Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Summary

We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.

Abstract

In reactie op virale infectie, een gastheer ontwikkelt verschillende defensieve reacties, zoals het activeren van aangeboren immuunsysteem signaalwegen die leiden tot antivirale cytokine productie ^1,2. Met het oog op de gastheer te koloniseren, virussen zijn obligate om gastheer antivirale respons te omzeilen en signaalwegen te manipuleren. Het ontrafelen van de gastheer-virus interactie zal licht werpen op de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën tegen virale infectie.

Murine γHV68 is nauw verwant aan humane oncogene Kaposi-sarcoom-geassocieerd herpesvirus en Epsten-Barr virus ^3,4. γHV68 infectie in laboratoriummuizen biedt een soepel klein diermodel om het gehele verloop van gastheer responsen en virale infectie te onderzoeken in vivo, die niet beschikbaar zijn voor humane herpesvirussen. In dit protocol, presenteren we een panel van methoden voor fenotypische karakterisatie en moleculaire dissectie van gastheer signalering componenten in γHV68 lytische replicatie zowel in vivo en ex vivo. De beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde muizenstammen maakt de ondervraging van de rol van gastheer signaalwegen tijdens γHV68 acute infectie in vivo. Bovendien kan muis embryonale fibroblasten (MEF) geïsoleerd uit deze deficiënte muizenstammen gebruikt worden om verdere rol van deze moleculen ontleden tijdens γHV68 lytische replicatie ex vivo.

Met virologische en moleculaire biologie assays kunnen we lokaliseren het moleculaire mechanisme van gastheer-virus interacties en identificeren gastheer en virale genen essentieel is voor virale lytische replicatie. Tenslotte een bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) verlicht de introductie van mutaties in het virale factor (en) die specifiek onderbreken host-virus interactie. Recombinant γHV68 die deze mutaties kan worden gebruikt om het fenotype van γHV68 lytische replicatie deficiënte MEF's in ontvangst in belangrijke signaleringscomponenten vatten.Dit protocol biedt een uitstekende strategie om gastheer-pathogeen interactie ondervragen op verschillende niveaus van interventie in vivo en ex vivo.

Onlangs hebben we ontdekt dat γHV68 eigent zich een aangeboren immuun signaalweg om virale replicatie lytische ⁵ te bevorderen. Specifiek γHV68 de novo infectie activeert het immuunsysteem kinase IKKβ en geactiveerd IKKβ fosforyleert de master virale transcriptie factor, replicatie en transactivator (RTA) te bevorderen virale transcriptionele activatie. Daarbij γHV68 efficiënt koppelt haar transcriptionele activering naar aangeboren activering van het immuunsysteem te hosten, en aldus virale transcriptie en lytische replicatie. Deze studie biedt een uitstekend voorbeeld dat kan worden toegepast op andere virussen tot host-virus interactie te ondervragen.

Protocol

1. Muis infectie met γHV68

1. Zes tot acht weken oude, geslacht gematchte littermate muizen (8 tot 12 muizen / groep) worden gebruikt voor virusinfecties. Laat muizen te acclimatiseren gedurende vier volle dagen (96 uur) na verzending.
2. Protocol stappen met behulp van virus moet worden uitgevoerd in een kast van bioveiligheid niveau 2 (BSL2) met behulp van standaard BSL2 voorzorgsmaatregelen.
3. Bereid virussuspensie (40 tot 1 x 10 ⁵ plaque-vormende eenheden [PFU]) van γHV68 in 30 pi steriel PBS per muis vlak voor het experiment. Houd virale suspensie op ijs.
4. Bereid ketamine / xylazine (1,5 mg en 0,15 mg ketamine xylazine/20 g lichaamsgewicht, 100 ul / muis) voor muis sedatie. Zorg ervoor dat de muizen werden verdoofd door het uitvoeren van een teen knijpen.
5. Verdoven muizen met 1,5 mg en 0,15 mg ketamine xylazine per 20 mg lichaamsgewicht (100 ul / muis) door intraperitoneale injectie.
6. Intranasaal leveren virussuspensie (30 ul / muis) in een druppelsgewijsmode, met een neusgat van de verdoofde muizen.
7. Leg muizen aan een zijde gedurende 5 - 10 min aan de luchtweg aflevering van het virus in de longen te vergemakkelijken.
8. Plaats muizen terug in kooi en de monitor muizen totdat ze volledig hersteld van sedatie.
9. Op verschillende dagen na infectie, offeren muizen CO ₂ stikken en oogst de longen na verzekeren death / verlies van diepe bewustzijn. Plaats longen in steriele 1,5 ml schroefdop afgesloten buizen die 500 ul van 1,0 mm Zirconia / Silica kralen. Houd buizen op ijs. Store monsters bij -80 ° C indien niet doorgaat naar de volgende stap op dezelfde dag. De milt of leverweefsel kon worden verzameld op dit moment voor de analyse van virale latentie afhankelijk tijdsbestek van experiment.
10. Voeg 1 ml koud serumvrij DMEM in de buis en homogeniseren van de longen bead-beating 30 seconden. Chill buizen op ijs gedurende ten minste 1 min. Eenmaal Herhaal dit proces.
11. Centrifugeer long lysaten bij 16.000 RCF bij 4 ° C gedurende 1 min en gebruik supernatant om virale titer te bepalen door een plaque assay met behulp van een NIH3T3 of BHK21 monolaag (zie hoofdstuk 5 voor details).

2. Bepaal γHV68 meerdere stappen groeikinetiek in muis embryonale fibroblasten

1. Wild-type muis embryonale fibroblasten (MEF) en die deficiënt is in een gastheer gen sub-confluente (ongeveer 80%) dichtheid voor het uitplaten cellen.
2. MEFs gesplitst in 24-puts plaat bij 10.000 cellen / putje voor een lage multipilicity-van-infectie (MOI) op de dag voor infectie. Experimenten worden gewoonlijk uitgevoerd in drievoud en een MOI van 0,001 tot 0,05 wordt meestal gebruikt.
3. Bereid γHV68 suspensie die gewenste hoeveelheid virus (0,5 ml per putje).
4. Verwijder medium en bedek MEFs met 0,5 ml suspensie γHV68 per well.
5. Incubeer de plaat in weefselkweek incubator, rock elke 30 min en laat doorgaan incubatie gedurende 2 uur.
6. Verwijder virale ophanging, en bedek cellen met 0,5 ml verse complete DMEM medium met 8% foetaal runderserum.
7. Op verschillende dagen na infectie, het oogsten medium en cellen in steriele 1,5 ml centrifugebuizen. Onmiddellijk te bevriezen buizen bij -80 ° C.
8. ΓHV68 afgifte van MEFs door bevriezen bij -80 ° C, ontdooien in 37 ° C water bad en vortexen. Drie cycli van bevriezen en ontdooien wordt gewoonlijk toegepast op de monsters.
9. Bepaal virale titer door een plaque assay met behulp van een NIH3T3 of BHK21 monolaag (zie hoofdstuk 5 voor details).
10. Lees virale titer en plot γHV68 multi-step groeicurve op MEFs.

3. Moleculaire dissectie van γHV68 lytische replicatie in muis embryonale fibroblasten

1. Voer virale infectie, zoals beschreven in stappen 2.1 2.6 van hoofdstuk 2.
2. Op verschillende dagen na infectie, het supernatans. Spoel cellen met koude PBS en trypsinize cellen. Pellet cellen door centrifugeren bij 1000 RCF bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Verwijder het supernatant enstore cellen bij -80 ° C.
3. Extract totaal DNA (host en virale genoom) en totaal RNA volgens eerder gepubliceerde werkwijzen ^5,6.
4. Real-time PCR met behulp van totaal DNA en primers specifiek voor virale lytische transcripten, zoals RTA (ORF50) ORF57 en ORF60. Het relatieve hoeveelheid intracellulaire γHV68 genoom in verwijzing naar een gastheer huishoudgen (bijvoorbeeld β-actine).
5. Verwijderen genomisch DNA besmetting behandeling met RNase-vrij DNase is kritisch voor cDNA bereiding van totaal RNA en oligo (dT) _11-19 primer. Zie 5 Referentie voor meer informatie over de RNA-extractie waaronder behandeling met RNase-vrij DNase en RT-PCR. Real-time PCR met behulp van cDNA en primers zoals hierboven beschreven om de relatieve hoeveelheid van virale transcripten in verwijzing naar die van gastheer huishoudgen bepalen.

4. Het genereren van recombinant γHV68 met bacteriële kunstmatig chromosoom

De method hier beschreven wordt gebruikt om mutaties in een γHV68 gen dat betrokken is bij de gastheer-virus interactie.

1. Bereid een DNA fragment (ongeveer 1,5 kb) van wild-type sequentie of sequentie die gewenste mutaties in het centrale gebied door PCR.
2. Bereid bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) die een transposon insertie ⁷ bevat in de mutatieplaats die specifiek gen geïnactiveerd gen van interesse door midi schaal zuivering (Origene). Bewaren BAC DNA bij 4 ° C (vermijd bevriezen / ontdooien van BAC DNA).
3. Transfecteren BAC DNA en PCR-product met gewenste mutaties van het gen van belang in cellen (bijv. NIH3T3 of BHK21), die zeer tolerant voor γHV68 lytische replicatie met Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
4. Blijf splitsen cellen tot cytopatisch effect (CPE) te zien in de monolaag. Verzamel virus-bevattende supernatant en eventueel versterken virus in NIH3T3 of BHK21 cellen.
5. NIH3T3 cellen infecteren metrecombinant virus door centrifugatie bij 1.800 rpm, 30 ° C gedurende 30 minuten.
6. Oogst γHV68-geïnfecteerde NIH3T3 cellen en voor te bereiden gecirculariseerd virale genoom met behulp van Hirt het protocol van ^8,9.
7. Transformeren Electro-MAX DH10B competente cellen (Invitrogen) door elektroporatie en scherm kolonies die weerstand tegen chlooramfenicol (Cm), maar gevoelig voor kanamycine (Kan) (Cm-resistentiegen in BAC backbone, terwijl Kan-resistentiegen in transposon insertie).
8. Grow Cm ^R Kan ^S kolonies in medium dat chlorophenicol en voor te bereiden BAC DNA met mini-of midi-schaal zuivering (Origene).
9. Controleer de gewenste mutatie in het doelwitgen door PCR, met primers die specifiek flankerende gebieden van mutatieplaats en sequencing.
10. Bevestigen geen chromosoom omlegging in BAC door digestie met geselecteerde restrictie-enzymen en pulse-field gel elektroforese.
11. Transfecteren recombinant BAC in NIH 3T3 cellen met BHK21 of Lipofectamine2000 (Invitrogen) om recombinant γHV68 bereiden.
12. Houd passage cellen tot op het CPE duikt op in de monolaag. Verzamel virus-bevattende supernatant en versterken recombinant γHV68 in NIH3T3 of BHK21 cellen.
13. Bepaal titer van het recombinante virus en karakteriseren virale groei eigenschappen ex vivo en in vivo, zoals beschreven in de punten 1 en 2.

5. Bepaal virale titer door een plaque assay

1. NIH3T3 cellen groeien sub-confluente (ongeveer 80%) dichtheid voor het uitplaten cellen.
2. NIH3T3 gesplitst in 24-puts plaat bij 20.000 cellen / putje op de dag voor infectie.
3. Bereid 10-voudig serieel verdunde virus supernatanten met DMEM medium bevattende 8% pasgeboren kalfsserum (NCS).
4. Verwijder de middelgrote en bedek NIH3T3 cellen met 0,5 ml γHV68 suspensie.
5. Incubeer de plaat in weefselkweek incubator, schudden elke 30 min en laat incubatie doorgaangedurende 2 h.
6. Verwijder virale suspensie en deksel cellen met 0,5 ml DMEM medium dat 2% NCS en 0,75% methylcellulose (Sigma).
7. Incubeer de plaat in weefselkweek incubator. Tel plaques op dag 6 na-infectie. Kleuring van de monolaag, bijv. met kristalviolet, kunnen vergemakkelijken plaque tellen.
8. Bereken de virale titer in de onverdunde weefsel lysaten of cellysaten met de volgende formule: Titer (PFU / ml) = D x N x 1000 ul / ml ÷ V ul. N, het gemiddelde van plaque aantal op een geschikte verdunning, D, verdunning vouw (bijvoorbeeld 5, 10, 100 .....) V (pl), volume serieel verdunde supernatant toegevoegd per well.

6. Representatieve resultaten:

Drie representatieve figuren hier, inclusief γHV68 lytische replicatie in de longen van wild-type en Mavs ^{- / -} muis ^10, γHV68 lytische replicatie fenotypen in muis embryonale fibroblasten (MEF) en recombinmier γHV68 met mutaties binnen de fosforylatieplaatsen die gemoduleerd door de Mavs-afhankelijke IKKβ. Deze drie bevestigende experimenten vormen een regeling om de rol van het aangeboren immuunsysteem componenten te definiëren in γHV68 lytische replicatie in vivo en ex vivo.

Figuur 1 γHV68 belastingen in de longen van Mavs ^{+ / +} en Mavs ^{-. / -} Muizen. A) Twee belangrijke aangeboren signaalwegen stroomafwaarts van Mavs. De Mavs adapter molecuul relais signalering van cytosolisch RIG-I-like receptoren NFKB en interferon regulerende factoren (IFRS) die op hun beurt, up-reguleren de genexpressie van pro-inflammatoire cytokines en interferonen activeren. B) Mavs ^{+ / +} en Mavs ^{- / -} muizen werden geïnfecteerd met 40 PFU γHV68 intranasaal en virale belastingen in de longen op aangegeven tijdstippen werden weerhouden bepaald door een plaque assay met NIH3T3 monolaag. Elk symbool vertegenwoordigt een muis.

Figuur 2. ΓHV68 lytische replicatie kinetiek in muis embryonale fibroblasten (MEF). De lytische replicatie van γHV68 op Mavs ^{+ / +} en Mavs ^{- / -} MEF werd bepaald door meerstaps groeicurven (A) en kwantitatieve real-time PCR (B). Voor beide experimenten werden evenveel MEF en de hoeveelheid γHV68 voor virale infectie bij een multipliciteit-van-infectie (MOI) van 0,01. (A) Cellen en supernatanten werden geoogst op de aangegeven tijdstippen en met een plaque assay van virale titers bepalen. (B) Totaal RNA werd geëxtraheerd uit geïnfecteerde γHV68 MEFs en geanalyseerd door kwantitatieve real-time PCR met primers specifiek voor bepaalde lytische transcripten (RTA, ORF57 en ORF60).

ig3.jpg "/>
Figuur 3. De lytische replicatie kinetiek van recombinant γHV68 dragen mutaties binnen de RTA transactivatie domein dat fosforylering af te schaffen door IKKγ. (A) Multi-step groeicurven van recombinant wild-type virus (γHV68.wt) en mutant virus (γHV68.mut) in Mavs ^{+ / +} en Mavs ^{- / -} MEF cellen (MOI = 0,01). MEF werden geïnfecteerd met γHV68 bij een MOI van 0,01. Cellen en supernatanten werden geoogst op de aangegeven tijdstippen en virale titers werden bepaald door plaque assay met NIH 3T3 monolaag. (B) γHV68 RTA mRNA niveau γHV68 geïnfecteerde NIH3T3 cellen (MOI = 0,01). Op 30 uur na infectie werd totaal RNA geëxtraheerd uit γHV68 geïnfecteerde NIH 3T3-cellen en geanalyseerd door kwantitatieve real-time PCR.

Discussion

In reactie op virale infecties, worden de Mavs afhankelijk aangeboren immuunsysteem signaalwegen geactiveerd om de productie van antivirale inflammatoire cytokines ^10-14 bevorderen. Met muizen γHV68 als model voor menselijke oncogeen virus Kaposi-sarcoom-geassocieerd herpesvirus en Epstein-Barr virus ^3,4 ontdekten we dat γHV68 eigent de Mavs-IKKβ route van virale lytische replicatie via via transcriptionele activatie ^5. Gebruikmakend genetisch gemodificeerde MEFs en technieken in moleculaire virologie, dit protocol kan de efficiënte identificatie van signaleringscomponenten van een bepaalde route die essentieel zijn voor γHV68 lytische replicatie. Als zodanig is dit protocol omvat de in vivo infectie, ex vivo lytische replicatie en dissectie van het aangeboren immuunsysteem signaleringsroute. Het moleculaire mechanisme aanvullende procedures zoals de bacteriële kunstmatige chromosoom bakenen om recombinant herpes genererenvirus en moleculaire biologie experimenten zijn nodig. Bovendien knockout muizenstammen en fibroblasten sleutel voor deze experimenten. Met een groot aantal knockout muizenstammen beschikbaar zal dit protocol kan de moleculaire dissectie van gastheer signaalwegen en virale interventie daarvan. Indien knockout muizen en MEFs niet beschikbaar zijn (bijv. door letaliteit) kan RNAi / shRNA-gemedieerde knockdown worden gezocht. Bijkomende beperkingen van dit protocol omvatten: 1) overspraak tussen signaleringsroutes, 2) overlappende functies van kandidaat virale factoren, 3) potentiële dodelijke effect op γHV68 replicatie mutaties. Hoewel dit protocol werd rechtstreeks op rollen van aangeboren immuunrespons componenten identificeren in γHV68 lytische replicatie in het bijzonder kunnen vergelijkbare strategieën worden gebruikt om de belangrijke rol van een geselecteerde component in andere host signaalroutes gedurende virus infectie in vivo en ex vivo bepalen.

Het isbelangrijk op te merken dat onze aanpak recombinatie in getransfecteerde cellen de arbeidsmarkt-intensieve stappen die nodig zijn voor het identificeren van BAC recombinant in E. coli omzeilt, waardoor de efficiënte introductie van mutaties in het gen-of-interest. Bijzonder homologe recombinatie tussen BAC en PCR producten die gemaakt mutaties produceert infectieuze BAC klonen die op hun beurt aanleiding geven tot recombinant γHV68. Echter, dit protocol gebaseerd op het essentiële gen en mutaties die niet verondersteld volledig te inactiveren het virus. Als mutaties volledig te inactiveren γHV68 worden transfecties niet verwacht recombinant virus genereren. We realiseren ons dat de informatie geleerd van murine γHV68 kan identiek niet van toepassing op de mens KSHV en EBV. Niettemin kan de strategieën om virale immune fraude en exploitatiemechanismen ontleden worden toegepast op deze menselijke pathogenen met gekweekte cellen. Onze bevindingen afkomstig van muis infectie met γHV68 dus zal ons onderrichten van designing beter experimenten menselijke KSHV en EBV bestuderen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
Electro-MAX DH10B competent cells	Invitrogen	18290-015
Methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
POWERPREP HP Plasmid Miniprep System	OriGene	NP100004
POWERPREP HP Plasmid Midiprep System	OriGene	NP100006