Summary
该协议提供了一步一步的程序，以监控不同细菌的单细胞在使用自动荧光时间推移显微镜的行为。此外，我们提供指引如何分析显微镜图像。
Abstract
科学家在过去的几年里变得越来越意识到，从微生物的人口为基础的实验中获得的平均数据是不是代表的行为，状态或单细胞的表型。由于这一新的见解的单细胞的研究数量不断上升（ 见 1,2,3最近的评论） 。但是，许多应用技术的单细胞不容许一个特定的时间的单细胞（如流式细胞仪或标准显微镜）的发展和行为监测。
在这里，我们提供了一个在最近的几项研究4，5，6，7，允许以下和录音（荧光） 枯草芽孢杆菌和链球菌肺炎通过许多代人的增长和分工个别细菌细胞使用显微镜方法的详细描述。由此产生的电影可以被用来构造内的人口，从一个共同的祖先起源追溯历史的一个单细胞进化谱系树。这时间推移荧光显微镜方法不仅可以用于研究单个细胞的生长，分裂和分化，而且对特定的细胞行为分析细胞的历史和祖先的效果。此外，时间推移显微镜非常适合在细菌细胞周期研究的基因表达的动态和蛋白定位。该方法说明如何准备的细菌细胞和构造的显微镜幻灯片单个细胞的生长，使microcolony。总之，发现单核细胞在半固体表面辅以琼脂糖上，他们的成长和荧光显微镜下隔膜内的温度控制环境室的生长介质组成。拍摄的图像在特定的时间间隔，以后分析使用开放源码软件ImageJ。
Protocol
1。准备B 的枯草文化
- 接种细胞从-80 ° C的股票在10毫升的时间推移显微镜（TLM），中期（62毫米K 2 HPO 4，44mm的KH 2 PO 4，15毫米（NH 4）2 SO 4，6.5 mM柠檬酸钠，0.8毫米硫酸镁 ，0.02％casamino的氨基酸，27.8毫米的葡萄糖，0.1毫米L -色氨酸，pH值设置为7使用一个氢氧化钾溶液）补充抗生素，如有必要。
- 成长的细胞在摇瓶（30 ° C时，225 RPM）过夜。
- 第二天早晨，1:10稀释细胞在预热化学定义介质（CDM）（62毫米K 2 HPO 4，44mm的KH 2 PO 4，15毫米（NH 4）2 SO 4，柠檬酸钠6.5毫米，0.8毫米硫酸镁 ，2.2MM葡萄糖，2.1毫米L -谷氨酸，L -色氨酸6微米，7.5微米，0.15 x金属混合（准备50X吨股票组合（编号8），其中包含：0.2 M MgCl 2的70毫米MnCl 2 氯化钙 ，5毫米，0.1毫米氯化锌 ，0.2毫米硫胺素盐酸盐，盐酸2毫米，0.5毫米FECL 3（添加最后一个）），不含抗生素 2 MnCI 。
- 成长的B。枯草芽孢杆菌细胞指数中期阶段（30℃，225 RPM）。通常，这大约需要4个小时。重要的是，准备琼脂糖幻灯片细胞到达前一个小时指数中期阶段（见第2节）。
- 测量在600nm处600（一）文化的吸光度和稀释细胞近似 600 0.035使用清洁发展机制。这外径确保时间推移显微镜的显微镜玻片上发现的单细胞，与适当的间距。
2。显微镜样品制备（见图2）
细胞到达前一个小时中指数增长，准备在显微镜幻灯片如下：
- 两个显微镜玻片上（例如Knittel玻璃，7.6 × 2.6厘米），用70％乙醇和水的清洁。
- 以一个基因框架（ABgene; 1.7 × 2.8厘米），并仔细清除，而不会造成基因框架的另一侧的塑料盖，拆卸从基因框架的塑料薄膜。
- 将在玻片首先促进只是一个侧面的接触，用指甲其余基因框架的指导附件中的基因框架。而附加的基因帧载玻片防止气泡。
- 使用微波溶解150毫克（1.5％）高清晰度低熔点琼脂糖（Sigma公司），在10毫升的清洁发展机制。琼脂糖需要充分溶解，以获得最小的背景的时间推移显微镜实验所需。如果需要，补充诱导剂或其他化合物，此时琼脂糖CDM
- 转移的基因框架中500μL的热情琼脂糖CDM。确保完全覆盖整个地区，包括（边界）。
以下步骤（2.6 - 2.10），以进行迅速，以防止过度干燥的琼脂糖CDM。 - 琼脂糖CDM基因框架填充上放置第二个载玻片。尽量避免气泡。夹着幻灯片放置在水平位置为4分45 ° C的冰箱，让琼脂糖CDM充分巩固。
- 小心地滑出上载玻片。用刀片切出琼脂〜5毫米宽基因框架内，细胞将增长带。每张幻灯片可以使用最多3条〜4毫米的空间分隔一方。这些空间将提供B 的 ，这是不可或缺的空气枯草芽孢杆菌的增长。需要时间，如果有四个不同的菌株，可以和两个带被削减了一半，导致四个小方块。除去残留的固体培养基。
- 小心地从基因框架的第二次，也是最后一次的塑料盖，揭露粘边的基因框架
- 用吸管尖而不触及负载的固体培养基上的单核细胞（步骤1.5）。整个地带，或1μL一个小广场上使用2.5μL。始终琼脂糖垫之上，并开始让液体分散分配给它的增长领域，同样转动向上和向下滑动。幻灯片做好准备，尽快液体的边缘成为瓦楞纸箱和液体的运动不再可见时打开的幻灯片。
- 将帧从一个侧面向其他基因（避免气泡）上一个干净的显微镜滑盖滑（24 × 50毫米）。保证完整基因框架用指甲沿盖玻片上施加压力的附件。如果盖玻片的细胞中，而不让他们足够长的时间干细胞往往在实验过程中，以增加彼此顶部。另外要小心不要等待时间过长，在提出申请前盖玻片，因为琼脂糖然后将过于干燥。
- 预温的幻灯片，在1小时30 ° C。如果幻灯片瓦特乌尔德直接放在显微镜（见步骤3.1），在预热的环境室的温度波动，可能会导致实验的第一个小时的自动对焦问题。
3。定时荧光显微镜（也看到图3和电影1）
- 预温时间的环境室（在我们的手中至少在实验开始前2小时）在实验开始后，为了防止自动对焦的问题。所需的时间取决于环境室加热系统和显微镜以及用作。
- 根据你的实验设置，选择适当的目标，过滤器和分色镜。对于确保长期实验的紫外线过滤器是放在光源和样品之间。此外，如果可能的话，阻止一些使用中性密度滤光片，以尽量减少暴露激发光。
用于下列设备（英国DeltaVision，提供），德容等人发表的时间推移显微镜实验2010年5月 ：IX71显微镜（Olympus），CoolSNAP HQ2相机（普林斯顿仪器），300W氙灯光源，60X明亮领域的目标（1.25 NA），GFP filterset（色度，四十零分之四百七十零nm的激发，发射五十零分之五百二十五纳米），mCherry filterset（色度，在35分之572纳米激发，发射六十〇分之六百三十二纳米）。自动对焦是用透射光，并使用自动对焦例行目前Deltavision的Softworx软件。应当指出，现在有一些其他的自动对焦系统，也适合如蔡司定重点，尼康完美的对焦系统和徕卡自适应焦点控制。
- 计划您的实验，根据实验设置。它是明智的，其他时间推移显微镜或细菌的实际实验之前确定的特定构造所需的光量，以及自动对焦设置。更短的曝光时间和激发光量较少，将最大限度地减少漂白和光毒性。使用自动对焦常规的透射光。
以下设置德容等人发表的时间推移显微镜实验用于2010年5月 ：电影快照每隔8或12分钟，使用10％APLLC白LED亮场画面的光线和0.05秒曝光， 10％的氙气灯和GFP的检测，32％氙气灯和0.8 S的曝光mCherry检测，分别为0.5秒曝光。原始数据存储，使用softWoRx 3.6.0（应用Presicion）。 0.06微米的步骤和一个1.2微米的总范围设定为自动对焦。
- 放置在显微镜的环境室的预热准备幻灯片（第2）和监控成microcolony单层生长的单细胞在30 ° C
特别提示：
- 选择的单细胞在琼脂板的中间。琼脂的边缘垫干出更容易。存储的X，Y，Z位置使用显微镜的软件。
- 舞台的大动作，在X，Y和Z方向的可能扰乱琼脂糖，因此妨碍识别自动对焦例行细胞。在一般情况下，尽量减少X，Y，Z轴运动，我们不选择10％以上实验职位，即使幻灯片包含多株。
- 后选择第一个单元格，只调整与软件的Z -焦点。从这一点来说，不改变焦点手动显微镜上使用的“Z -旋钮”，除非这是数字编码的机构。确保每个自动对焦例行后，新的X，Y，Z位置是存储软件。
- 检查是否自动对焦设置适当的实验，在开始运行之前。相衬显微镜的使用可能会提高使用明或DIC显微镜相比，自动对焦常规，由于增强对比度。然而，在相衬目标相环，使他们较不敏感，在收集的荧光光（约10％）。因此，对于弱荧光的样品，无相环的目标是更适合。
- 检查选定的单元格是否仍然在集中，每半小时，直到实验运行稳定。当细胞在这一点上是重点，手动调整。由于温度的变化，以及不好干样品，这可能是在第一时间内所必需的。此外，由于提高对比度，自动对焦更好的作品时，更多的细胞，在视野。
- 实验结束后，独立电影作为单独的文件和安全的不同渠道（即相衬，GFP，mCherry）（如果需要一定的收购包堆放在一个单一的文件将放置所有通道）。出版物，图片可以增强2D去卷积，尤其是我们蛋白定位研究eful。 Deconvolve使用显微镜的软件或图像，如商业惠更斯（ 包 www.svi.nl） 。
- 使用ImageJ（ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）（使用的原料，未经处理的图像文件）和Microsoft Excel或西格玛剧情分析数据。堆叠可以例如保存为“AVI”ImageJ电影文件。下面给出一个可以在时间测量荧光单细胞的详细描述。
4。使用ImageJ的启动子活性的动态数据分析
我们注意到，其他良好的软件包，这是专门在BHV软件9，4，Schnitzcell 10，PSICIC 11，以及微生物跟踪12，如时间推移显微镜图像分析，但在这里我们重点免费提供的ImageJ包。
- 下载ImageJ（ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ）（如有必要）正确的插件打开你的文件（堆叠） 。例如，电影记录使用deltavision显微镜只能开在ImageJ该DeltaVision首战插件。 ImageJ插件文件夹中复制DV插件和启动程序。更改编辑/选项/ 1250内存和线程的内存容量。这允许更大的文件，如那些从时间推移电影获得工作。
- 要评估一个单细胞的细胞历史，打开原始相衬电影microcolony和滚动到最后一帧，在电影的兴趣。选择“分割线”菜单中的选择按钮。
- 在后台绘制的行，然后按“Ctrl”+“T”型。这将打开的权益回报率（ROI）经理区域。 （相应的背景荧光值，可用于手动减去背景 - 见下文或者使用内ImageJ背景减法例行目前）还提请在利益的细胞，增加的投资回报率的投资回报率经理。由于我们是在这种情况下，研究调查子- GFP融合GFP是分散在整个细胞质中，整个小区每个单个像素的整个细胞的长度应该有类似的荧光值。滚动一帧的时间，并选择一个新的投资回报率在同一单元格的兴趣。保存这第三次的投资回报率，已保存的程序继续下去，直到相应的投资回报率在动画的第一帧。
要知道，大大细胞分裂后子细胞的荧光可以有所不同。既可以使用膜可应用于荧光蛋白产生的细胞（如红膜染料调频® 5-95（Invitrogen公司）和GFP的结合），可视隔形成的染料。在这种情况下，相应的荧光通道和不相衬的电影应该被用来追踪细胞的时间。另外，人们可以留在安全方面的投资回报率的选择只有一个一个细胞的一半。 - 在投资回报率Manager，点击“保存”。如果文件的结尾是“投资回报率。”，然后在列表中选择一个投资回报率，仅这一项将被保存。如果文件的结尾是“压缩”，然后将保存一整套（必需）。
- 关闭相衬电影和开原荧光的（如GFP）的电影。点击“显示所有”和“措施”中的投资回报率经理。将打开一个新窗口（结果）。复制到一个Excel工作表的结果，并减去每个介质的背景荧光的单细胞的平均荧光。对由此产生的净荧光可以绘制时间，揭示了细胞在时间上的兴趣的启动子活性。
- 另外，microcolony的所有细胞的荧光，可分析在特定的时间点。为了做这个选择并保存在一帧的投资回报率的如上所述的背景和每一个细胞，荧光值复制到Excel和生产使用的“工具”菜单中的“直方图”功能的直方图。
- 为了获得出版的单帧图片，选择感兴趣的框架，选择“图像” - “复制图片”和改变的图像类型为“RGB”或“8位”选择“图像” - “类型” - “RGB颜色”或“8位”。保存复制帧“。TIFF”。 RGB/8-bit图片可以打开传统的绘图程序，如CorelDraw或Adobe Illustrator。如果需要，可适应在ImageJ使用“图像” - “窗口/水平” - “调整” - “亮度/对比度”或“形象” - “调整”图片。
5。生产与ImageJ出版电影
- 打开原始的相衬ImageJ相应的荧光电影（S）如上所述。选择矩形选择按钮（1左ST），在这样的方式在第一帧绘制一个矩形的投资回报率，发展microcolony是封闭的投资回报率THROUghout整个电影。选择“图像” - “作物”和安全的下一个新的名字电影的更小的版本。选择在荧光电影通过相同的投资回报率的投资回报率经理和前进行。
- 要水平或垂直结合的电影，选择“插件” - “栈合成”。如果需要，可以增加时间压模，通过“插件” - “时间压模”。保存一次。“DV”或“TIFF”，一旦合并堆栈。“AVI”或QuickTime影片。
肺炎链球菌替代议定书“的适应化修改（图4和电影2 ）：
6。准备的S.肺炎文化
- 成长S。肺炎细胞（封装应变D39 13，或者未封装应变R6站在文化在C + Y培养基15 14在37 ° C时，直到OD约0.4 600nm处达到离心2分钟14000转的细胞重悬细胞沉淀在一个新鲜的C + Y培养基中含有甘油14.5％（V / V），这会导致在一个600nm处正好0.4分装的细胞，并储存于-80 ° C以供将来使用量。
- 时间推移显微镜，以前养殖南等分肺炎细胞。接种4毫升的新鲜C + Y培养基细胞从-80℃等分1:100。成长，直到中旬指数生长期的细胞一个0.1 600nm处的OD - 0.2 。通常情况下，这需要约2小时，使用时从-80 °彗星等分细胞。
7。显微镜样品的制备
- 上面所述为 B准备载玻片枯草 ，但确保琼脂糖包含复杂的C + Y介质。由于南肺炎是microaerophile，琼脂糖带之间的气泡应小于B 的枯草芽孢杆菌 （〜1毫米的空间，双方）。
- 在600海里（600）一个文化的吸光度测量，淡化指数增长的肺炎链球菌细胞近似600 0.05使用C + Y介质和使用稀释负载琼脂糖幻灯片。
8。时间推移相衬显微镜
调整显微镜设置肺炎：使用自南相衬显微镜肺炎链球菌是难以识别使用明场显微镜。继续为B中所述的协议枯草芽孢杆菌 （按照步骤2.9 - 3.7） 年肺炎细胞可以生长在任30 ° C或37 ° C（他们在37 ° C生长较快）。
9。代表性的成果：
时间推移荧光实验已成功，如果细菌进入一个microcolony单层，这是完全坐落在实验结束的视野之内（见图5A - C）上升。如果细胞彼此顶部增长，不仅无法准确地追溯他们的历史，但也不能正确测量重叠细胞的荧光水平。细胞往往生长在彼此顶部，如果发现细胞没有足够的干（步骤2.9），或者如果需要进行调整，以获得经济增长放缓的培养基成分。如果microcolony增长的角度，然后殖民地内的荧光信号的分布不能确定。 “microcolony运动”的原因，可以发现细胞的不足，干燥（步骤2.9），或者如果没有编程软件在开发过程中跟踪microcolony。此外，重要的是，增加了荧光当地补丁不是在中期检测到隐藏的荧光信号来自细胞（见图5D - F）。背景相关的问题，可以从媒体的化合物，airbubbles或不溶琼脂糖团块出现。为了形象化这个，我们在图中显示。 5F的这个特定的幻灯片图像时使用红色荧光染料的激发/发射滤波器的背景信号。正如所看到的，明亮的autofluorescent点都存在可能妨碍成像。为了防止这样的点，确保琼脂糖完全溶解，放在显微镜载玻片盖玻片时，有没有airbubbles。
图1：实验概述
图2：在显微镜样品的制备
图3：定时B.荧光显微镜枯草芽孢杆菌细胞窝藏一个P kinB - GFP融合。快照取自电影1。热门面板：明亮的领域，底部面板：GFP的通道。
图图4：定时相衬显微镜的S.肺炎野生型菌株R6。快照取自电影2。
图5：（时移）显微镜成果的插图。交流显示获得的数据与透射光设置要考虑的因素，需要。 （ 一 ）明视显微镜sporulating B.一个microcolony单层（积极的成果） 枯草芽孢杆菌细胞（B）明场图像的一个B。枯草 microcolony彼此顶部增长，其中一些细胞（阴性结果）（ 三 ）明视形象的一个sporulating B.枯草 microcolony增长的重点领域（消极结果）。东风显示与episcopic灯光设置得到的数据，需要考虑的因素（四） 第一阶段B的对比图片枯草芽孢杆菌中描述的可视化，E和F的荧光信号来自（五）GFP D.注意，是在每一个像素（积极的成果）类似的背景信号中的细胞信号的指数阶段的细胞。另外请注意，曝光时间可能会太多，因为一个单元格中显示了一个饱和信号（负的结果）（F）的信号通过红色通道背景，包含增加红色荧光水平（地区注意在D所示的细胞获得负结果）。
电影1。延时B 的荧光显微镜枯草芽孢杆菌细胞窝藏一个P kinB - GFP融合。快照在8分钟的时间间隔。左：明场，右：绿色荧光蛋白通道。 点击这里观看电影。
电影2。定时相衬显微镜的S.肺炎野生型菌株R6。快照，在10分钟的间隔。点击这里观看影片 。
Discussion
在许多其他的单细胞技术相比，荧光显微镜方法，这里所描述的时间推移，可用于后续的一个关于它的祖先，其行为和分裂活动的具体细胞的历史。与荧光标记的目标发起人或蛋白质相结合，具体的发展途径的激活，可以跟在时间和蛋白定位以及可以在蛋白质动力学监测细菌的发展。
如上所述，专注于不同的细菌种类的研究可以进行适应的生长条件，根据一个特定的细菌的要求。我们遇到的唯一的限制是有关的生长条件和样本大小。由于密封的环境，介质条件不能改变在实验过程中。此外，每个实验的四个菌株最多可有效的监控。
考虑到几个关键步骤，单细胞分析方法这里描述可以很容易地适用于使用任何自动显微镜。在下面的，将给予这些关键步骤的概述。在正文详细信息，可以发现一般准备：检查一个特定的细菌实验前所需的自动对焦设置，这是明智的。同样，荧光可视化近似最优设置，应在事先确定，如果可能的话。此外，下面的一个准备的时间线将有助于所有材料准备使用时间（预热显微镜室，编程的显微镜设置，幻灯片前一小时准备细胞所需的生长阶段，看到图1） B 的生长枯草芽孢杆菌在TLM和清洁发展机制：TLM和清洁发展机制是化学定义饥饿媒体B.在其中枯草仅增长缓慢。根据特定菌株细胞生长在媒体的时间周期可能要延长。增长缓慢堆放对方阻止细胞在显微镜样品的制备 ：基因框架，载玻片和盖玻片之间的气泡要防止，防止琼脂糖介质的广泛干燥。这同样适用于中/盖玻片接口。至关重要的是让足够的干细胞，防止游泳和/或多个层生长时间推移荧光显微镜：幻灯片以及环境室预热，以防止重大的自动对焦问题是至关重要的。应选择在琼脂板的中间细胞，因为这些具有最高的机会，留在现场和重点在实验过程中（样品干燥不够好）。最多10％的实验地点仍然正常工作。后选择感兴趣的第一个单元格只使用该软件来调整焦距（详情请参阅文本）。检查细胞是否在重点仍然在第一时间在30分钟的间隔实验分析 ：重要的是扩展分析程序之前检查介质的背景是否有类似的价值观，在荧光渠道。小的尘埃粒子，中型组件，脏镜头或微小的琼脂糖团块可以有助于当地增加荧光，使电影很难或根本无法分析故障排除 ：如果细胞在彼此之上的增长，这既表明盖玻片附加太快或介质不适合microcolony单层增长。如果感兴趣的细胞不断过早死亡，而在幻灯片上的其他细胞分裂愉快，你可能要检查你是否把紫外线过滤器的位置。这也可能有助于减少曝光时间，或在长期实验的光照强度。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
在JWV组的工作是支持由欧盟玛丽居里重返社会奖学金，一个Sysmo2格兰特（NWO-ALW/ERASysBio），在豪华授予（ZonMW）由VENI奖学金（NWO - ALW）。 OPK组是由几个污水处理厂补助（NWO），SYSMO1（IGdeJ）SYSMO2批，英基EUROCORES SynBio授予（SynMod）Kluyver工业发酵的食品和营养的顶部研究所的基因组学中心的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Frame | ABgene Limited | AB-0578 | 1.7 x 2.8 cm |
| high-resolution low melting agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| big cover slip | Multiple Suppliers | 24 x 50 mm | |
| if desired, membrane dye, e.g. FM 5-95 | Invitrogen | T23360 | other membrane dyes are also available: http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf |
| Time-lapse microscope with environmental chamber | Multiple Suppliers | see details for our device in the corresponding sections |
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