אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

Summary

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

Abstract

בתגובה לזיהום נגיפי, מארח מפתחת תגובות הגנתיות שונות, כגון הפעלת מסלולי איתות חיסוניים מולדים שמובילים ^ל1,2 ייצור ציטוקינים אנטי. על מנת ליישב את המארח, וירוסים הם מחייבים להתחמק תגובות מארחות אנטי ולתפעל מסלולי איתות. להתיר את אינטראקצית מארח הווירוס שישפוך אור על פיתוח אסטרטגיות הטיפוליות החדשניות נגד זיהום ויראלי.

Murine γHV68 הוא קשור קשר הדוק לסרקומה הקשורים לוירוס ההרפס של האדם אונקוגני קפוסי וEpsten-Barr וירוס ^3,4. γHV68 דלקת בעכברי מעבדה מספקת מודל חיה קטנה צייתן לבחון את כל המהלך של תגובות מארחות וזיהום ויראלי בvivo, אשר אינם זמינים לherpesviruses אדם. בפרוטוקול זה, אנו מציגים פנל של שיטות לאפיון פנוטיפי ונתיחה מולקולרית של רכיבים מארחים איתות בreplic ממוסס γHV68ation בשניהם vivo ו vivo לשעבר. הזמינות של זני עכבר מהונדס גנטי מאפשרת החקירה של התפקידים של מסלולי איתות מארחת במהלך זיהום החריף γHV68 in vivo. בנוסף, fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) שבודד מזני העכברים החסרים אלה יכול לשמש כדי לנתח את התפקידים של המולקולות האלה עוד יותר במהלך vivo לשעבר שכפול ממוסס γHV68.

שימוש במבחנים בביולוגיה מולקולרי וVirological, אנו יכולים להצביע על המנגנון המולקולרי של אינטראקציות מארח וירוס ולזהות מארח וגנים נגיפיים חיוני לשכפול ממוסס נגיפי. לבסוף, מערכת מלאכותית כרומוזום חיידקים (BAC) מאפשרת הכנסת מוטציות לגורם ויראלי (הים) שדווקא להפריע אינטראקצית מארח הווירוס. רקומביננטי γHV68 נושא מוטציות אלו יכולים לשמש כדי לסכם את פנוטיפים של שכפול ממוסס γHV68 בMEFs הלקויים במארח מקש איתות רכיבים.פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה מצוינת לחקור את אינטראקצית מארח הפתוגן ברמות שונות של התערבות בvivo ו vivo לשעבר.

לאחרונה, גילינו שγHV68 usurps מסלול איתות חיסון מולד לקדם שכפול נגיפי ממוסס ^5. באופן ספציפי, דה נובו זיהום γHV68 מפעיל IKKβ קינאז החיסוני וIKKβ הופעל phosphorylates הגורם הראשי הנגיפי שעתוק, השכפול וtransactivator (RTA), כדי לקדם את הפעלת שעתוק נגיפית. בתוך כך, ביעילות γHV68 זוגות הפעלת שעתוקה לארח הפעלת חיסון מולדת, ובכך להקל על שעתוק נגיפי ושכפול מוסס. מחקר זה מספק דוגמה מצוינת שיכול להיות מיושמת על וירוסים אחרים לחקור את אינטראקצית מארח וירוס.

Protocol

1. זיהום עכבר עם γHV68

1. עכברי המלטה שש עד שמונה שבועות ישן, מגדר בהתאמה (8-12 עכברים / קבוצתי) משמשים להדבקה בנגיף. אפשר להתאקלם עכברים במשך ארבעה ימים מלאים (96 שעות) לאחר משלוח.
2. צעדי פרוטוקול באמצעות וירוס צריכים להתבצע בקבינט של רמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) באמצעות BSL2 אמצעי זהירות רגיל.
3. הכן השעיה נגיפית (40-1 x 10 ⁵ יחידות שלט יוצרים [pfu]) של γHV68 ב30 μl של PBS סטרילי לעכבר ממש לפני הניסוי. שמור על השעיה נגיפית על קרח.
4. להכין תמיסת קטמין / xylazine (1.5 קטמין מ"ג ומשקל 0.15 מ"ג xylazine/20 גרם גוף, 100 μl / עכבר) להרגעת עכבר. ודא כי העכברים סוממו על ידי ביצוע קמצוץ בוהן.
5. עכברים שקטים ורגועים עם קטמין מ"ג 1.5 וxylazine 0.15 מ"ג למשקל גוף 20 מ"ג (100 μl / עכבר) בזריקה תוך הצפק.
6. לספק השעיה נגיפית (30 μl / עכבר) intranasally, במבחינת ירידהאופנה, לנחיר אחד של העכברים המסוממים.
7. Lay עכברים בצד אחד ל5-10 דקות כדי להקל על המשלוח דרכי הנשימה של הנגיף לריאות.
8. עכברים למקם אותו בחזרה בכלוב עכברים ומוניטור עד שהם התאוששו באופן מלא מתרופות הרגעה.
9. בימים שונים לאחר פגיעה, להקריב את עכברים על ידי ₂ מחנק וקציר הריאות לאחר הבטחת מוות / איבוד ההכרה עמוקה CO. ריאות מקום לתוך צינורות 1.5 מ"ל סטריליים בורג כתרים המכילים 500 μl של 1.0 מ"מ חרוזי Zirconia / סיליקה. שמור צינורות על קרח. דגימות חנות ב -80 ° C, אם לא ימשיך לשלב הבא באותו היום. הטחול או רקמת כבד יכול להיות שנאסף בשלב זה לניתוח של חביון הנגיפי בהתאם למסגרת זמן של ניסוי.
10. הוסף 1 מ"ל של DMEM הקר סרום נטול לתוך הצינור והומוגני הריאות ב 30 שניות חרוז מכות. צ'יל צינורות על קרח לדקות לפחות 1. חזור על תהליך זה פעם אחת.
11. ריאות צנטריפוגה lysates ב16000 RCF ב 4 ° C למשך דקת 1 ולהשתמש supernatant לקבוע כייל נגיף ידי assay פלאק באמצעות monolayer NIH3T3 או BHK21 (ראה סעיף 5 לפרטים נוספים).

2. קבע γHV68 קינטיקה צמיחה רבת שלבים בפיברובלסטים עובריים של עכבר

1. לגדול fibroblasts הסוג פראי העכבר עוברי (MEFs) ואלה חסרים בגן מארח למשנה confluent צפיפות (כ 80%) לפני תאי ציפוי.
2. פיצול MEFs לתוך צלחת 24 גם ב -10,000 תאים / היטב לmultipilicity-of-זיהום נמוך (משרד פנים) ביום שלפני הזיהום. ניסויים בדרך כלל מתבצעים בtriplicates ובמשרד פנים בין 0.001-0.05 משמשים בדרך כלל.
3. הכן γHV68 השעיה המכילה כמות רצויה של וירוס (0.5 מ"ל לטוב).
4. הסר בינוני ולכסות MEFs עם 0.5 מ"ל של השעיה לγHV68 היטב.
5. דגירה את הצלחת ברקמות תרבות חממה, רוק בכל 30 דקות, ותאפשר להמשיך דגירה עבור 2 שעות.
6. הסרת השעיה נגיפית, ולכסות את תאים עם 0.5 המ"ל ג טריomplete DMEM בינוני המכיל 8% בסרום שור עוברי.
7. בימים שונים לאחר פגיעה, למסוק הבינוני ותאים לתוך צינורות 1.5 מ"ל צנטריפוגות סטריליים. מייד להקפיא צינורות ב-80 ° C.
8. שחרור γHV68 מMEFs על ידי הקפאה ב-80 ° C, בהפשרת 37 ° C אמבט מים וvortexing. שלושה מחזורים של הקפאה והפשרה מיושם בדרך כלל לדגימות.
9. קבע כייל נגיף ידי assay פלאק באמצעות monolayer NIH3T3 או BHK21 (ראה סעיף 5 לפרטים נוספים).
10. קראו כייל נגיף ועקומת עלילת γHV68 רב שלבי צמיחה בMEFs.

3. נתיחה מולקולרית של שכפול ממוסס γHV68 בפיברובלסטים עובריים של עכבר

1. בצע זיהום נגיפי כמתואר בשלבים 2.1-2.6 לסעיף 2.
2. בימים שונים לאחר פגיעה, להשליך supernatant. יש לשטוף את תאים עם תאי trypsinize הקר PBS ו. תאי גלולה ידי צנטריפוגה ב1000 RCF בטמפרטורת חדר למשך דקה 1. בטל supernatant ותאי חנות ב -80 ° C.
3. לחלץ דנ"א כולל (מארח והגנום נגיפי) ו-RNA כלל על פי שיטות שפורסמו בעבר ^5,6.
4. לבצע PCR בזמן האמת באמצעות דנ"א ופריימרים ספציפיים לתעתיקי ממוסס נגיפיים, כגון RTA (ORF50), ORF57 וORF60 מוחלט. לקבוע את הכמות היחסית של הגנום תאי γHV68 בהתייחסות לגן משק מארח (למשל, β-יקטין).
5. כדי להסיר זיהום הדנ"א הגנומי, טיפול עם RNase ללא DNase הוא קריטי להכנת cDNA עם פריימר רנ"א המוחלט וOligo (dT) _11-19. להתייחס התייחסות 5 לפרטים נוספים על חילוץ רנ"א כולל טיפול עם RNase ללא DNase וRT-PCR. לבצע PCR בזמן האמת באמצעות cDNA ופריימרים כאמורים לעיל, כדי לקבוע את הכמות היחסית של תעתיקים נגיפיים בהתייחסות לזה של גן המשק מארח.

4. יצירת רקומביננטי כרומוזום מלאכותי חיידקים באמצעות γHV68

Methoד מתואר כאן משמש להציג מוטציות לגן γHV68 כי הוא מעורב באינטראקצית מארח וירוס.

1. הכן קטע DNA (כ -1.5 ק"ג) של רצף פרוע סוג או רצף נושא מוטציות רצויות באזור המרכז באמצעות PCR.
2. הכן כרומוזום מלאכותי חיידקים (BAC) שמכיל ⁷ transposon הכנסה סביב אתר המוטציה, שמנטרל את גן הגן של עניין, על ידי טיהור midi קנה מידה (OriGene) באופן ספציפי. החנות BAC DNA ב 4 ° C (להימנע מהקפאה / פשרה של BAC-DNA).
3. Transfect BAC-DNA וה-PCR מוצר המכילים מוטציות רצויות של הגן של עניין לתאים (למשל, NIH3T3 או BHK21), שהם מתירנית מאוד לשכפול ממוסס γHV68, עם Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
4. שמור על תאי פיצול עד השפעת cytopathic (CPE) מופיעה בmonolayer. איסוף וירוסים המכיל supernatant ואם יש צורך, להגביר וירוס בNIH3T3 או BHK21 תאים.
5. להדביק תאים עם NIH3T3רקומביננטי וירוס ידי צנטריפוגה בסל"ד 1800, 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
6. γHV68 הנגועים NIH3T3 תאי קציר ולהכין הגנום נגיפי circularized באמצעות הפרוטוקול של הירט ^8,9.
7. להפוך תאים מוסמכים DH10B אלקטרו MAX (Invitrogen) על ידי electroporation ומסך למושבות שהתנגדות לchloramphenicol (סנטימטר), אבל רגישה לkanamycin (קאן) (גן סנטימטרים עמידים הוא בעמוד שדרת BAC, ואילו גן קאן עמיד הוא בtransposon הכנסה).
8. לגדול מושבות ^S הסנטימטרים ^R קאן בchlorophenicol בינוני מכיל ולהכין BAC DNA עם טיהור מיני או midi קנה מידה (OriGene).
9. ודא את המוטציה הרצויה בגן היעד באמצעות PCR, באמצעות פריימרים ספציפיים לאיגוף אזורים של אתר מוטציה, ורצף.
10. אשר אין סידור מחדש בכרומוזום BAC ידי עיכול עם אנזימי הגבלה נבחרים ואלקטרופורזה ג'ל דופק שדה.
11. Transfect רקומביננטי BAC לתוך תאי NIH 3T3 או BHK21 עם Lipofectamine2000 (Invitrogen) להכין רקומביננטי γHV68.
12. שמור passaging תאים עד CPE מופיע בmonolayer. איסוף וירוסים המכיל supernatant ולהגביר רקומביננטי γHV68 בNIH3T3 או BHK21 תאים.
13. קבע כייל נוגדנים של נגיף רקומביננטי ולאפיין vivo הנגיפי צמיחת נכסים לשעבר וin vivo כמתואר בסעיפי 1 ו 2.

5. קבע כייל נגיף ידי assay פלאק

1. לגדול NIH3T3 תאים למשנה confluent צפיפות (כ 80%) לפני תאי ציפוי.
2. פיצול NIH3T3 לתוך צלחת 24 גם ב20,000 תאים / גם ביום שלפני הזיהום.
3. הכן supernatants וירוסים התוקפים מדולל-10-קיפול עם DMEM בינוני המכיל 8% סרום עגלים נולד (NCS).
4. הסר בינוני ולכסות NIH3T3 תאים עם 0.5 מ"ל של γHV68 השעיה.
5. דגירה את הצלחת ברקמות תרבות חממה, רוק וכל 30 דקות, ולאפשר דגירה להמשיךעבור 2 שעות.
6. הסרת השעיה נגיפית ותאים עם כיסוי בינוני 0.5 מ"ל DMEM המכיל 2% NCS ו0.75% methylcellulose (סיגמא).
7. דגירה את הצלחת ברקמות תרבות חממה. ספירת הפלאק ביום 6 לאחר פגיעה. צביעת monolayer, למשל עם סגול גביש, עשויה להקל על ספירת פלאק.
8. חישוב כייל הנגיף בlysates הרקמות החי או תא lysates תוך שימוש בנוסחא הבאה: כייל (pfu / מ"ל) = ע x N x 1000 μl / מיליליטר ÷ μl V. N, הממוצע של מספר לוחית בדילול מתאים; ד ', דילול קיפול (כמו 5, 10, 100 .....) V (μl), הנפח של supernatant סדרתי המדולל לכל גם הוסיף.

6. נציג תוצאות:

שלוש דמויות מייצגות מוצגות כאן, כוללות שכפול γHV68 מס ובריאות של MAVs סוג פראי ^{- / -} עכבר ^10, γHV68 פנוטיפים שכפול ממוסס בפיברובלסטים עובריים של עכבר (MEF), וrecombinנמלת γHV68 נושאה מוטציות בתוך האתרים זרחון כי הם מווסתים על ידי IKKβ MAVs התלוי. שלושה ניסויים אלה מהווים מסייעים תכנית להגדיר את התפקידים של רכיבים חיסוניים מולדים בשכפול ממוסס γHV68 in vivo ו vivo לשעבר.

איור 1 γHV68 עומסים בתוך הריאות של MAVs ^{+ / +} וMAVs ^{-. / -} עכברים. ) איתות מולדת שני מסלולים עיקרית במורד זרם של MAVs. את ממסרי MAVs מתאם מולקולת איתות מקולטנית cytosolic RIG-I-כמו להפעיל גורמים רגולטוריים אינטרפרון (IRFs) NFκB וכי, בתורו, מעלה לווסת את ביטוי הגנים של ציטוקינים מעודדים דלקת ואינטרפרונים. B) ^{+ / +} וMAVs MAVs ^{- / -} עכברים נגועים ב40 pfu γHV68 intranasally ועומס נגיפי בריאה בנקודתי זמן שצוינו היה להרתיע ממוקש ידי assay פלאק באמצעות NIH3T3 monolayer. כל סמל מייצג עכבר.

איור 2. ΓHV68 קינטיקה השכפול ממוסס בfibroblasts העכבר העוברי (MEFs). השכפול של ממוסס γHV68 על MAVs ^{+ / +} וMAVs ^{- / -} MEFs הוערך על ידי עיקולים רבי שלבי צמיחה () וזמן האמת PCR כמוני (B). עבור שני הניסויים, מספר שווה של MEFs וכמות γHV68 שמשו לזיהום נגיפי בריבוי-of-זיהום (משרד פנים) של 0.01. () תאים וsupernatants נקצרו בנקודתי זמן מצוין ובכפוף assay פלאק לקבוע titers הנגיפי. (ב) סך רנ"א היה שחולץ מן MEFs γHV68 הנגוע ונותח על ידי PCR כמותית בזמן אמת עם פריימרים ספציפיים לתעתיקי ממוסס נבחרים (RTA, ORF57, וORF60).

ig3.jpg "/>
איור 3. קינטיקה של שכפול ממוסס רקומביננטי γHV68 מוטציות שנשאו בתוך תחום transactivation RTA שלבטל זירחון ידי IKKγ. () עיקולים רבי שלבי צמיחה של נגיף רקומביננטי פראי מסוג (γHV68.wt) ונגיף עבר מוטציה (γHV68.mut) בMAVs ^{+ / +} וMAVs ^{- / -} תאי MEFs (משרד פנים = 0.01). MEFs היו נגוע בγHV68 במשרד פנים של 0.01. תאים וsupernatants נקצרו בנקודתי זמן מצוין ומכייל נגיף נקבעו על ידי assay פלאק באמצעות monolayer 3T3-NIH. (ב) רמת γHV68 RTA mRNA בתאי NIH3T3 γHV68 נגועים (משרד פנים = 0.01). ב30 שעות לאחר פגיעה, RNA כלל הופקו מתאי 3T3 NIH γHV68 נגועים ונותחו על ידי PCR כמותית בזמן אמת.

Discussion

בתגובה לזיהום נגיפי, שבילים החיסוניים המולדים MAVs תלויי איתות מופעלים כדי לקדם את הייצור של ציטוקינים דלקתיים אנטי ^10-14. שימוש γHV68 העכברי כוירוס מודל לסרקומה הקשורים לוירוס ההרפס של האדם אונקוגני קפוסי וEpstein-Barr וירוס ^3,4, גילה שγHV68 usurps מסלול MAVs-IKKβ לקדם שכפול נגיפי ממוסס באמצעות הפעלת תעתיק ^5. העסקת MEFs וטכניקות המולקולריות בוירולוגיה המהונדסת גנטי, פרוטוקול זה מאפשר זיהוי היעיל של איתות מרכיבי מסלול מסוים כי הם קריטיים עבור שכפול ממוסס γHV68. ככזה, פרוטוקול זה כרוך בזיהום vivo, שכפול ממוסס vivo לשעבר, ונתיחה של מסלול איתות החיסון המולד. להתוות את המנגנון המולקולריים, נהלים נוספים הכוללים כרומוזום המלאכותי החיידקים לייצר הרפס רקומביננטיניסויים בביולוגיה מולקולרי וירוס ונחוצים. בנוסף, זנים ופיברובלסטים עכבר נוקאאוט הם מפתח לניסויים אלה. עם מספר גדול של זני עכבר נוקאאוט זמינים, פרוטוקול זה יאפשר נתיחה המולקולרית של מארח מסלולי איתות והתערבות נגיפית ממנו. במקרה שעכברי נוקאאוט וMEFs אינם זמינים (למשל, עקב קטלני), מציאה בתיווך shRNA RNAi / עלולה להיות מבוקשת. מגבלות נוספות של פרוטוקול זה כוללים: 1) דיבור בין מסלולי איתות, 2) החופפים פונקציות של גורמים נגיפיים מועמד, 3) השפעה קטלנית על הפוטנציאל γHV68 שכפול על ידי מוטציות. למרות שפרוטוקול זה יושם ישירות לזהות תפקידים של רכיבים חיסוניים מולדים בשכפול ממוסס γHV68 בפרט, אסטרטגיות דומות ניתן להשתמש כדי להגדיר את התפקידים החשובים של רכיב נבחר במארח האחר מסלולי איתות במהלך זיהום ויראלי in vivo ו vivo לשעבר.

זהחשוב לציין כי גישת רקומבינציה בתאי transfected עוקפת את שלבי עבודה אינטנסיביות הנדרשים לזיהוי BAC רקומביננטי בE.coli, ומאפשר היכרות היעילה של מוטציות בגנים של האינטרס. באופן ספציפי, הומולוגי רקומבינציה בין מוצרים המכילים מוטציות PCR נועד BAC ומייצרת שיבוטי BAC זיהומיות, בתורו, להוביל לרקומביננטי γHV68. עם זאת, פרוטוקול זה מסתמך על הגנים והמוטציות שלא אמורה להשבית את הנגיף לחלוטין החיוניים. אם מוטציות להשבית γHV68 לחלוטין, transfections אינו צפוי לייצר וירוס רקומביננטי. אנו מבינים מידע שלמד מγHV68 העכברי שלא יחול באופן זהה לאדם KSHV וEBV. עם זאת, האסטרטגיות לנתח התחמקות חיסונית נגיפית ומנגנוני ניצול עשויות להיות מיושמות לפתוגנים האנושיים אלה באמצעות תאים בתרבית. הממצאים שלנו נובעים מזיהום עכבר עם γHV68 כך ינחו אותנו של דesigning ניסויים טובים יותר ללמוד האנושי KSHV וEBV.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Electro-MAX DH10B competent cells	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System	OriGene	NP100004
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System	OriGene	NP100006