Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Summary

Antikor boyama

Abstract

Drosophila pupa karın epitel morfolojilerinden çalışma ve cinsel dimorfik ^1-3 morfolojileri gelişimi için kurulmuş bir model sistem. (25 ° C) yaklaşık 96 saat boyunca pupa devresi sırasında, hayali hücreleri prolifere popülasyonlar erişkin karın segmentleri üretmek için larva epidermisi değiştirin. Bu hayali hücreleri, embriyogenez sırasında doğan, larvaların her karın segment histoblast yuva yan çift olarak var. Histoblast yuva dört çift yetişkin dorsal kütikül (anterior ve posterior dorsal yuvalar), ventral kütikül (ventral yuvalar) ve her segmentin (hava deliği yuvalar) ⁴ ile ilişkili spiracles neden olmaktadır. Puparation üzerine, bu diploid hücrelerinde (büyük polyploid larva epidermal hücreler-LECs boyutuna göre ayırt) proliferasyon, göç ve LECs değiştirilmesi basmakalıp bir süreç başlar. Çeşitli moleküler ve genetik araçları yetişkin karın morfonogenezi yer alan genetik yollarının katkıları araştırmak için istihdam edilebilirler. Ultimate yetişkin fenotiplerinin genellikle yetişkin karın tırnak etlerini aşağıdaki diseksiyon analiz edilmektedir. Ancak, altta yatan moleküler süreçlerin incelenmesi benzersiz zorluklar pupa epitel immünohistokimyasal analizleri, gerektirir. Geçici olarak iki ayrı epitel nüfus (larva ve hayali), dinamik morfolojilerinden ve etkileşimleri, diseksiyon ve daha sonraki işleme sırasında aşırı hücre kaybı eğilimli kırılgan bir doku oluşturur. Diseksiyon, sabitleme, montaj ve tutarlı yüksek kaliteli örnekleri konfokal veya standart floresan mikroskopi için uygun oluşturmak immunohistokimyasal çalışmalar için Drosophila pupa abdominem epitel görüntüleme yöntemleri geliştirmişlerdir.

Protocol

1. 1. Gün

Başlamadan önce:

Sinek sağlıklı bir nüfus standart kültür protokolleri kullanarak muhafaza edilmelidir: yumurta yatıyordu ve geliştirme ^3. instar larvaları pupariation başlatmak dolaşıp kadar sabit bir sıcaklıkta devam etmek için izin 3-4 gün sonra, şişe veya şişeleri yetişkin kaldırmak . Larva / pupa geçiş prepupae (0 saat sonra kabul puparium oluşumu-APF) oluşumu ile işaretlenir. TAŞINMAZ pupa beyaz renklenme büyük pupa ve larvalar, henüz dikdörtgen, yuvarlak şekilli ve ön spiracles çıkıntısı pupariation başlamamış ayırt edilirler.

Şunlara ihtiyacınız olacak:

• Pupa toplamak için bir boya fırçası
• Kültür pupa için nemli odasına: Petri kabı ıslatılmış kağıt havlu ile kaplı ve pupa toplanması, genotip ya da cinsel çeşitli noktalarında işaretlenmiş filtre kağıdı ile kaplı
• 1X Fosfat pupa yıkamak için tamponlu salin (PBS)

Koleksiyon, kültür ve evreleme pupa

1. Islak bir fırça kullanarak 0hr APF pupa kültürü şişeleri / flakon yavaşça kaldırın ve nemli haznesinin kapağı koyun.
2. Fırça ve 1X PBS kullanarak pupa pupa halinde enkaz kaldırmak için hafifçe yıkayın
3. Eğer gerekli sıralama, cinsiyete göre pupa. Pupa gonad primordia cinsiyetler sıralamak için kullanılabilir. Erkek gonad primordia saydam diskler, yaklaşık 2 / ³ 5 vücut uzunluğu aşağı pupa manikür yoluyla kolayca görülen bir yan çifti . Kadın gonad primordia küçük ve kolayca tespit edilmemiştir.
4. Pupa nemli odasında uygun etiketli pozisyonda yerleştirin ve sabit sıcaklıkta dönmek. Kültür uygun gelişimsel bir zaman noktasında.

2. 2. Gün: Diseksiyon, fiksasyon ve primer antikor inkübasyon

Başlamadan önce:

Şunlara ihtiyacınız olacak:

• Diseksiyon stereomikroskopta
• Cerrahi forseps
• Cerrahi neşter sayısı 11 bıçaklar
• İki dokuz iyi cam depresyon yemekleri (Corning ürün # 7220-85)
  • 1X PBS ile bir çanak kuyu doldurun: Bu disseke pupa temizlik için durulama çanak
  • Fiksasyon tamponu ile ikinci çanağı kuyu doldurun
• Antikor inkübasyon için Nemli odası. Biz, ıslatılmış kağıt havlu ile kaplı plastik yapışmalı, sandviç kutuları kullanın.
• Fiksasyon tampon: 1x PBS,% 4 paraformaldehid,% 0.2 deoxycholic asit (permeabilization için)
• Diseksiyon platformu: Clear mikroskop lamı, bir tarafında çift taraflı bant yapıştırılır bir parça ile
• 1X PBS
• P100 veya P200 pipet

Diseksiyon

1. Forseps kullanarak hafifçe pupa tek bir seferde kaldırmak ve geniş bant genişliği karşı karşıya pupa ön ucu ile diseksiyon platformu üzerine koyun. Pupa aşırı ıslak ise, ilk, kağıt havlu ile kurulayın kurulayın.
2. Pupa tamamen bant yapıştırılır önce, yerleştirmek için bir fırça kullanın.
3. İzin hava kuru pupa ve bant (5-10 dakika) bağlı
4. Bilateral cerrahi bistüri ile her pupa teşrih. Bu en iyi ön pupa arka sonuna kadar tek bir hızlı kesim gerçekleştirilir. Eğer doğru yapılırsa, kesme, ön ve arka spiracles çiftleri iki eşit parçaya böler. Yıkama ve hızlı bir şekilde, doku proteolitik hasarı önlemek için gerekli örnekleri temizliği gibi bir seferde en fazla 10 pupa parçalara ayır.
5. Bir fırça kullanarak, bant gevşetin her disseke pupa 1X PBS küçük bir miktar transfer.

Temizleme, fiksasyon ve primer antikor inkübasyon

6. Bir çift cerrahi forseps anteriora bireysel bir pupa yarım kavramak ve hemen durulama çanak iyi batırmayın ile. Diseksiyonu platformu mikroskop sahnede durulama çanak tarafından değiştirilmesi gerekir. Işlemleri tamamlandıktan ve örnekleri montaj için hazır olana kadar pupa halinde numune bırakılmalıdır.
7. Hala açgözlü iken pupa yarısı karın iç doku hafifçe yıkamak için bir pipet kullanın. Yıkama sırasında çok fazla baskı epitel hücrelerinin kaybına yol açabilir.
8. Hemen oda sıcaklığında temiz pupa yarım fiksasyonu tampon transferi ve kalan pupa yarıya benzer bir süreç. 20 pupa yarısının uygulama, teşrih ve yıkama 5 dakikadan daha az almalıdır.
9. Pupa fiksasyonu tampon 1 (bir) saat oda sıcaklığında inkübe izin verin.
10. 1X PBS sabit pupa 3x beş dakika durulayın
11. Örnekleri immünohistokimya için hemen işlenmiş olabilir veya hücreleri veya epitopu reaktivite kaybı olmadan 3 aya kadar, -20 ° C'de% 100 etanol saklanabilir.
12. Örnekleri saklamak için, bir seyreltme yoluyla örnekleri dengelenmesiPBS serisi:% 100 EtOH transfer öncesinde her seyreltme 20 dakika oda sıcaklığında EtOH (3:1, 1:1, 1:3).
13. Örnekleri immünohistokimya için işleme önce ters dizi PBS yeniden dengelenmiş olmalıdır.
14. 1x PBS (2% sığır serum albümini ile desteklenmiş) 1 (bir) saat primer antikor ek önce örnekleri Blok.
15. 4 gece boyunca uygun konsantrasyonu 1X PBS içinde seyreltilir primer antikor ° C sallanan olmadan inkübe edin.

3. 3. Gün: Sekonder antikor inkübasyon, montaj ve görüntüleme

Başlamadan önce:

Şunlara ihtiyacınız olacak:

• İki cerrahi forseps
• Montaj medya (gliserol, Vectashield [Vektör Labs], ya da Slowfade Altın [Invitrogen])
• Depresyon iyi mikroskop lamı (0.8 mm)
• Lamelleri (24 x 40 mm)

İkincil antikor kuluçka ve montaj:

1. Örnekleri 3x 1x PBS ile 10 dakika yıkayın
2. Ikincil antikor ek önce 1x PBS (2% sığır serum albümini ile desteklenmiş) 1 (bir) saat örnekleri Blok.
3. 1X PBS uygun konsantrasyon olmadan karanlıkta, oda sıcaklığında 3 (üç) saat sallanan seyreltilmiş ikincil antikor ile inkübe edin.
4. Örnekleri 3x 1x PBS ile 10 dakika yıkayın
5. Eğer uygunsa, counterstain pupa (Örnek DAPI ile çekirdekleri leke [4 ',6-diamidino-2-phenylindole] 10 dakika PBS içinde seyreltilmesi).
6. Montajdan önce uygun ortam örnekleri (en az 30 dakika) dengelenmesi.
7. Bir örnek slayt hazırlayın. Pupa morfolojisi düz montaj önler. Örnekleri iyi görüntüleme için bir depresyon slayt (damla slayt) monte edilir. Place de depresyon montaj medya 75-100ul. Çeşitli örnekler tek bir slayt monte edilebilir.
8. Pupa halinde montaj edilmeden önce numuneleri uzaklaştırılmalıdır. Anteriora iç pupa membran kavramak için emin bir birey pupa halinde tutun.
9. Ikinci bir çift forseps ile yavaşça başkanı tarafından iç pupa membran kavramak ve pupa halinde çıkarın.
10. Hemen depresyon örnek aktarmak ve ek örnekler işleme devam edin.
11. Lateral yüzeyi yukarı bakacak şekilde depresyon iyi örnekleri düzgün bir prob veya forseps pozisyonu kullanarak. Ara sıra hava kabarcığı, bir sonda ile kaldırılabilir.
12. Yavaşça hava kabarcıklarının tanıtmak için özen örnekleri üzerine lamel düşük

4. Temsilcisi sonuçları:

Örnekler bu protokolü yetişkin karın brüt morfoloji korumak kullanılarak hazırlanmıştır. Resim yığınlarının karın topoloji araştırmak için uygulanabilir bir iki boyutlu görüntü ve 3 boyutlu render oluşturmak için tahmin edilebilir.

Şekil 1. Drosophila pupa Segmentasyondaki gen ürünleri kanatsız protein ve Engrailed ifade (En-gal4: UAS-GFP) ve anti-GFP fare anti-Wg (Iowa Hibridoma Bankası 4D4) ile 26 saat sonra (APF) puparium oluşumu görüntülendi. 10x büyütme, ön sol ve dorsal kadar. Nucleii DAPI ile zıt.

Yaklaşık 50 görüntü (2.5μm dilimleri arasında ΔZ) yığınlar tahmin edildi.

Discussion

Bu video sunulan teknikler gelişimsel zaman noktalarında çeşitli Drosophila pupa hazırlamak için kullanılabilir. 32 saat 24 saat süre APF sırasında işlenmiş pupa APF epitel hücre kaybını en yatkındır. Genişletilmiş İnkübasyon sırasında deterjan kullanımı (örneğin, Triton X-100 ve Tween-20 gibi) hücre kaybı olasılığını artırır ve bu nedenle tavsiye edilmez. Aksine, deoxycholic asit, ilk fiksasyonu adımı sırasında bir deterjan olarak kullanılır. Tüm sonraki basamaklar deterjan olmadan 1X PBS yapılmaktadır. Ayrıca, uzun İnkübasyon sırasında örnekleri sallanan hücre kaybını artırır ve kaçınılmalıdır.

Örnekleri konfokal mikroskopi teknikleri kullanarak görüntülü olabilir. Ancak, Drosophila pupa da anlatıldığı gibi işlenmiş konfokal teknikleri ile kıyaslanabilir görüntü kalitesi veren yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskopi sistemi kullanarak görüntülü olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection stereomicroscope
Surgical forceps
Surgical scalpel with number 11 blades
Nine-well glass depression dishes	Corning	7220-85
Humid chamber for culturing pupae
1X Phosphate buffered saline (PBS)
#11 surgical scalpel
double-sided tape
Fixation buffer: 1x PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% deoxycholic acid (for permeabilization)
p100 or p200 pipettor
Depression well microscope slides (0.8 mm)