Summary
Антитела окрашивание
Abstract
Живот дрозофилы куколки является признанным модельной системы для изучения морфогенеза эпителиальных и развитие половой диморфизм морфологии 1-3. Во время окукливания, который охватывает около 96 часов (при 25 ° С), пролиферирующие популяций имагинальных клетки заменить личиночной эпидермиса генерировать взрослых брюшных сегментов. Эти имагинальных клеток, родившихся в период эмбриогенеза, существует как боковые пары histoblast гнезда в каждом брюшной сегмент личинок. Четыре пары histoblast гнезда приводят к взрослой спинной кутикулы (передний и задний спинной гнезда), вентральной кутикулы (вентральной гнезда) и дыхальца, связанные с каждым сегментом (дыхало гнезда) 4. По puparation, эти диплоидных клеток (отличить по размеру от больших полиплоидных личиночных клеток эпидермиса-МИК) начинают стереотипных процесс пролиферации, миграции и замена МИК. Различные молекулярные и генетические инструменты могут быть использованы для исследования вклада генетических путей, участвующих в морфогенезе взрослых живота. Окончательный фенотипы взрослых, как правило, проанализированы следующие вскрытия брюшной взрослого кутикулу. Тем не менее, исследование основных молекулярных процессов требует иммуногистохимического анализа куколки эпителия, которые представляют уникальные проблемы. Временно динамического формообразования и взаимодействия двух различных популяций эпителия (личиночные и имагинальные) порождают хрупкой ткани склонны к чрезмерной потере клетки во время вскрытия и последующей обработки. Мы разработали методы вскрытия, фиксации, монтажа и визуализации abdominem дрозофилы куколки эпителия для иммуногистохимического исследования, которые создают постоянное высокое качество образцов подходит для конфокальной или стандартной флуоресцентной микроскопии.
Protocol
1. День 1
Прежде чем вы начнете:
Здоровой популяции мух следует поддерживать с помощью стандартных протоколов культивирования: удалите взрослых из бутылок или флаконов после 3-4 дней яйцо лежало и позволит продолжить развитие при постоянной температуре до блуждающих 3-го возраста личинки инициировать pupariation. Личиночной / куколки переход отмечен образованием предкуколок (считается 0 часов после пупария образование-ФПА). Неподвижные куколки отличаются от старых куколки их белую окраску и из личинки, которые еще не начали pupariation их продолговатые, округлые формы и выпячивание передней дыхальца.
Вам понадобятся:
- Кисть для сбора куколки
- Влажной камере для культивирования куколки: чашки Петри выложены смоченный бумажным полотенцем и покрыта фильтровальной бумаги отмечены для различных временных точках сбора, генотип или пол куколки
- 1X фосфатным буферным раствором (PBS) для мытья куколки
Коллекция, культивирования и постановка куколки
- Использование смоченный кистью аккуратно удалить 0hr APF куколки от культуры бутылок / флаконов и разместить их в крышку влажной камере.
- Использование кисти и 1X PBS аккуратно мыть куколки для удаления мусора от случая куколки
- При необходимости сортировать куколки по полу. Гонады зачатков куколки могут быть использованы для сортировки полов. Мужской зачатков гонад являются боковые пары полупрозрачных дисков легко видеть через кутикулу куколки около 2 / 3 всей длине тела 5. Женских зачатков гонад меньше и не так легко определить.
- Место куколок в соответствующей маркировкой позиции в влажной камере и вернуться к постоянной температуре. Культура в соответствующий момент времени развития.
2. День 2: Dissection, фиксация и первичный инкубации антитела
Прежде чем вы начнете:
Вам понадобятся:
- Препарирование стереомикроскопа
- Хирургические щипцы
- Хирургический скальпель с номером 11 лопастей
- Два из девяти и стекла депрессии блюд (Corning продукт # 7220-85)
- Заполните скважин одно блюдо с 1X PBS: Это полоскание блюдо для очистки расчлененный куколки
- Заполните скважин второе блюдо с фиксацией буфер
- Влажная камера для антител инкубации. Мы используем пластиковые герметичные ящики сэндвич выложены смоченный бумажные полотенца.
- Фиксация буфера: 1x PBS, 4% параформальдегида, 0,2% deoxycholic кислоты (пермеабилизации)
- Препарирование платформы: Ясно микроскопический слайд с кусочком двухсторонней ленты придерживался одной стороне
- 1X PBS
- P100 или P200 пипетка
Рассечение
- Использование пинцета аккуратно удалить куколки по одному и разместить их на вскрытии платформы с передним концом куколки перед широкой ширины ленты. Если куколки чрезмерно влажным, первый смоет их насухо бумажным полотенцем.
- Перед куколки полностью придерживался ленты, используйте кисть, чтобы установить их.
- Разрешить куколки высохнуть на воздухе и придерживаться ленты (5-10 минут)
- С хирургическим скальпелем рассекают каждой куколки на двусторонней основе. Лучше всего это достигается с помощью одного быстрого, вырезанные из переднего к заднему концу куколок. Если правильно сделать, сокращения будут делить пополам обе передние и задние дыхальца пар. Рассеките не более 10 куколки в то время, как умывание и чистка образцы быстро необходимо для предотвращения протеолитического повреждения тканей.
- Использование кисти, передача небольшого количества 1X PBS каждому расчлененный куколки, чтобы ослабить их от ленты.
Уборка, фиксация и первичный инкубации антитела
- С парой хирургических щипцов понять отдельные half куколки вперед и сразу же погрузить его в колодец полоскания блюдо. Рассечение платформа должна быть заменена полоскания блюдо на столик микроскопа. Случае куколки должны быть оставлены на образце до завершения обработки и образцы готовы для монтажа.
- Еще захватывая половину куколки использовать пипетки, чтобы аккуратно смыть внутренние ткани живота. Слишком большое давление во время стирки может привести к потере эпителиальных клеток.
- Сразу передачи чистой half куколки к фиксации буфера при комнатной температуре и обработки оставшихся половин куколки аналогично. С практикой, рассечение и мойки 20 половин куколки должно занять менее 5 минут.
- Разрешить куколки для инкубации в фиксации буфера при комнатной температуре в течение 1 (одного) часа.
- Промыть фиксированной куколки 3x пять минут в 1X PBS
- Пробы могут быть немедленно обработаны для иммуногистохимии или могут быть сохранены на 100% этанола при -20 ° С в течение 3 месяцев без потери клеток или эпитопа реактивности.
- Для хранения образцов, равновесие образцов путем разбавлениясерии PBS: этанол (3:1, 1:1, 1:3) при комнатной температуре в течение 20 минут в каждом разбавлении до перехода на 100% этанола.
- Образцы должны быть повторно уравновешенную PBS через обратный серии перед обработкой для иммуногистохимии.
- Блок образцов в 1x PBS (с добавлением 2% бычий сывороточный альбумин) на 1 (один) час до того первичных антител.
- Инкубируйте с первичным антителом разводят до соответствующей концентрации в 1X PBS в течение ночи при 4 ° С без раскачивания.
3. День 3: Среднее инкубации антитела, монтажа и обработки изображений
Прежде чем вы начнете:
Вам понадобятся:
- Два хирургических щипцов
- Монтаж средств массовой информации (глицерин, Vectashield [Векторная Labs], или Slowfade Золото [Invitrogen])
- Депрессия также слайды микроскопом (0,8 мм)
- Покровные стекла (24 х 40 мм)
Вторичные инкубации антитела и монтаж:
- Вымойте образцы 3x 10 минут каждая с 1x PBS
- Блок образцов в 1x PBS (с добавлением 2% бычий сывороточный альбумин) на 1 (один) час до того вторичных антител.
- Инкубируйте с вторичными антителами разводят до соответствующей концентрации в 1X PBS при комнатной температуре в темноте без раскачивания течение 3 (трех) часов.
- Вымойте образцы 3x 10 минут каждая с 1x PBS
- Если это уместно, контрастирующая куколки (пример мы пятно ядер с DAPI [4 ',6-diamidino-2-фенилиндола] разводят в PBS в течение 10 минут).
- Равновесия образцов (не менее 30 минут) в соответствующих средствах массовой информации до начала монтажа.
- Подготовка образцов слайдов. Морфология куколки предотвращает плоский монтаж. Образцы устанавливаются в скважине депрессию слайд (падение слайд) для работы с изображениями. Место 75-100 мкл монтажа средств массовой информации в депрессии хорошо. Несколько образцов может быть установлен на одном слайде.
- Случае куколки должны быть удалены из образцов до монтажа. Возьмитесь отдельном случае куколка вперед будучи уверенным, что не понять внутренние куколки мембраны.
- С второй парой щипцов осторожно понять внутренние куколки мембраны голову и удалить его из куколки случае.
- Сразу передачи образца депрессия хорошо и продолжить обработку дополнительных образцов.
- Использование зонда или пинцетом положение образцы равномерно в депрессии и с боковой поверхностью вверх. Иногда пузырьки воздуха могут быть удалены с помощью зонда.
- Осторожно опустите покровное на образцы заботясь, чтобы не вводить пузырьков воздуха
4. Представитель результаты:
Образцы, приготовленные с помощью этого протокола сохраняют валового морфологии взрослых живота. Изображение стеки могут проецироваться для создания двумерного изображения или 3-D рендеринга могут быть применены для исследования брюшной полости топологии.
Рисунок 1. Сегментация продуктов генов у дрозофилы куколки Wingless белка и Engrailed выражение (En-GAL4: UAS-GFP). Визуализировались в 26 час после пупария образования (НПФ) с помощью мыши анти-Wg (4D4: Айова Гибридома банк) и анти-GFP. 10-кратным увеличением, передняя остается и спинной вверх. Nucleii были контрастно с DAPI.
Стеки около 50 изображений (ΔZ между среза 2,5 мкм) были спроектированы.
Discussion
Методы, представленные в этом видео можно использовать для подготовки дрозофилы куколки из различных временных точках развития. Куколки обрабатываются в течение 24 часов APF до 32 часов АПФ наиболее подвержены потерю клеток из эпителия. Использования моющих средств (например, тритон Х-100 и Твин-20) во время длительного инкубационного шаги увеличивает вероятность потерю клеток, и поэтому не рекомендуется. Скорее, deoxycholic кислота используется в качестве моющего средства на первоначальном этапе фиксации. Все последующие шаги выполняются в 1X PBS без моющего средства. Кроме того, покачиваясь образцов при длительном шаги инкубации увеличивает потерю клеток и их следует избегать.
Образцы могут быть отображены с помощью конфокальной микроскопии. Тем не менее, дрозофилы куколки обрабатывается, как описано может также быть отображены с помощью структурированной системы микроскопии освещения уступая качество изображения сравнимо с конфокальной техники.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection stereomicroscope | |||
| Surgical forceps | |||
| Surgical scalpel with number 11 blades | |||
| Nine-well glass depression dishes | Corning | 7220-85 | |
| Humid chamber for culturing pupae | |||
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| #11 surgical scalpel | |||
| double-sided tape | |||
| Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization) | |||
| p100 or p200 pipettor | |||
| Depression well microscope slides (0.8 mm) |
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
