Dissezione Host-virus Interazione in replica litico di un Herpesvirus modello

Summary

Descriviamo un protocollo per identificare i ruoli chiave di molecole di segnalazione di accoglienza nella replicazione litica di un herpesvirus modello, gamma herpesvirus 68 (γHV68). Utilizzando ceppi di topi geneticamente modificati e fibroblasti embrionali per γHV68 replica litico, il protocollo consente sia la caratterizzazione fenotipica e molecolare del virus interrogatorio interazioni ospite-in replicazione virale litico.

Abstract

In risposta ad un'infezione virale, un ospite sviluppa varie risposte difensive, come l'attivazione immunitaria innata vie di segnalazione che portano alla produzione di citochine ^1,2 antivirale. Al fine di colonizzare l'ospite, i virus sono obbligati a sottrarsi risposte dell'ospite antivirali e manipolare vie di segnalazione. Svelare l'ospite-virus interazione farà luce sullo sviluppo di nuove strategie terapeutiche contro le infezioni virali.

Murine γHV68 è strettamente correlata alla umana oncogeno sarcoma di Kaposi associato herpesvirus e Epsten-Barr ^3,4. γHV68 infezione nei topi di laboratorio fornisce un modello trattabile piccolo animale per esaminare l'intero corso di risposte dell'ospite e infezione virale in vivo, che non sono disponibili per herpesvirus umani. In questo protocollo, vi presentiamo un gruppo di metodi per la caratterizzazione fenotipica e la dissezione molecolare dei componenti host di segnalazione in γHV68 Replica liticozione sia in vivo ed ex vivo. La disponibilità di ceppi di topi geneticamente modificati permette l'interrogazione dei ruoli di vie di segnalazione di accoglienza durante γHV68 infezione acuta in vivo. Inoltre, fibroblasti embrionali di topo (MEF) isolati da questi ceppi di topi deficienti può essere utilizzato per analizzare ulteriormente ruoli di queste molecole durante γHV68 litico ex vivo replica.

Utilizzo di test virologici e biologia molecolare, siamo in grado di individuare il meccanismo molecolare di ospite-virus e identificare le interazioni ospite e geni virali essenziali per la replicazione virale litico. Infine, un cromosoma artificiale batterico (BAC) sistema facilita l'introduzione di mutazioni nel fattore virale (s) che specificamente interrompere l'interazione virus-ospite. Ricombinante γHV68 portare queste mutazioni possono essere utilizzati per ricapitolare i fenotipi di γHV68 replicazione litica in MEF deficienti di accoglienza chiave componenti di segnalamento.Questo protocollo offre un'ottima strategia per interrogare interazione ospite-patogeno a più livelli di intervento in vivo e ex vivo.

Di recente, abbiamo scoperto che γHV68 usurpa un pathway di segnalazione immunitaria innata per promuovere replicazione virale litico ^5. In particolare, γHV68 de novo infezione attiva il sistema immunitario IKKβ chinasi e IKKβ attivato fosforila il fattore di trascrizione virale maestro, replica e transattivatore (RTA), per la promozione virale attivazione trascrizionale. In tal modo, γHV68 efficiente coppie sua attivazione trascrizionale di ospitare attivazione immunitaria innata, facilitando così la trascrizione e la replicazione virale litico. Questo studio fornisce un esempio eccellente che può essere applicato ad altri virus per interrogare host-virus interazione.

Protocol

1. Mouse con infezione γHV68

1. Topi cucciolata di sei a otto settimane di età, di genere abbinato (da 8 a 12 topi / gruppo) sono utilizzati per l'infezione virale. Lasciare topi per ambientarsi nel corso di quattro giornate (96 ore) dopo la spedizione.
2. Passi del protocollo che utilizzano virus deve essere effettuata in un armadio di livello di biosicurezza 2 (BSL2) utilizzando le normali precauzioni BSL2.
3. Preparare sospensione virale (da 40 a 1 x 10 ⁵ unità formanti placca [PFU]) di γHV68 in 30 ml di PBS sterile per topo poco prima dell'esperimento. Tenere sospensione virale su ghiaccio.
4. Preparare la soluzione di ketamina / xilazina (1,5 ketamina mg e 0,15 mg xylazine/20 g di peso corporeo, 100 pl / mouse) per la sedazione del mouse. Assicurarsi che i topi sono stati sedati eseguendo un pizzico punta.
5. Topi sedate con 1,5 mg di ketamina e 0,15 mg xilazina per 20 mg di peso corporeo (100 pl / mouse) da intra-peritoneale di iniezione.
6. Deliver sospensione virale (30 microlitri / mouse) intranasale, in una goccia a gocciamoda, a una narice dei topi sedati.
7. Lay mouse su un lato per 5 - 10 minuti per facilitare la fornitura delle vie aeree del virus nei polmoni.
8. Luogo topi indietro nei topi in gabbia e il monitor fino a quando non sono completamente recuperati dalla sedazione.
9. A diversi giorni dopo l'infezione, il sacrificio topi CO ₂ asfissia e raccogliere i polmoni dopo aver assicurato la morte / perdita di coscienza profonda. Polmoni Luogo in sterili da 1,5 ml con tappo a vite tubi contenenti 500 ml di 1,0 millimetri Zirconia / silice perline. Tenere i tubi in ghiaccio. Conservare i campioni a -80 ° C se non di procedere alla fase successiva nello stesso giorno. La milza o tessuto epatico potrebbero essere raccolti in questo momento per l'analisi della latenza virale seconda temporale dell'esperimento.
10. Aggiungere 1 ml di freddo DMEM privo di siero nella provetta e omogeneizzare i polmoni dal tallone-pestaggio 30 secondi. Raffreddare provette in ghiaccio per almeno 1 min. Ripetere questa operazione una sola volta.
11. Polmone lisati centrifuga a 16.000 rcf a 4 ° C per 1 min e utilizzare supernatant per determinare il titolo virale da un saggio di placca con un NIH3T3 o BHK21 monostrato (si veda la Sezione 5 per i dettagli).

2. Determinare γHV68 multi-step cinetica di crescita in fibroblasti embrionali di topo

1. Crescere tipo selvatico fibroblasti embrionali di topo (MEF) e quelli carenti in un gene host sub-confluenti (circa 80%) densità prima placcatura cellule.
2. Suddiviso in MEFs 24 pozzetti a 10.000 cellule / pozzetto per una bassa multipilicity-di-infezione (MOI) il giorno prima dell'infezione. Gli esperimenti sono normalmente effettuate in triplicato e ad una MOI tra 0,001-0,05 viene usato solitamente.
3. Preparare γHV68 sospensione contenente quantità desiderata di virus (0,5 ml per pozzetto).
4. Estrarre il supporto di MEF e coprire con 0,5 ml di sospensione γHV68 per pozzetto.
5. Incubare la piastra in coltura tissutale incubatore, roccia ogni 30 min, e consentono di procedere incubazione per 2 ore.
6. Rimuovere sospensione virale, e coprire le cellule con 0,5 ml di fresca complete DMEM terreno contenente 8% di siero fetale bovino.
7. A diversi giorni dopo l'infezione, raccogliere il medio e cellule in provette sterili 1,5 ml per centrifuga. Subito congelare provette a -80 ° C.
8. Rilasciare γHV68 da MEF mediante congelamento a -80 ° C, lo scongelamento a 37 ° C bagno di acqua e vortex. Tre cicli di congelamento e scongelamento viene solitamente applicata ai campioni.
9. Determinare titolo virale da un saggio di placca con un NIH3T3 o BHK21 monostrato (si veda la Sezione 5 per i dettagli).
10. Leggi il titolo virale e la trama γHV68 multi-step curva di crescita sul MEF.

3. Dissezione molecolare dei γHV68 replicazione litica in fibroblasti embrionali di topo

1. Eseguire infezione virale, come descritto nei punti da 2.1 a 2.6 della sezione 2.
2. A diversi giorni dopo l'infezione, scartare il surnatante. Lavare le cellule con PBS freddo e le cellule Tripsinizzare. Cellule pellet per centrifugazione a 1.000 rcf a temperatura ambiente per 1 min. Eliminare il supernatante ecellule conservare a -80 ° C.
3. Estrarre DNA totale (host e del genoma virale) e l'RNA totale secondo i metodi precedentemente pubblicati ^5,6.
4. Eseguire in tempo reale PCR utilizzando DNA totale e primer specifici per trascritti virali litici come RTA (ORF50), ORF57 e ORF60. Determinare la quantità relativa di intracellulare γHV68 genoma in riferimento ad un gene housekeeping host (ad esempio, β-actina).
5. Per rimuovere la contaminazione di DNA genomico, il trattamento con RNasi-free DNasi è fondamentale per la preparazione di cDNA con RNA totale e oligo (dT) primer _11-19. Fare riferimento al riferimento 5 per maggiori dettagli in materia di estrazione di RNA tra cui il trattamento con RNasi-free DNasi e RT-PCR. Eseguire in tempo reale PCR utilizzando primer cDNA e come sopra per determinare la quantità relativa di trascritti virali in riferimento a quella del gene housekeeping ospitante.

4. Generazione ricombinante γHV68 con cromosoma batterico artificiale

La metodologiad qui descritto viene utilizzato per introdurre mutazioni in un gene γHV68 che è coinvolto nella interazione ospite-virus.

1. Preparare un frammento di DNA (circa 1,5 kb) di sequenza wild-type o sequenza portando mutazioni desiderate nella regione centrale mediante PCR.
2. Preparare cromosoma artificiale batterico (BAC) che contiene un inserimento trasposone ⁷ attorno al sito di mutazione, che inattiva il gene specifico gene di interesse, da midi scala purificazione (Origene). Conservare BAC DNA a 4 ° C (evitare di gelo / disgelo del BAC DNA).
3. Transfettare BAC DNA e prodotto di PCR contenente mutazioni desiderate del gene di interesse in cellule (ad esempio, o NIH3T3 BHK21), che sono altamente permissive per la replicazione γHV68 litico, con Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
4. Mantenere la divisione delle celle fino effetto citopatico (CPE) presenta in monostrato. Raccogliere contenenti virus surnatante e, se necessario, amplificare virus in cellule NIH3T3 o BHK21.
5. Infettare cellule NIH3T3 convirus ricombinante mediante centrifugazione a 1800 rpm, 30 ° C per 30 min.
6. Harvest γHV68 infettate cellule NIH3T3 e preparare genoma virale circolarizzato Hirt utilizzando il protocollo di ^8,9.
7. Electro-MAX trasformare cellule competenti DH10B (Invitrogen) per elettroporazione e schermo per colonie che sono la resistenza al cloramfenicolo (Cm), ma sensibile alla kanamicina (kan) (Cm gene resistente è in backbone BAC, mentre Kan gene resistente è in trasposone inserimento).
8. Grow Cm ^{R S} Kan colonie in terreno contenente chlorophenicol e preparare BAC DNA con la purificazione o mini-midi-scala (Origene).
9. Verificare la mutazione desiderata nel gene bersaglio mediante PCR, utilizzando primer specifici per le regioni fiancheggianti del sito di mutazione, e sequenziamento.
10. Confermare non riarrangiamento cromosomico in BAC mediante digestione con enzimi di restrizione selezionati e impulsi campo elettroforesi su gel.
11. Transfettare BAC ricombinante in cellule NIH 3T3 o BHK21 con Lipofectamine2000 (Invitrogen) per preparare γHV68 ricombinante.
12. Tenere passaging cellule fino a CPE si presenta in monostrato. Raccogliere virus contenente surnatante e amplificare ricombinante γHV68 in NIH3T3 o BHK21 cellule.
13. Determinare il titolo del virus ricombinante e caratterizzare la crescita virale proprietà ex vivo e in vivo, come descritto nelle sezioni 1 e 2.

5. Determinare il titolo virale da un saggio di placca

1. Crescere cellule NIH3T3 di sub-confluenti (circa 80%) densità prima placcatura cellule.
2. Diviso NIH3T3 in 24 pozzetti a 20.000 cellule / pozzetto il giorno prima dell'infezione.
3. Preparare 10 volte supernatanti virus in serie diluiti con DMEM terreno contenente l'8% di siero di vitello neonato (NCS).
4. Rimuovere medie e coprire cellule NIH3T3 con 0,5 ml di sospensione γHV68.
5. Incubare la piastra in incubatore tessuto, oscillare ogni 30 min, e consentono di procedere incubazioneper 2 h.
6. Rimuovere sospensione virale e cellule copertura con 0,5 ml di terreno DMEM contenente il 2% e 0,75% NCS metilcellulosa (Sigma).
7. Incubare la piastra in incubatore per colture dei tessuti. Contare placche al giorno 6 post-infezione. Colorazione del monostrato, ad esempio con violetto cristallo, può facilitare conteggio placca.
8. Calcolare il titolo virale nei lisati di tessuto non diluiti o lisati cellulari usando la seguente formula: Titer (PFU / ml) = D x N x 1000 microlitri / ml V ÷ microlitri. N, il numero medio di placca ad una diluizione appropriata, D, diluizione volte (ad esempio 5, 10, 100 .....) V (pl), volume di supernatante-diluito serialmente aggiunti per pozzetto.

6. Rappresentante dei risultati:

Tre figure rappresentative sono mostrati qui, tra cui la replica γHV68 litico nel polmone di wild-type e Mavs ^{- / -} topo ^10, γHV68 fenotipi replica litici in fibroblasti embrionali di topo (MEF), e recombinformica γHV68 portatori di mutazioni nei siti di fosforilazione che sono modulati dal MAV-dipendente IKKβ. Questi tre esperimenti concordanti costituiscono un sistema per definire i ruoli dei componenti del sistema immunitario innato in γHV68 replicazione litica in vivo ed ex vivo.

Figura 1 γHV68 carichi nei polmoni dei Mavs ^{+ / +} e Mavs ^{-. / -} Topi. A) a due vie di segnalazione principale innata a valle del MAV. I Mavs adattatore relè molecola di segnalazione da citosolici RIG-I-simili recettori per attivare NFκB e fattori interferone regolamentazione (IRF) che, a sua volta, up-regolare l'espressione genica di citochine proinfiammatorie e gli interferoni. B) Mavs ^{+ / +} e Mavs ^{- / -} topi sono stati infettati con il 40 PFU γHV68 intranasale e carica virale nel polmone a tempi indicati, sono stati deter estratto da un saggio di placca usando NIH3T3 monostrato. Ogni simbolo rappresenta un mouse.

Figura 2. ΓHV68 cinetica replica litici in topo fibroblasti embrionali (MEF). La replicazione litica di γHV68 su Mavs ^{+ / +} e Mavs ^{- / -} MEF sono state esaminate dalla multi-step curve di crescita (A) e quantitativa real-time PCR (B). Per entrambi gli esperimenti, pari numero di MEFs e quantità di γHV68 stati usati per infezione virale ad una molteplicità d'infezione (MOI) di 0,01. (A) cellule e dei surnatanti sono stati raccolti a tempi indicati e soggetti ad un saggio di placca per determinare i titoli virali. (B) L'RNA totale è stato estratto da γHV68 infetto MEFs e analizzati mediante real time PCR con primer specifici per determinati trascritti litico (RTA, ORF57, ORF60 e).

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Figura 3. La cinetica di replica litici di ricombinanti γHV68 mutazioni che trasportano all'interno del dominio di transattivazione RTA che aboliscono fosforilazione da IKKγ. (A) Multi-step curve di crescita ricombinante di virus wild-type (γHV68.wt) e virus mutante (γHV68.mut) in Mavs ^{+ / +} e Mavs ^{- / -} cellule MEF (MOI = 0,01). MEFs stati infettati con γHV68 ad una MOI di 0,01. Cellule e dei surnatanti sono stati raccolti a tempi indicati e titoli virali sono state determinate mediante un saggio di placca usando monostrato NIH 3T3. (B) γHV68 RTA livello di mRNA in γHV68 infettate cellule NIH3T3 (MOI = 0,01). A 30 h post-infezione, l'RNA totale è stato estratto da cellule infettate γHV68 NIH 3T3 e analizzati mediante quantitativa PCR in tempo reale.

Discussion

In risposta ad un'infezione virale, i Mavs-dipendenti immunitarie innate vie di segnalazione sono attivati ​​per promuovere la produzione di citochine infiammatorie antivirali ^10-14. Utilizzando murino γHV68 come un virus modello per umano oncogenico sarcoma di Kaposi associato herpesvirus e virus di Epstein-Barr ^3,4, abbiamo scoperto che γHV68 usurpa i Mavs-IKKβ della via per promuovere la replicazione virale litico attraverso l'attivazione trascrizionale ^5. Impiegando geneticamente modificati MEF e tecniche di virologia molecolare, questo protocollo permette l'efficace individuazione dei componenti di segnalamento di un percorso particolare, che sono fondamentali per la replica γHV68 litico. Come tale, questo protocollo prevede l'infezione in vivo, ex vivo replica litico, e dissezione della via di segnalazione immunitaria innata. Per delineare i meccanismi molecolari, le procedure complementari tra cui il cromosoma batterico artificiale per generare herpes ricombinantiesperimenti di biologia molecolare dei virus e sono necessarie. Inoltre, ceppi di topi knockout e fibroblasti sono la chiave per questi esperimenti. Con un gran numero di ceppi di topi knockout disponibili, questo protocollo consentirà la dissezione molecolare di host vie di segnalazione e di intervento virale stessa. Nel caso in cui i topi knockout e MEF non sono disponibili (ad esempio, a causa di letalità), RNAi / shRNA-mediata knockdown può essere richiesta. Ulteriori limitazioni di questo protocollo sono: 1) le interferenze tra vie di segnalazione, 2) sovrapposte funzioni di fattori virali candidati, 3) potenziale effetto letale sulle γHV68 replica da mutazioni. Sebbene questo protocollo è stato applicato direttamente ad individuare i ruoli di componenti immuni innate in γHV68 replica litico in particolare, strategie simili possono essere utilizzati per definire i ruoli importanti di un componente selezionato in altro host percorsi di segnalazione durante l'infezione virale in vivo ed ex vivo.

Èimportante notare che il nostro approccio ricombinazione in cellule trasfettate bypassa il lavoro intensi passaggi richiesti per identificare ricombinante in E.coli BAC, consentendo l'introduzione efficiente di mutazioni nel gene d'interesse. Specificamente, ricombinazione omologa tra BAC e prodotti di PCR contenenti mutazioni progettati produce infettive cloni BAC che, a loro volta, danno luogo a γHV68 ricombinante. Tuttavia, questo protocollo si basa sul gene essenziale e mutazioni che non dovrebbero disattivare completamente il virus. Se mutazioni completamente inattivare γHV68, trasfezioni non dovrebbero generare virus ricombinante. Ci rendiamo conto che le informazioni apprese da murino γHV68 non possono applicare in modo identico per la salute umana KSHV e EBV. Tuttavia, le strategie per sezionare virale evasione immune e meccanismi di valorizzazione possono essere applicate a questi agenti patogeni umani con cellule in coltura. Le nostre scoperte derivate da infezione del mouse con γHV68 così ci istruirà di designing migliori esperimenti per studiare umano KSHV e EBV.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Electro-MAX DH10B competent cells	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System	OriGene	NP100004
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System	OriGene	NP100006