Summary
Coloration des anticorps de la
Abstract
L'abdomen drosophile nymphe est un système modèle établi pour l'étude de la morphogenèse épithéliale et le développement des maladies sexuellement dimorphique morphologies 1-3. Pendant la nymphose, qui s'étend sur environ 96 heures (à 25 ° C), les populations de cellules proliférantes imaginale des larves de remplacer l'épiderme pour générer des segments abdominaux pour adultes. Ces cellules imaginales, né pendant l'embryogenèse, exister en tant que paires latérales de nids histoblast dans chaque segment abdominal de la larve. Quatre paires de nids histoblast donner lieu à la cuticule adulte dorsale (antérieure et postérieure nids dorsale), la cuticule ventrale (nids ventrale) et les stigmates associés à chaque segment (nids spiracle) 4. Sur puparation, ces cellules diploïdes (reconnaissables à la taille du plus grand des polyploïdes larvaires épiderme des cellules-ESL) d'entamer un processus stéréotypés de la prolifération, la migration et le remplacement des ESL. Différents outils moléculaires et génétiques peuvent être employées pour étudier la contribution des voies génétiques impliqués dans la morphogenèse de l'abdomen adulte. Phénotypes adultes sont généralement analysées ultime de dissection suivante de l'adulte cuticules abdominale. Toutefois, l'enquête sur les processus moléculaires sous-jacents nécessite des analyses immunohistochimiques de l'épithélium nymphal, qui présentent des défis uniques. Temporellement morphogenèse dynamique et l'interaction de deux populations distinctes épithéliales (larvaire et imaginale) génèrent un tissu fragile sujettes à la perte excessive de cellules lors de la dissection et le traitement ultérieur. Nous avons développé des méthodes de dissection, la fixation, le montage et l'imagerie de l'épithélium drosophile abdominem nymphe pour des études immunohistochimiques qui génèrent des échantillons compatibles de haute qualité adapté à la microscopie confocale fluorescente ou standard.
Protocol
1. Jour 1
Avant de commencer:
Une population en santé des mouches doit être maintenu en utilisant des protocoles standard de culture: retirer les adultes à partir de bouteilles ou flacons après 3-4 jours d'oeuf-laïcs et permettre le développement de procéder à une température constante jusqu'à errance 3 e stade larvaire initier nymphose. La transition des larves / nymphes est marquée par la formation de la prénymphes (considéré 0 heures après la formation de puparium-CSA). Nymphes immobiles se distinguent des anciennes nymphes par leur coloration blanche et à partir des larves qui n'ont pas encore commencé nymphose par leur forme oblongue, de forme arrondie et la protrusion des stigmates antérieurs.
Vous aurez besoin de:
- Un pinceau pour la collecte des pupes
- Une chambre humide pour les nymphes de culture: Une boîte de Pétri bordée de serviette en papier mouillé et recouvert d'un papier filtre marquée pour les différents moments de la collecte, le génotype ou le sexe des pupes
- Phosphate 1X saline tamponnée (PBS) pour le lavage des pupes
Pupes Collection, la culture et de la tenue
- Utiliser un pinceau mouillé retirez délicatement 0 HEURES APF pupes dans des flacons de culture / flacons et les placer dans le couvercle de la chambre humide.
- Utiliser le pinceau et du PBS 1X laver délicatement les chrysalides pour enlever les débris de l'affaire nymphe
- Si nécessaire, le tri par sexe des pupes. Les ébauches des gonades de pupes peuvent être utilisées pour trier les sexes. Les primordia mâle gonades sont une paire de disques latéraux translucides facilement vu à travers la cuticule nymphe environ 2 / 3 la longueur du corps 5. Les ébauches des gonades femelles sont plus petites et pas aussi facilement identifiés.
- Placez les pupes dans la position appropriée étiquetés dans la chambre humide et revenir à température constante. Culture au point de temps de développement appropriés.
2. Jour 2: Dissection, la fixation et l'incubation des anticorps primaires
Avant de commencer:
Vous aurez besoin de:
- Stéréomicroscope Dissection
- Pinces chirurgicales
- Scalpel chirurgical avec le numéro 11 lames
- Deux de neuf plats et la dépression de verre (produit de Corning # 7220-85)
- Remplir les puits d'un plat avec du PBS 1X: C'est le plat de rinçage pour le nettoyage des pupes disséqué
- Remplir les puits de second plat avec le tampon de fixation
- Chambre humide pour l'incubation d'anticorps. Nous utilisons des boîtes en plastique refermable bordée sandwichs avec du papier absorbant mouillé.
- Tampon de fixation: 1x PBS, paraformaldéhyde à 4%, 0,2% d'acide désoxycholique (pour la perméabilisation)
- Dissection plateforme: lame de microscope clair avec un morceau de scotch double-face adhère à un côté
- PBS 1X
- P100 ou P200 pipeteur
Dissection
- En utilisant une pince délicatement retirer un nymphes à la fois et les placer sur la plate-forme de dissection avec l'extrémité antérieure de la pupe face la plus large largeur de la bande. Si les nymphes sont excessivement humide, d'abord éponger les sécher avec une serviette en papier.
- Avant les nymphes ont complètement adhéré à la bande, utilisez un pinceau à leur poste.
- Autoriser les nymphes à l'air sec et adhèrent à la bande (5-10 minutes)
- Avec le scalpel chirurgical disséquer chaque pupes bilatéralement. Le mieux est accompli avec une seule coupure rapide de l'antérieur à l'extrémité postérieure de la pupe. Si elle est correctement effectuée, la coupe coupera la fois antérieures et postérieures paires stigmates. Disséquer pas plus de 10 pupes à une époque que le lavage et le nettoyage des échantillons est vite nécessaire pour prévenir les dommages aux tissus protéolytiques.
- Utiliser un pinceau, de transférer une petite quantité de PBS 1X à chaque pupes disséqué afin de les décoller de la bande.
Nettoyage, la fixation et l'incubation des anticorps primaires
- Avec une paire de pinces chirurgicales saisir une moitié individuelle nymphe avant et immédiatement plonger dans un puits de l'antenne de rinçage. La plate-forme de dissection devrait être remplacé par le plat de rinçage sur la platine du microscope. Le cas pupes doivent être laissés sur l'échantillon jusqu'à la fin du traitement et les échantillons sont prêts pour le montage.
- Alors qu'il était encore saisir la moitié nymphe utiliser une pipette doucement laver les tissus internes de l'abdomen. Trop de pression au cours du lavage peut conduire à la perte de cellules épithéliales.
- Transférer immédiatement la moitié propre chrysalide tampon de fixation à la température ambiante et de traiter les moitiés restantes nymphe similaire. Avec la pratique, la dissection et le lavage des moitiés nymphe 20 devrait prendre moins de 5 minutes.
- Autoriser les pupes à incuber dans un tampon de fixation à la température ambiante pendant 1 (un) heures.
- Rincez fixes pupes 3x cinq minutes dans du PBS 1X
- Les échantillons peuvent être immédiatement traitées, pour l'immunohistochimie ou peuvent être conservés dans l'éthanol à 100% à -20 ° C jusqu'à 3 mois sans perte de cellules ou de réactivité épitope.
- Pour stocker des échantillons, des échantillons s'équilibrer grâce à une dilutionsérie de PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) à température ambiante pendant 20 minutes dans chaque dilution avant de transférer jusqu'à 100% EtOH.
- Les échantillons doivent être rééquilibrée en PBS dans la série inverse avant le traitement pour l'immunohistochimie.
- Bloc échantillons dans du PBS 1X (supplémenté avec 2% d'albumine sérique bovine) pour 1 (une) heure avant l'addition de l'anticorps primaire.
- Incuber avec l'anticorps primaire dilué à la concentration appropriée dans du PBS 1X pendant la nuit à 4 ° C sans balancement.
3. Jour 3: l'incubation d'anticorps secondaire, le montage et l'imagerie
Avant de commencer:
Vous aurez besoin de:
- Deux pinces chirurgicales
- Supports de montage (glycérol, Vectashield [Vector Labs], ou Slowfade Gold [Invitrogen])
- Dépression diapositives microscope ainsi (0,8 mm)
- Lamelles (24 x 40 mm)
D'incubation d'anticorps secondaire et de montage:
- Lavez échantillons 3x 10 minutes chacun avec PBS 1x
- Bloc échantillons dans du PBS 1X (supplémenté avec 2% d'albumine sérique bovine) pour 1 (une) heure avant l'addition d'anticorps secondaire.
- Incuber avec l'anticorps secondaire dilué à la concentration appropriée dans du PBS 1X à température ambiante dans l'obscurité sans bascule pour 3 (trois) heures.
- Lavez échantillons 3x 10 minutes chacun avec PBS 1x
- Le cas échéant, contre-coloration des pupes (exemple, nous coloration des noyaux au DAPI [4 ',6-diamidino-2-phénylindole] dilué dans du PBS pendant 10 minutes).
- Equilibrer les échantillons (minimum de 30 minutes) dans les médias appropriés avant le montage.
- Préparer une diapositive échantillon. La morphologie de la chrysalide empêche de montage à plat. Les échantillons sont montés dans le puits d'une lame de dépression (glisser-déposer) pour l'imagerie. Placer 75 100 ul de milieux de montage dans la dépression ainsi. Plusieurs échantillons peuvent être montés sur une seule lame.
- Le cas nymphe doivent être retirés à partir des échantillons avant le montage. Saisissez un cas individuel nymphe antérieurement en étant sûr de ne pas saisir la membrane interne chrysalide.
- Avec une deuxième paire de pince délicatement saisir la membrane interne nymphe par la tête et le retirer de la coque de nymphose.
- Immédiatement le transfert de l'échantillon à la dépression ainsi et poursuivre le traitement des échantillons supplémentaires.
- L'utilisation d'une position de la sonde ou pince les échantillons de manière uniforme dans la dépression et à la surface latérale vers le haut. Bulles d'air occasionnels peuvent être enlevés avec une sonde.
- Abaissez délicatement la lamelle sur les échantillons en prenant soin de ne pas introduire de bulles d'air
4. Les résultats représentatifs:
Les échantillons préparés en utilisant ce protocole conserver la morphologie de l'abdomen adulte. Piles d'images peuvent être projetées pour générer une image en deux dimensions ou en 3-D de rendu peuvent être appliquées pour étudier la topologie abdomen.
Figure 1. Segmentation des produits de gènes chez la drosophile pupes protéines Wingless et d'expression Engrailed (EN-GAL4: UAS-GFP). Ont été visualisées au 26 heures après la formation puparium (CSA) avec souris anti-GT (4D4: Iowa hybridomes Bank) et anti-GFP. Grossissement 10x, antérieure est à gauche et dorsale est en place. Noyaux ont été contre-colorées avec du DAPI.
Piles d'environ 50 images (Az entre les tranches est 2.5μm) ont été projetés.
Discussion
Les techniques présentées dans cette vidéo peut être utilisée pour préparer la drosophile pupes d'une variété de points de temps de développement. Pupes traitées pendant la période de 24 heures à 32 heures CSA CSA sont les plus sujettes à la perte de cellules de l'épithélium. L'utilisation de détergents (comme le Triton X-100 et le Tween-20) au cours des étapes d'incubation prolongée augmente le risque de perte de cellules et n'est donc pas recommandé. Au contraire, l'acide désoxycholique est utilisé comme un détergent pendant l'étape de fixation initiale. Toutes les étapes suivantes sont effectuées dans du PBS 1X sans détergent. En outre, les échantillons à bascule au cours des étapes d'incubation prolongée augmente la perte de cellules et devrait être évitée.
Les échantillons peuvent être imagées en utilisant des techniques de microscopie confocale. Toutefois, la drosophile pupes traitées comme décrit peuvent également être visualisés à l'aide d'un système de microscopie à illumination structurée produisant une qualité d'image comparable à celle des techniques confocale.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection stereomicroscope | |||
| Surgical forceps | |||
| Surgical scalpel with number 11 blades | |||
| Nine-well glass depression dishes | Corning | 7220-85 | |
| Humid chamber for culturing pupae | |||
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| #11 surgical scalpel | |||
| double-sided tape | |||
| Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization) | |||
| p100 or p200 pipettor | |||
| Depression well microscope slides (0.8 mm) |
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
