تعيش خلية من التصوير و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

Summary

هذا البروتوكول ينص على إجراء خطوة بخطوة واحدة لرصد سلوك الخلية البكتريا المختلفة في الوقت المناسب باستخدام آلية مضان الوقت الفاصل بين المجهري. وعلاوة على ذلك ، فإننا نقدم إرشادات كيفية تحليل الصور المجهرية.

Abstract

خلال السنوات القليلة الماضية أصبح العلماء يدركون بشكل متزايد أن البيانات التي تم الحصول عليها من التجارب متوسط ​​السكان الميكروبية تستند لا تمثل حالة أو سلوك أو النمط الظاهري واحد من الخلايا. بسبب هذه الرؤية الجديدة في عدد من الدراسات خلية واحدة ترتفع باستمرار (انظر الأخيرة للاستعراضات ^1،2،3). ومع ذلك ، فإن العديد من التقنيات المطبقة خلية واحدة لا تسمح رصد تطور وسلوك خلية واحدة واحدة في وقت معين (مثل التدفق الخلوي المجهري أو قياسي).

هنا ، ونحن نقدم وصفا مفصلا لطريقة استخدام المجهر في العديد من الدراسات الحديثة ^{4 ، 5 ، 6 ، 7} ، والذي يسمح التالية وتسجيل (من مضان) الخلايا البكتيرية الفردية العصوية الرقيقة والعقدية الرئوية من خلال النمو والانقسام لأجيال كثيرة. يمكن استخدامها في الأفلام مما أدى إلى بناء شجرة النسب النشوء والتطور من خلال تتبع التاريخ مرة أخرى من خلية واحدة ضمن مجموعة من السكان التي نشأت من سلف واحد مشترك. ليس هذا فقط يمكن المجهري مضان الوقت الفاصل بين طريقة يمكن استخدامها لتحقيق النمو والانقسام والتفريق بين الخلايا الفردية ، ولكن أيضا لتحليل تأثير الخلية التاريخ والنسب على سلوك معين الخلوية. علاوة على ذلك ، يعتبر مثاليا الوقت الفاصل بين المجهري لدراسة ديناميات التعبير الجيني والتوطين البروتين خلال دورة الخلية البكتيرية. طريقة تشرح كيفية إعداد وبناء الخلايا البكتيرية الشريحة المجهر لتمكين ثمرة واحدة من الخلايا في microcolony. باختصار ، هي خلايا مفردة رصدت على سطح شبه صلبة تتكون من النمو المتوسط ​​تستكمل مع agarose التي كانت تنمو وتنقسم تحت المجهر مضان داخل غرفة درجة الحرارة البيئية للرقابة. يتم التقاط الصور على فترات محددة ، ويتم تحليلها في وقت لاحق باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر ImageJ.

Protocol

1. إعداد B. الرقيقة الثقافات

1. تلقيح خلايا من -80 درجة مئوية الأسهم في 10 مل الوقت الفاصل بين المتوسطة (TLM) المجهري (62 ك ₂ ملي هبو ₄ ، ص 44mM KH _{2 4} ، 15 ملم (NH _{4) 2} SO ₄ ، 6.5 ملي سيترات الصوديوم ، 0.8 ملي MgSO ₄ ، 0.02 ٪ أحماض casamino ، الجلوكوز 27.8 ملم ، 0.1 ملم L - التربتوفان ، تم تعيين الرقم الهيدروجيني إلى 7 باستخدام محلول KOH) تستكمل مع المضادات الحيوية ، وإذا لزم الأمر.
2. تنمو الخلايا بين عشية وضحاها في قارورة يهز (30 درجة مئوية ، 225 دورة في الدقيقة).
3. في صباح اليوم التالي ، 01:10 تمييع الخلايا في مرحلة ما قبل حرارة متوسطة محددة كيميائيا (CDM) (62 ك ₂ ملي هبو ₄ ، ص 44mM KH _{2 4} ، 15 ملم (NH _{4) 2} SO ₄ ، 6.5 ملي سترات الصوديوم ، 0.8 ملي MgSO ₄ ، 2.2mM الجلوكوز ، 2.1 L - حمض الجلوتاميك ملم ، 6 ميكرومتر تريبتوفان L - ، 7.5 ميكرومتر MnCl ₂ ، 0.15 مزيج معدني × (50x تحضير مزيج الأسهم MT (المرجع ⁸⁾ الذي يحتوي على : 0.2 M MgCl ₂ ، 70 ملم CaCl ₂ ، 5 ملي MnCI ₂ ، 0.1 ملم ZnCl ₂ ، 0.2 ملم ، هيدروكلوريد الثيامين ، حمض الهيدروكلوريك 2 مم ، 0.5 مم FeCl ₃ (إضافة مشاركة)) بدون المضادات الحيوية.
4. زراعة B. الرقيقة الخلايا إلى منتصف مرحلة الأسي (30 درجة مئوية ، 225 دورة في الدقيقة). عادة ، وهذا يستغرق حوالي أربع ساعات. الأهم من ذلك ، تعد الشريحة agarose ساعة واحدة قبل الوصول إلى الخلايا منتصف المرحلة الأسي (انظر القسم 2).
5. قياس الامتصاصية للثقافة في ل 600Nm (A ₆₀₀₎ ، وتمييع الخلايا لتقريبي من ₆₀₀ ألف 0.035 باستخدام آلية التنمية النظيفة. OD هذا يضمن أن يتم رصد الخلايا وحيدة مع تباعد المناسب على شريحة المجهر لمرور الزمن المجهري.

2. إعداد العينة المجهر (انظر أيضا الشكل رقم 2)

قبل ساعة واحدة تصل إلى خلايا منتصف النمو المتسارع ، وإعداد الشريحة المجهر على النحو التالي :

1. تنظيف الزجاج شريحتين المجهر (مثل Knittel زجاج 7.6 × 2.6 سم ،) مع 70 ٪ من الإيثانول والماء.
2. اتخاذ إطار الجين (ABgene ؛ 1.7 × 2.8 سم) وإزالة بعناية واحدة من رقائق البلاستيك من الإطار الجين دون التسبب في تفكك غطاء من البلاستيك على الجانب الآخر من الإطار الجينات.
3. نعلق الإطار الجين في منتصف واحدة من الشرائح الزجاجية التي كتبها أول اتصال تسهيل على جانب واحد فقط ، تليها مرفق يسترشد الإطار الجينات المتبقية مع ظفر. منع فقاعات الهواء في حين ربط الإطار الجين إلى الشريحة الزجاجية.
4. استخدام الميكروويف لإذابة 150 ملغ (1.5 ٪) عالية الدقة المنخفضة ذوبان agarose (سيغما) في آلية التنمية النظيفة 10 مل. وagarose يحتاج إلى حل كامل للحصول على الحد الأدنى من المعلومات الأساسية اللازمة للتجارب المجهري مرور الزمن. إذا لزم الأمر ، استكمال agarose - CDM مع محفز أو مركبات أخرى في هذا الوقت
5. نقل 500 ميكرولتر من آلية التنمية النظيفة ، agarose الدافئة في وسط الإطار الجينات. تأكد من تغطية كاملة على المنطقة كلها بما في ذلك (على الحدود).
   الخطوات التالية (2،6-2،10) يجب أن تكون نفذت بسرعة لمنع جفاف المفرط للagarose آلية التنمية النظيفة.
6. وضع شريحة زجاجية الثانية في إطار آلية التنمية النظيفة ، agarose الجين شغلها. في محاولة لتجنب فقاعات الهواء. مكان الشرائح تقع في وضع أفقي لمدة 45 دقيقة على 4 درجات مئوية في الثلاجة للسماح للagarose - CDM لترسيخ بما فيه الكفاية.
7. الشريحة بعناية خارج الشريحة الزجاجية العلوية. استخدام شفرة حلاقة لقطع شرائح من عرض آغار ~ 5 مم داخل الإطار الجينات ، والذي سيتم نمت الخلايا. ويمكن استخدام أقصاها ثلاث شرائح لكل شريحة ، مفصولة ~ مساحة 4 ملم إلى أي من الجانبين. وسوف توفر هذه المساحات الهواء وهو أمر ضروري لB. الرقيقة النمو. إذا أربع سلالات مختلفة يجب أن يتبع في الوقت المناسب ، يمكن أن يكون قطعتين وخفضت الى النصف لينتج أربعة مربعات صغيرة. إزالة أي وسيط المتبقية الصلبة.
8. إزالة الغطاء بعناية الثانية والنهائية من البلاستيك الإطار الجينات لكشف الجانب لزجة من الإطار الجين
9. تحميل الخلايا واحد (من الخطوة 1.5) على المدى المتوسط ​​الصلبة دون لمسها مع طرف الماصة. استخدام 2.5 ميكرولتر للشريط بأكمله ، أو 1 ميكرولتر لمربع صغير. تبدأ دائما في أعلى لوحة agarose والسماح لتفريق السائل بالتساوي على مساحة المخصصة للنمو من خلال تحويل الشريحة صعودا وهبوطا. الشريحة مستعدة ، في أقرب وقت حواف تصبح سائلة المموج وحركة السائل لم يعد مرئيا عندما تحول الشريحة.
10. مكان شريحة المجهر نظيفة زلة تغطية (24 × 50 ملم) على الإطار الجينات من جانب واحد على الآخر (تجنب فقاعات الهواء). أؤكد مرفق كاملة من خلال تطبيق الضغط على زلة تغطية على طول الإطار الجين مع ظفرك. إذا وضعت في زلة تغطية على الخلايا دون السماح لهم حتى يجف طويلة بما فيه الكفاية ، والخلايا تميل إلى النمو على رأس كل منهما الآخر أثناء التجربة. أيضا أن يكون حريصا على عدم الانتظار طويلا قبل تطبيق زلة تغطية ، ومنذ ذلك الحين agarose ستكون جافة جدا.
11. قبل الشريحة دافئة لمدة 1 ساعة عند 30 درجة مئوية. إذا الشريحة ثولد مباشرة يمكن وضعها في غرفة ما قبل حرارة البيئية (راجع الخطوة 3.1) من المجهر ، قد يسبب مشاكل التقلبات في درجات الحرارة أوتوفوكس في الساعات الأولى من التجربة.

3. الوقت الفاصل بين المجهري مضان (انظر الشكل 3 أيضا وفيلم 1)

1. قبل غرفة دافئة البيئية في الوقت المحدد (في أيدينا على الأقل 2H قبل بدء التجربة) من أجل منع حدوث مشاكل أوتوفوكس بعد بدء التجربة. الوقت اللازم يعتمد على غرفة البيئية المستخدمة فضلا عن نظام التدفئة والمجهر.
2. تحديد الهدف المناسب ، والمرشحات ومرآة مزدوج اللون الخاص وفقا لمجموعة تجريبية المتابعة. للتجارب طويلة تأكد من أن يتم وضع مرشح للأشعة فوق البنفسجية بين مصدر الضوء والعينة. أيضا ، إذا كان ذلك ممكنا ، وحجب بعض الضوء الإثارة باستخدام مرشحات الكثافة محايدة للحد من التعرض.

تم استخدام المعدات التالية (التي قدمها DeltaVision ، المملكة المتحدة) للتجارب المجهري الوقت الفاصل بين نشر في دي يونج وآخرون 2010 ⁵ : IX71 مجهر (أوليمبوس) ، CoolSNAP HQ2 الكاميرا (برينستون الآلات) ، 300W المصدر مصابيح زينون ، 60x مشرق الهدف حقل (1.25 NA) ، GFP filterset (كروما ، الإثارة في نانومتر 470/40 ، 525/50 الانبعاثات نانومتر) ، mCherry filterset (كروما ، الإثارة في نانومتر 572/35 ، 632/60 الانبعاثات نانومتر). تم تنفيذ أوتوفوكس باستخدام الضوء واستخدام diascopic الحاضر أوتوفوكس الروتينية في مجال البرمجيات وSoftworx Deltavision. تجدر الإشارة إلى أن هناك الآن عددا من أنظمة ضبط تلقائي للصورة الأخرى التي هي أيضا مناسبة مثل التركيز على مؤكد زايس ، ونظام التركيز نيكون الكمال والتركيز التحكم المتكيف لايكا.

3. برنامج تجربتك وفقا لمجموعة المتابعة الخاص التجريبية. فمن الحكمة لتحديد كمية الضوء المطلوبة لبنيات معينة ، فضلا عن ضبط تلقائي للصورة عن المجاهر الوقت الفاصل بين البكتيريا أو غيرها من قبل التجربة الفعلية. وسوف أقصر الأوقات ، والتعرض لأقل كمية الضوء تقليل الإثارة تبيض والضيائية. استخدام الضوء diascopic عن روتين أوتوفوكس.

تم استخدام الإعدادات التالية للتجارب المجهري الوقت الفاصل بين نشر في دي القاعدة وآخرون جونغ 2010 ⁵ : أخذت لقطات للأفلام على فترات من 8 أو 12 دقيقة باستخدام 10 ٪ APLLC الأبيض الصمام الخفيفة وق 0.05 التعرض للمجال الصور المشرقة ، 10 ٪ مصابيح الضوء والتعرض ليالي 0.5 للكشف عن GFP ، و 32 ٪ مصابيح الضوء والتعرض ليالي 0.8 للكشف عن mCherry ، على التوالي. تم تخزين البيانات الخام باستخدام softWoRx 3.6.0 (Presicion التطبيقية). كان مبرمجا لضبط تلقائي لل0.06 ميكرون خطوات ومجموعة مجموعه 1.2 ميكرون.

4. مكان الشريحة مستعدة (القسم 2) في غرفة ما قبل تحسنت البيئة المجهر ومراقبة ثمرة واحدة من الخلايا في المونولاير microcolony في 30 درجة مئوية.

نصائح محددة :

• تحديد الخلايا التي هي واحدة تقع في وسط لوحة آغار. لوح حواف آغار تجف بسهولة أكبر. تخزين موقف Z X ، Y ، وذلك باستخدام المجهر والبرامج.
• قد تحركات واسعة للمرحلة في X و Y و Z اتجاه التشويش على agarose وتعرقل بالتالي تحديد الخلايا التي روتين أوتوفوكس. بشكل عام ، للحد من X ، Y ، Z الحركة ، ونحن لا اختيار أكثر من 10 وظائف في التجربة حتى لو كان يحتوي على شريحة سلالات متعددة.
• بعد تحديد الخلية الأولى ، فقط ضبط Z - التركيز مع البرنامج. من هذه النقطة ، لا يغير من التركيز على الجسم يدويا باستخدام المجهر "Z - مقبض الباب" ما لم يتم ترميز هذه رقميا. ضمان بعد كل روتين أوتوفوكس العاشر الجديد ، Y ، Z يتم تخزين الموقف من البرنامج.
• تحقق ما إذا كان إعدادات ضبط تلقائي للصورة مناسبة لهذه التجربة ، قبل البدء في تشغيلها. قد تستخدم المرحلة على النقيض من المجهري تحسين روتين أوتوفوكس مقارنة باستخدام المجهر brightfield أو مدينة دبي للإنترنت ، وذلك بسبب التباين المحسن. ومع ذلك ، الحلبة في المرحلة المرحلة على النقيض من أهداف يجعلها أقل حساسية (حوالي 10 ٪) في جمع ضوء مضان. حتى لعينات الفلورسنت ضعيفة ، هو أكثر ملاءمة هدفا دون خاتم المرحلة.
• تحقق ما إذا كانت الخلايا المحددة لا تزال في تركيز كل نصف ساعة ، وحتى التجربة يشغل ثابت. عندما الخلايا في هذه المرحلة هي من التركيز ، وضبط يدويا. نظرا لاختلاف درجة الحرارة ، وكذلك العينات المجففة سيئة ، وهذا قد يكون من الضروري خلال الساعات الأولى. وعلاوة على ذلك ، وذلك بسبب التباين المحسن ، ويعمل بشكل أفضل عندما أوتوفوكس أكثر من الخلايا الموجودة في مجال الرؤية.

5. بعد التجربة انتهت ، فصل قنوات مختلفة من الفيلم وآمنة لهم كملفات منفصلة (أي عكس المرحلة ، GFP ، mCherry) إذا لزم الأمر (حزم اقتناء بعض ستضع جميع القنوات في ملف واحد مرصوف). للنشر ، ويمكن أن يتعزز من خلال الصور deconvolution 2D ، الذي هو منا وخاصةeful للدراسات الترجمة البروتين. Deconvolve الصور باستخدام برنامج المجهر الخاص أو مع مجموعة تجارية مثل هيغنز ( www.svi.nl ).
6. تحليل البيانات باستخدام ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) (استخدام الخام ، وملفات الصور غير المجهزة لهذا) و Microsoft Excel أو قطعة سيغما. على سبيل المثال يمكن كدسات يتم حفظها كملف "افي". الفيلم في ImageJ. ويرد وصف مفصل لكيفية مضان واحدة من الخلايا يمكن أن يقاس في الوقت المناسب أدناه.

4. تحليل البيانات للديناميات النشاط المروج باستخدام ImageJ

نلاحظ أن غيرها من حزم البرامج الجيدة المتاحة والتي هي متخصصة في تحليل الصور المجهري مرور الزمن مثل برنامج BHV ^{9 ، 4} ، ¹⁰ Schnitzcell ، PSICIC ¹¹ ، وميكروب المقتفي - ¹² ، ولكن هنا علينا أن نركز على حزمة ImageJ المتاحة بحرية.

1. تحميل ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) و (إذا لزم الأمر). البرنامج المساعد الصحيح لفتح الخاص بك (المكدسة) الملف يمكن على سبيل المثال فقط ، والأفلام المسجلة باستخدام المجهر deltavision يمكن فتحه في ImageJ مع البرنامج المساعد فتحت deltavision. نسخ DV - المساعد في مجلد البرنامج المساعد ImageJ وبدء البرنامج. تغيير سعة الذاكرة في تحرير / الخيار / الذاكرة والمواضيع في 1250. وهذا يسمح بالعمل مع اكبر ملفات مثل تلك التي حصلنا عليها من الوقت الفاصل بين الأفلام.
2. لتقييم التاريخ خلية من خلية واحدة ، مفتوحة على النقيض من مرحلة واحدة من الفيلم الأصلي microcolony وانتقل إلى آخر في إطار اهتمام في الفيلم. حدد "خطوط مجزأة" زر التحديد في القائمة.
3. رسم خط في الخلفية ثم اضغط على "CTRL" + "T". وهذا فتح مناطق مدير (ROI) الفائدة. (يمكن استخدام مضان الخلفية المقابلة القيمة إلى طرح يدويا الخلفية -- أنظر أدناه بدلا من ذلك ، استخدم في روتين الطرح الحالي خلفية داخل ImageJ) تعادل أيضا خط في خلية من الفائدة والعائد على الاستثمار إضافة إلى مدير العائد على الاستثمار. منذ نحن نحقق المروج - GFP اندماج في دراسة الحالة هذه وتنتشر في جميع أنحاء GFP السيتوبلازم ، ينبغي للخلية كاملة تحتوي على قيم مضان مماثلة لكل بكسل واحد في طول الخلية. انتقل إطار واحد ، العودة في الوقت المناسب وتحديد عائد الاستثمار الجديدة في الخلية نفسها من الاهتمام. حفظ هذا ROI الثالث ومواصلة الإجراء حتى يتم حفظ ROI المقابلة في الإطار الأول من الفيلم.
   أن ندرك أن مضان من الخلايا يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا ابنته بعد انقسام الخلايا. إما استخدام صبغة الأغشية التي يمكن تطبيقها جنبا إلى جنب مع مضان البروتينات التي تنتجها الخلايا (مثل الجمع بين وزير الخارجية غشاء صبغة حمراء ^® 5-95 (Invitrogen) وGFP) لتصور تشكيل الحاجز. وينبغي في هذه الحالة يمكن استخدام قناة المقابلة وليس العكس مضان المرحلة الفيلم لمتابعة الخلايا في الوقت المناسب. بدلا من ذلك ، يمكن للمرء أن البقاء على الجانب الآمن من خلال تحديد وعائد الاستثمار في واحد فقط نصف خلية.
4. داخل مدير ROI ، انقر فوق "حفظ". إذا إنهاء الملف ". ROI" ، ثم يختار واحد عائد الاستثمار في القائمة ، وإلا سيتم حفظ هذه واحدة. إذا إنهاء الملف ". البريدي" ، ثم يتم حفظ مجموعة كاملة (مطلوب).
5. إغلاق الفيلم عكس المرحلة وفتح الفيلم الأصلي مضان (مثل GFP). انقر على زر "عرض كل" و "التدبير" في إدارة العائد على الاستثمار. وسوف تفتح نافذة جديدة (النتائج). نسخ النتائج في ورقة اكسل وطرح مضان يعني لكل خلية واحدة من مضان خلفية المتوسط. ويمكن رسم مضان الناتج الصافي ضد الساعة للكشف عن نشاط المروج للخلية من الاهتمام في الوقت المناسب.
6. بدلا من ذلك ، يمكن تحليل مضان من كافة الخلايا من microcolony في نقطة زمنية محددة. من أجل القيام بذلك اختيار وحفظ ودوروا لخلفية وكل خلية واحدة في إطار واحد ، كما هو موضح أعلاه ، نسخ القيم مضان إلى Excel وانتاج رسوم بيانية باستخدام "المدرج" وظيفة في قائمة "أدوات".
7. للحصول على صورة واحدة من الإطارات للنشر ، حدد الإطار من الاهتمام ، حدد "صورة" -- "تكرار الصورة" وتغيير نوع من الصور الى "RGB" أو "8 بت" عن طريق اختيار "صورة" -- "اكتب" -- "RGB اللون" أو "8 بت". حفظ الإطار تتكرر كما هي ". شجار". يمكن فتح هذه الصور بواسطة برامج الرسم RGB/8-bit التقليدية مثل برنامج CorelDRAW أو المصور أدوبي. إذا لزم الأمر ، يمكن تكييف الصور باستخدام "صورة" -- "ضبط" -- "السطوع / التباين" أو "صورة" -- "ضبط" -- "نافذة / المستوى" في ImageJ.

5. الأفلام المنتجة للنشر مع ImageJ

1. فتح النقيض من المرحلة الفيلم الأصلي ومضان المقابلة (ق) في ImageJ على النحو المبين أعلاه. حدد زر الاختيار مستطيلة (1 ^شارع على اليسار) ورسم مستطيل ROI في الإطار الأول في مثل هذه الطريقة ، وهذا هو أرفق microcolony النامية بحلول throu ROIghout الفيلم كله. حدد "صورة" -- "المحاصيل" وآمنة أصغر نسخة من هذا الفيلم تحت اسم جديد. حدد ROI نفسه عبر مدير ROI في فيلم مضان والمضي قدما كما كان من قبل.
2. الجمع بين الأفلام إما أفقيا أو رأسيا ، حدد "المساعد" -- "المكدس الموحد". إذا رغبت في ذلك ، يمكن إضافة محرد وقت عبر "المساعد" -- "محرد الوقت". حفظ المكدس مجتمعة مرة واحدة ". DV" أو ". شجار" وبالتالي مرة واحدة ". افي" أو فيلم كويك تايم.

التكيفات بديلة لبروتوكول العقدية الرئوية (الشكل 4 و الفيلم 2) :

6. إعداد S. ثقافات الرئوية

1. تنمو S. الخلايا الرئوية (كبسولات سلالة D39 ¹³ أو ¹⁴ سلالة unencapsulated R6 والثقافات واقفا في Y C + ¹⁵ في المتوسط ​​37 درجة مئوية يتم التوصل حتى يتم التطوير التنظيمي في ألف _{ل 600Nm} 0.4 تقريبا. نابذة الخلايا لمدة 2 دقيقة على 14000 دورة في الدقيقة و resuspend في خلية بيليه في حجم الطازجة C + Y المتوسط ​​تحتوي على الجلسرين 14.5 ٪ (V / V) التي من شأنها أن تؤدي إلى 0.4 ألف _{ل 600Nm} بالضبط. قسامة الخلايا وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
2. لمرور الزمن المجهري ، يأخذ قسامة س مثقف مسبقا الرئوية الخلايا. تطعيم 4 مل من جديد C + Y 1:100 المتوسطة مع الخلايا من قسامة -80 درجة مئوية. تنمو الخلايا حتى منتصف المرحلة الأسي لOD من ألف _{ل 600Nm} من 0،1-0،2. عادة ، وهذا يستغرق حوالي 2 ساعة عند استخدام خلايا من aliquots -80 درجة مئوية.

7. إعداد العينة المجهر

1. إعداد شريحة المجهر على النحو المبين أعلاه لB. الرقيقة ولكن تأكد من أن يحتوي على agarose معقدة C + Y المتوسطة. منذ س. الرئوية هي microaerophile ، ينبغي للجيوب هوائية بين شرائح agarose ليكون أصغر من B. الرقيقة (~ الفضاء 1 ملم على كلا الجانبين).
2. قياس الامتصاصية للثقافة في 600 نانومتر (A ₆₀₀₎ ، ويخفف من تزايد أضعافا مضاعفة الخلايا الرئوية S. لتقريبي من ₆₀₀ ألف 0،05 باستخدام C + Y المتوسطة واستخدام هذا التخفيف لتحميل الشريحة agarose.

8. الوقت الفاصل بين مرحلة التباين المجهري

ضبط إعدادات المجهر لS. الرئوية : استخدام الفحص المجهري على النقيض من المرحلة منذ S. الرئوية من الصعب تحديد باستخدام مشرق الميدان المجهري. مواصلة بروتوكول كما هو موضح لB. الرقيقة (اتبع الخطوات 2،9-3،7). S. يمكن زراعة الخلايا الرئوية في أي 30 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية (أنها تنمو بشكل أسرع عند 37 درجة مئوية).

9. ممثل النتائج :

وقد تم تنفيذ التجربة مضان الوقت الفاصل بين الخروج بنجاح ، إذا كانت البكتيريا نما إلى المونولاير microcolony ، الذي يقع بالكامل داخل مجال الرؤية في نهاية التجربة (انظر الشكل 5A - C). إذا نمت الخلايا على رأس كل منهما الآخر ، ليس فقط من المستحيل نتتبع تاريخهم بدقة ، ولكن أيضا لا يمكن أن مستويات مضان من الخلايا المتداخلة يمكن قياسها بشكل صحيح. الخلايا تميل إلى النمو على رأس كل منهما الآخر ، إذا لم تجفف الخلايا رصدت بما فيه الكفاية (الخطوة 2.9) أو إذا كانت تركيبة المتوسطة بحاجة إلى تعديل للحصول على تباطؤ النمو. إذا microcolony انبثقت عن الرأي ، فلا توزيع الاشارات مضان في غضون مستعمرة يتم تحديدها. يمكن أن يؤدي الى "حركة microcolony" يمكن تجفيف كافية من الخلايا رصدت (الخطوة 2.9) ، أو إذا لم تكن مبرمجة في البرنامج لتعقب microcolony خلال التنمية. علاوة على ذلك ، فمن المهم أن بقع المحلية مضان زيادة لا يمكن كشفها في المتوسط ​​لأن هذا يحجب الاشارات القادمة من مضان الخلايا (انظر الشكل 5D - F). يمكن أن تنشأ مشاكل تتعلق الخلفية من مركبات وسائل الإعلام ، أو غير منحل airbubbles كتل agarose. لتصور هذا ، وتبين لنا في الشكل. الإشارات الخلفية 5F هذه الشريحة تحديدا عندما تم أخذ صورة باستخدام الإثارة / الانبعاثات المرشحات للأصباغ الفلورسنت الأحمر. كما رأينا ، وبقع autofluorescent مشرق موجودة والتي يمكن أن تعيق التصوير. لمنع مثل هذه المواقع ، تأكد من أن تتفكك agarose وليس هناك أي airbubbles عند وضع ساترة على الشريحة المجهر.

الشكل 1 : نظرة عامة تجريبية

الشكل 2 : إعداد العينة المجهر

الشكل 3 : الوقت الفاصل بين المجهري مضان باء الخلايا الرقيقة ايواء _kinB GFP - P الانصهار. يتم أخذ لقطات من فيلم 1. لوحات كبار : حقل مشرق ، ولوحات السفلي : GFP القناة.

تينلدى عودتهم 4 : الزمن الفاصل بين مرحلة التباين المجهري س. الرئوية نوع السلالة البرية R6. يتم أخذ لقطات من فيلم 2.

الشكل 5 : توضيحات من الممكن نتائج الفحص المجهري (مرور الزمن). ميلان يعرض العوامل التي يجب النظر للبيانات التي تم الحصول عليها مع إعدادات الضوء diascopic. (A) Brightfield صورة مجهرية لmicrocolony أحادي الطبقة (نتيجة ايجابية) من sporulating B. الصورة الرقيقة الخلايا Brightfield (B) من B. microcolony الرقيقة التي نمت بعض الخلايا على رأس كل منهما الآخر (النتيجة سلبية) صورة Brightfield (C) لباء sporulating microcolony الرقيقة التي انبثقت من مجال التركيز (النتيجة سلبية). العوامل التي تحتاج إلى إظهار مدافع للنظر في البيانات التي تم الحصول عليها مع إعدادات الضوء على النقيض episcopic المرحلة (D) صورة B. الرقيقة الخلايا في مرحلة تصور الأسي لتصور فيها إشارات مضان في E و F تنبع من اشارات GFP (E) من الخلايا هو موضح في ملاحظة أن إشارات دال خلفية متشابهة في كل بكسل (نتائج ايجابية). نلاحظ أيضا أن الوقت قد يكون تعرض الكثير من خلية واحدة منذ يظهر إشارة المشبعة (النتيجة سلبية) (F) الإشارات التي تم الحصول عليها من خلال القناة الحمراء من الخلايا هو موضح في ملاحظة أن الخلفية دال يحتوي على المناطق مع زيادة مستويات مضان أحمر (سلبي نتائج).

الفيلم 1. الوقت الفاصل بين المجهري مضان باء الخلايا الرقيقة ايواء _kinB GFP - P الانصهار. واتخذت لقطات في فترات دقيقة و 8. اليسار : حقل مشرق ، واليمين : GFP القناة. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.

الفيلم 2. الوقت الفاصل بين مرحلة التباين المجهري س. الرئوية نوع السلالة البرية R6. واتخذت لقطات في فترات 10 دقيقة. اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.

Discussion

على النقيض من العديد من تقنيات خلية واحدة ، يمكن أن تستخدم في الوقت الفاصل بين الأسلوب المجهري مضان وصفها هنا لمتابعة التاريخ خلية محددة فيما يتعلق أسلافها ، سلوكها ، والأحداث الانقسام. بالاشتراك مع المروجين الهدف fluorescently المسمى أو البروتينات ، ويمكن تتبع مسار محدد تنشيط النمو في وقت والتوطين ، وكذلك البروتين يمكن رصدها خلال تطوير ديناميات البروتين البكتيري.

كما هو مبين أعلاه ، يمكن إجراء دراسات تركز على الأنواع البكتيرية المختلفة من خلال تكييف ظروف النمو وفقا لمتطلبات لجرثومة معينة. ترتبط القيود الوحيدة التي واجهناها لظروف النمو وحجم العينة. بسبب وجود بيئة مغلقة ، لا يمكن أن تتغير الظروف المتوسطة أثناء التجربة. وعلاوة على ذلك ، يمكن رصد مدة أقصاها أربع سلالات في التجربة بكفاءة.

ويمكن بسهولة النظر في بضع خطوات حاسمة ، فإن التحليل خلية واحدة الطريقة الموصوفة هنا يمكن تطبيقها باستخدام أي المجهر الآلي. في ما يلي ، سيتم إعطاء لمحة عامة عن هذه الخطوات الحاسمة. ويمكن الاطلاع على معلومات مفصلة في النص الرئيسي استعدادا العامة : ومن الحكمة أن تحقق من إعدادات ضبط تلقائي للصورة المطلوبة لجرثومة معينة قبل التجربة. وبالمثل ، ينبغي تحديد إعدادات الأمثل التقريبية لتصور مضان مقدما ، إذا أمكن ذلك. علاوة على ذلك ، أعدت بعد زمني يساعد على الحصول على جميع المواد جاهزة للاستخدام في الوقت المناسب (قبل ارتفاع درجة حرارة الغرفة المجهر ، برمجة الإعدادات المجهر ، وإعداد الشريحة قبل ساعة واحدة من الخلايا في مرحلة النمو المطلوبة ، انظر الشكل 1) . النمو باء يتم تعريف كيميائيا TLM وآلية التنمية النظيفة وسائل الاعلام المجاعة التي B. : الرقيقة في TLM وآلية التنمية النظيفة الرقيقة تنمو إلا ببطء. قد الفترة الزمنية التي تزرع الخلايا في وسائل الإعلام أن تكون طويلة اعتمادا على سلالة معينة. نمو بطيء يمنع الخلايا من تتراكم على بعضها البعض إعداد العينة المجهر : فقاعات الهواء بين الإطار الجيني ، وشريحة زجاجية وانزلاق الغطاء يجب أن تكون منعت لمنع جفاف واسعة من الوسط agarose مقرا لها. والشيء نفسه ينطبق على واجهة زلة متوسطة / الغطاء. فمن الأهمية بمكان السماح للخلايا جافة بدرجة كافية لمنع السباحة و / أو متعددة نمو طبقة من الزمن الفاصل بين المجهري مضان : ما قبل ارتفاع درجة حرارة الشريحة فضلا عن غرفة البيئية أمر حاسم لمنع حدوث مشاكل أوتوفوكس الرئيسية. يجب أن يتم تحديد الخلايا في منتصف اللوحة آغار ، لأن هذه لديها أعلى فرصة للبقاء في الميدان والتركيز خلال هذه التجربة (شريطة أن تكون العينة المجففة جيدا بما فيه الكفاية). كحد أقصى من 10 موقعا في التجارب لا تزال تعمل بشكل صحيح. بعد تحديد الخلية الأولى من الاهتمام فقط استخدام البرنامج لضبط التركيز (انظر النص للحصول على التفاصيل). تحقق ما إذا كانت الخلايا لا تزال في التركيز خلال الساعات الأولى من التجربة في فترات 30 دقيقة التحليل : من المهم أن تحقق قبل إجراءات تحليل ما إذا كان تمديد خلفية المتوسطة وقيم متشابهة في القنوات مضان. يمكن أن جزيئات الغبار الصغيرة والمتوسطة المكونات ، والعدسات القذرة أو كتل صغيرة agarose تسهم في زيادة مضان محليا ، مما يجعل من الصعب أو المستحيل فيلم لتحليل مشكلة اطلاق النار : إذا كانت الخلايا تنمو على رأس كل منهما الآخر ، وهذا قد يشير إما أن كانت ساترة تعلق قريبا جدا أو التي لا تناسب المتوسط ​​لنمو monolayers microcolony. إذا الخلايا ذات الاهتمام يموت قبل الأوان بشكل مستمر ، بينما الخلايا الأخرى على الشريحة تقسيم لحسن الحظ ، قد تحتاج إلى التحقق ما إذا كان يمكنك وضع مرشح للأشعة فوق البنفسجية في الموقف. فإنه قد يساعد أيضا على تقليل مدة التعرض أو شدة الضوء خلال تجارب طويلة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Frame	ABgene Limited	AB-0578	1.7 x 2.8 cm
high-resolution low melting agarose	Sigma-Aldrich	A4718
big cover slip	Multiple Suppliers		24 x 50 mm
if desired, membrane dye, e.g. FM 5-95	Invitrogen	T23360	other membrane dyes are also available: http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf
Time-lapse microscope with environmental chamber	Multiple Suppliers		see details for our device in the corresponding sections