Summary
Tinción de los anticuerpos
Abstract
El abdomen de Drosophila pupa es un sistema modelo establecido para el estudio de la morfogénesis del epitelio y el desarrollo de morfologías sexualmente dimórficos 1-3. Durante la fase de pupa, que se extiende por aproximadamente 96 horas (a 25 ° C), las poblaciones de la proliferación de las células imaginales reemplazar la epidermis larval para generar los segmentos abdominales adulto. Estas células imaginal, nacido durante la embriogénesis, existen como pares de nidos histoblast lateral en cada segmento abdominal de las larvas. Cuatro pares de nidos histoblast dar lugar a la cutícula del adulto dorsal (nidos dorsal anterior y posterior), la cutícula ventral (nidos ventral) y los espiráculos asociados a cada segmento (nidos espiráculo) 4. Al puparation, estas células diploides (que se distingue por el tamaño de las larvas más grandes poliploides células epidérmicas-LEC) iniciar un proceso estereotipado de la proliferación, la migración y la sustitución de la LEC. Varias herramientas moleculares y genéticos pueden ser empleados para investigar la contribución de mecanismos genéticos implicados en la morfogénesis del abdomen adulto. Fenotipos última adultos suelen ser analizado después de la disección de los adultos cutículas abdominal. Sin embargo, la investigación de los procesos moleculares que subyacen requiere un análisis inmunohistoquímico del epitelio de pupa, que presentan desafíos únicos. Temporalmente la morfogénesis dinámica y las interacciones de dos poblaciones distintas epiteliales (las larvas y imaginal) generar un tejido frágiles propensas a la pérdida excesiva de células durante la disección y posterior procesamiento. Hemos desarrollado métodos de disección, fijación, montaje y la imagen del epitelio abdominem Drosophila pupa para estudios inmunohistoquímicos que generan consistentes muestras de alta calidad adecuada para la microscopía de fluorescencia confocal o estándar.
Protocol
1. Día 1
Antes de empezar:
Una población sana de la mosca se debe mantener a través de protocolos estándar de cultivo: eliminar adultos a partir de botellas o frascos después de 3-4 días de huevo-laicos y permitir el desarrollo de proceder a una temperatura constante hasta que vagar 3 de larvas iniciar pupariation. La transición de larva / pupa se caracteriza por la formación de la prepupas (considera 0 horas después de la formación de pupa-APF). Pupas inmóviles se distinguen de los mayores pupas por su coloración blanca y de las larvas que aún no han comenzado pupariation por su alargada, forma redondeada y saliente de los espiráculos anteriores.
Usted necesitará:
- Un pincel para recoger las pupas
- Una cámara húmeda para pupas cultivo: una placa de Petri llenas de toalla de papel húmeda y cubierta con papel de filtro para el marcado varios momentos de la recogida, el genotipo o el sexo de las pupas
- 1X fosfato (PBS) para el lavado de las pupas
Recolección, el cultivo y la puesta en escena pupas
- Con un pincel mojado retire suavemente 0hr pupas APF de las botellas de la cultura / viales y colóquelos en la tapa de la cámara húmeda.
- Utilizando el pincel y PBS 1X lavar suavemente las pupas para eliminar los restos de la caja pupa
- Si es necesario ordenar las pupas por sexo. Los primordios de las gónadas de las pupas se pueden utilizar para ordenar los sexos. El macho primordios gonadales son un par de discos lateral translúcida fácilmente visible a través de la cutícula pupal aproximadamente 2 / 3 a lo largo del cuerpo 5. La hembra primordios gonadales son más pequeños y no se identifican con la misma facilidad.
- Colocar las pupas en la posición estén debidamente etiquetados en la cámara húmeda y se vuelva a la temperatura constante. La cultura hasta el punto de tiempo de desarrollo apropiado.
2. Día 2: Disección, fijación e incubación del anticuerpo primario
Antes de empezar:
Usted necesitará:
- La disección estereoscópica
- Fórceps quirúrgicos
- Bisturí quirúrgico con el número 11 hojas
- Dos de nueve y platos de cristal depresión (Corning # 7220-85)
- Llenar los pozos de una placa con PBS 1X: Este es el plato lavado para la limpieza de las pupas disecados
- Llenar los pozos de segundo plato con el tampón de fijación
- Cámara húmeda para la incubación de anticuerpos. Utilizamos cajas de plástico herméticos sándwich cubierto con toallas de papel húmedas.
- Tampón de fijación: 1x PBS, paraformaldehído al 4%, 0,2% de ácido desoxicólico (para la permeabilización)
- Plataforma de disección: portaobjetos abierto con un trozo de cinta de doble cara adherido a un lado
- 1X PBS
- p100 o p200 pipeta
Disección
- El uso de pinzas retire suavemente una pupa en un momento y lugar en la plataforma de disección con el extremo anterior de la pupa se enfrenta el amplio ancho de la cinta. Si pupas son excesivamente húmedo, primera mancha secar con una toalla de papel.
- Antes de las pupas tienen completamente adherido a la cinta, utilice una brocha para la posición.
- Permita que las pupas se sequen al aire y se adhieren a la cinta (5-10 minutos)
- Con el bisturí quirúrgico diseccionar cada pupas bilateral. Esto se logra mejor con un solo corte rápido de la parte anterior del extremo posterior de la pupa. Si se hace correctamente, el corte será dividir en dos pares de espiráculos anteriores y posteriores. Diseccionar no más de 10 pupas en un momento como el lavado y limpieza de las muestras con rapidez es necesaria para evitar daños a los tejidos proteolíticas.
- Usando un pincel, la transferencia de una pequeña cantidad de PBS 1X a cada pupas disecados para evitar que se peguen a la cinta.
Limpieza, fijación y la incubación del anticuerpo primario
- Con un par de pinzas quirúrgicas captar un individuo medio pupa anterior e inmediatamente se sumergen en un pozo de la placa de enjuague. La plataforma de la disección debe ser sustituido por el plato de enjuague en la platina del microscopio. El caso de las pupas se debe dejar en la muestra hasta que se complete el proceso y las muestras están listas para el montaje.
- Aunque sin soltar la mitad pupa utilizar una pipeta para lavar suavemente el tejido interno del abdomen. El exceso de presión durante el lavado se puede llevar a la pérdida de las células epiteliales.
- Inmediatamente la transferencia de la limpieza medio pupa para amortiguar la fijación a temperatura ambiente y el proceso de los restantes pupa mitades de manera similar. Con la práctica, la disección y el lavado de 20 mitades pupa debe tener menos de 5 minutos.
- Permita que las pupas de incubación en tampón de fijación a temperatura ambiente durante 1 (una) hora.
- Enjuague fija pupas 3x cinco minutos en PBS 1X
- Las muestras pueden ser inmediatamente procesados para inmunohistoquímica o se puede almacenar en el 100% de etanol a -20 ° C hasta por 3 meses sin pérdida de las células o reactividad epítopo.
- Para almacenar las muestras, las muestras se equilibran a través de una diluciónserie de PBS: EtOH (3:1, 1:1, 1:3) a temperatura ambiente durante 20 minutos en cada dilución antes de transferirlos al EtOH al 100%.
- Las muestras deben ser re-equilibrada en PBS a través de la serie antes de la transformación inversa para inmunohistoquímica.
- Bloque de muestras en 1x PBS (complementado con bovinos 2% de albúmina sérica) a 1 (una) hora antes de la adición del anticuerpo primario.
- Se incuba con el anticuerpo primario diluido a la concentración adecuada en 1X PBS durante la noche a 4 ° C, sin balanceo.
3. Día 3: incubación del anticuerpo secundario, el montaje y la imagen
Antes de empezar:
Usted necesitará:
- Dos pinzas quirúrgicas
- Medios de montaje (glicerol, Vectashield [Vector Labs], o Slowfade Oro [Invitrogen])
- Diapositivas depresión microscopio y (0,8 mm)
- Cubreobjetos (24 x 40 mm)
Incubación del anticuerpo secundario y montaje:
- Lávese las muestras de 3x 10 minutos cada uno con PBS 1x
- Bloque de muestras en 1x PBS (complementado con bovinos 2% de albúmina sérica) a 1 (una) hora antes de la adición del anticuerpo secundario.
- Incubar con el anticuerpo secundario diluido a la concentración adecuada en 1X PBS a temperatura ambiente en la oscuridad sin balanceo de 3 (tres) horas.
- Lávese las muestras de 3x 10 minutos cada uno con PBS 1x
- En su caso, de contraste pupas (Ejemplo que mancha los núcleos con DAPI [4 ',6-diamidino-2-phenylindole] diluido en PBS durante 10 minutos).
- Equilibrar las muestras (un mínimo de 30 minutos) en un medio adecuado antes de montar.
- Prepare una diapositiva de muestra. La morfología de las pupas impide el montaje plano. Las muestras se montan en el pozo de la depresión de una diapositiva (slide drop) para obtener imágenes. Lugar de 75 100 ul de medio de montaje en la depresión también. Varias muestras pueden ser montados en una sola diapositiva.
- El caso de pupa se debe quitar de las muestras antes de su montaje. Tome un individuo pupa caso anterior asegurándose de no comprender la membrana interna de pupa.
- Con un segundo par de pinzas de agarre suave de la membrana interna de las pupas de la cabeza y sacarlo de la envoltura pupal.
- Inmediatamente la transferencia de la muestra a la depresión, así y continuar el procesamiento de muestras adicionales.
- Usando una posición de la sonda o con pinzas las muestras de manera uniforme en la depresión y con la superficie lateral hacia arriba. Burbujas de vez en cuando el aire puede ser removido con una sonda.
- Baje suavemente el cubreobjetos sobre las muestras con cuidado de no introducir burbujas de aire
4. Los resultados representativos:
Las muestras preparadas con este protocolo conservar la morfología general del abdomen adulto. Las pilas de la imagen puede ser proyectada para generar una imagen de dos dimensiones o de la prestación en 3-D puede ser aplicado para investigar la topología de abdomen.
Figura 1. Productos de la segmentación de genes en Drosophila pupas proteína sin alas y la expresión Engrailed (In-GAL4: UAS-GFP). Se visualizaron en 26 horas después de la formación pupario (APF) con el ratón anti-WG (4D4: Iowa hibridoma Banco) y anti-GFP. Un aumento de 10x, es anterior a la izquierda y dorsal está arriba. Núcleos se counterstained con DAPI.
Las pilas de aproximadamente 50 imágenes (ΔZ entre rebanadas es 2.5μm) fueron proyectados.
Discussion
Las técnicas presentadas en este video se puede utilizar para preparar Drosophila pupa de una variedad de puntos de tiempo de desarrollo. Pupas procesado durante el período de 24 horas a 32 horas APF APF son más propensos a la pérdida de células del epitelio. El uso de detergentes (como el Triton X-100 y Tween-20) durante las etapas de incubación prolongado aumenta la probabilidad de pérdida de células y por lo tanto no se recomienda. Por el contrario, ácido desoxicólico se utiliza como un detergente durante la etapa de fijación inicial. Todos los pasos posteriores se realizan en PBS 1X sin detergente. Además, meciéndose muestras durante las etapas de incubación prolongado aumenta la pérdida de células y se debe evitar.
Las muestras pueden tomarse imágenes mediante técnicas de microscopía confocal. Sin embargo, Drosophila pupas procesaron como se describe también se pueden visualizar mediante un sistema de iluminación microscopía estructurado dando una calidad de imagen comparable a las técnicas de confocal.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Nacional de Ciencias.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection stereomicroscope | |||
| Surgical forceps | |||
| Surgical scalpel with number 11 blades | |||
| Nine-well glass depression dishes | Corning | 7220-85 | |
| Humid chamber for culturing pupae | |||
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | |||
| #11 surgical scalpel | |||
| double-sided tape | |||
| Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization) | |||
| p100 or p200 pipettor | |||
| Depression well microscope slides (0.8 mm) |
References
- Kopp, A., Duncan, I. Anteroposterior patterning in adult abdominal segments of Drosophila. Dev. Biol. 242, 15-30 (2002).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Matsuda, R. in Morphology and evolution of the insect abdomen. , Pergamon Press. Oxford. (1976).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in Drosophila Melanogaster. Genetics. 16, 212-224 (1931).
