 此外之前的二级抗体阻止样品1（一）小时1X PBS（2％的牛血清白蛋白补充）。
- 孵育二级抗体在室温下在黑暗中没有适当的浓度在1X PBS稀释为3（3）小时摇摆。
- 洗净样品3X 10分钟，用1X PBS
- 如果合适，染液蛹（示例我们的DAPI核染色[4',6 - diamidino - 2 -苯基吲哚] PBS稀释10分钟）。
- 在安装前的适当媒体平衡的样本（至少30分钟）。
- 准备一个样本幻灯片。蛹的形态，防止平面安装。抑郁症幻灯片成像（下降幻灯片）以及安装在样品。在抑郁症以及安装媒体广场75 - 100ul。一些样品，可安装在一个单一的幻灯片。
- 蛹的情况下，必须从样本中删除后再安装。抓住个别蛹的情况下，前方确保不掌握内部蛹膜。
- 随着第二对镊子轻轻抓住头内部的蛹膜，从蛹的情况下删除。
- 立即将样本的抑郁症，并继续处理额外的样品。
- 使用探针或镊子的位置，样品中的抑郁症以及侧面朝上均匀。偶尔的气泡可以用探针移除。
- 轻轻地照顾到的样品盖玻片不引入气泡
4。代表性的成果：
样品准备使用该协议保留的成年人腹部的大体形态。可投射图像堆栈生成一个二维图像或3 - D渲染，可应用于腹部拓扑调查。
图1。与鼠抗- WG（4D4：爱荷华州的杂交瘤细胞银行）和抗GFP 基因在果蝇蛹的分割产品无翅的蛋白质和Engrailed表达（EN - GAL4 UAS - GFP）。puparium形成后的26小时（APF）的可视化。 10倍的放大倍率，前左和背。 Nucleii counterstained用DAPI。
成堆的约50幅图像（ΔZ之间切片2.5μm）预计。
Discussion
在这个视频中介绍的技术可以被用来从果蝇蛹的发育时间点的各种准备。蛹处理，32小时在24小时内薏仁薏仁是最容易从上皮细胞的损失。延长孵化步骤的过程中使用的洗涤剂（如TRITON X - 100和Tween - 20）增加细胞的损失的可能性，因此不推荐。相反，去氧胆酸是用来作为洗涤剂，在最初的固定步骤。在1X PBS不用洗衣粉的所有后续步骤进行。此外，摇摆样本期间延长孵化步骤，增加细胞的损失，应当避免。
样品可以利用共聚焦显微镜技术成像。然而， 果蝇蛹处理，也可以使用结构照明显微镜系统产生的图像质量相媲美共聚焦技术成像。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由国家科学基金会的赠款支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection stereomicroscope | |||
| Surgical forceps | |||
| Surgical scalpel with number 11 blades | |||
| Nine-well glass depression dishes | Corning | 7220-85 | |
| Humid chamber for culturing pupae | |||
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| #11 surgical scalpel | |||
| double-sided tape | |||
| Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization) | |||
| p100 or p200 pipettor | |||
| Depression well microscope slides (0.8 mm) |
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
