लाइव सेल की इमेजिंग बेसिलस subtilis और स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया स्वचालित माइक्रोस्कोपी समय चूक का उपयोग

Summary

इस प्रोटोकॉल एक कदम दर कदम प्रक्रिया प्रदान करता है स्वचालित प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी समय चूक का उपयोग समय में विभिन्न जीवाणुओं की एकल कोशिका व्यवहार पर नजर रखने के. इसके अलावा, हम कैसे दिशानिर्देशों माइक्रोस्कोपी छवियों का विश्लेषण करने के लिए प्रदान करते हैं.

Abstract

पिछले कुछ वर्षों के दौरान वैज्ञानिकों तेजी से पता है कि औसत माइक्रोबियल आबादी के आधार पर प्रयोगों से प्राप्त आंकड़ों के व्यवहार, या एकल कक्षों की स्थिति phenotype के प्रतिनिधि नहीं हैं बन गया. इस नए अंतर्दृष्टि के कारण एकल कोशिका अध्ययन की संख्या लगातार बढ़ जाता है (हाल ही में की समीक्षा ^के लिए 1,2,3 देखते हैं ). हालांकि, एकल कोशिका तकनीक लागू के कई और समय में एक विशिष्ट एकल कक्ष (जैसे प्रवाह cytometry या मानक माइक्रोस्कोपी) के विकास के व्यवहार की निगरानी की अनुमति नहीं देते.

यहाँ, हम एक माइक्रोस्कोपी कई हाल ही में अध्ययन ^{4, 5, 6, 7,} जो निम्नलिखित और रिकॉर्डिंग (प्रतिदीप्ति) बेसिलस subtilis और विकास और कई पीढ़ियों के लिए प्रभाग के माध्यम से स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया के अलग - अलग बैक्टीरियल कोशिकाओं की अनुमति देता है में प्रयोग किया जाता विधि की एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं. परिणामस्वरूप फिल्में वापस एक जनसंख्या है कि एक आम पूर्वज से उत्पन्न भीतर किसी एकल कक्ष के इतिहास अनुरेखण द्वारा वंशावली वंश के पेड़ के निर्माण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी विधि न केवल करने के लिए व्यक्ति की कोशिकाओं के विकास, विभाजन, और भेदभाव की जांच करने के लिए, लेकिन यह भी विशिष्ट सेलुलर व्यवहार पर सेल के इतिहास और पूर्वजों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, समय चूक माइक्रोस्कोपी आदर्श बैक्टीरियल कोशिका चक्र के दौरान जीन अभिव्यक्ति गतिशीलता और प्रोटीन स्थानीयकरण की जांच करने के लिए अनुकूल है. विधि बताते हैं कि कैसे बैक्टीरियल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए और खुर्दबीन स्लाइड निर्माण microcolony में एकल कक्षों के परिणाम सक्षम है. संक्षेप में, एकल कक्षों विकास agarose जिस पर वे विकास और एक तापमान नियंत्रित पर्यावरण कक्ष के भीतर एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे विभाजित के साथ पूरक माध्यम से मिलकर एक अर्द्ध ठोस सतह पर देखा जाता है. छवियाँ विशिष्ट अंतराल पर कब्जा कर रहे हैं और बाद में खुला स्रोत सॉफ्टवेयर ImageJ विश्लेषण का उपयोग कर.

Protocol

1. बी की तैयारी subtilis संस्कृतियों

1. से टीका लगाना कोशिकाओं -80 डिग्री सेल्सियस के शेयरों को 10 मिलीलीटर माइक्रोस्कोपी समय चूक (TLM) मध्यम (62 मिमी _{कश्मीर 2} 4 HPO, _44mM 2 _{के.एच.} 4 पीओ, 15 _(NH 4) _{मिमी 2,} 4, 6.5 मिमी सोडियम साइट्रेट अतः, 0.8 मिमी में MgSO _4, 0.02% casamino एसिड, 27.8 मिमी ग्लूकोज, 0.1 मिमी एल tryptophan, पीएच 7 से स्थापित किया गया था एक KOH) एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक समाधान यदि आवश्यक हो, का उपयोग .
2. एक हिला फ्लास्क (30 डिग्री सेल्सियस, 225 rpm) में रातोंरात कोशिकाओं बड़े हो जाओ.
3. निम्नलिखित सुबह, पूर्व गर्म रासायनिक परिभाषित (सीडीएम) मध्यम (62 मिमी कश्मीर _{2 4} HPO, 44mM के.एच. ₂ पीओ _4, 15 मिमी (NH _{4) 2} अतः _4, 6.5 मिमी सोडियम साइट्रेट, 0.8 में 1:10 कोशिकाओं को कमजोर मिमी MgSO _4, 2.2mm ग्लूकोज, 2.1 मिमी एल glutamic एसिड, 6 सुक्ष्ममापी एल tryptophan, 7.5 ₂ MnCl, 0.15 x धातु मिश्रण (50x मीट्रिक टन मिश्रण ⁽⁸ रेफरी) शेयर जिसमें तैयार सुक्ष्ममापी: 0.2 एम ₂ MgCl, 70 मिमी CaCl _2, 5 मिमी ₂ MnCI, 0.1 मिमी ₂ ZnCl, 0.2 मिमी thiamin हाइड्रोक्लोराइड, 2 मिमी एचसीएल, 0.5 मिमी ₃ FeCl (पिछले जोड़)) एंटीबायोटिक दवाओं के बिना.
4. बी आगे बढ़ें मध्य घातीय चरण (30 डिग्री सेल्सियस, 225 rpm) subtilis कोशिकाओं. आमतौर पर, यह लगभग चार घंटे लगते हैं. महत्वपूर्ण बात, agarose स्लाइड से पहले एक घंटे तैयार कोशिकाओं मध्य घातीय चरण तक पहुँचने (खंड 2 देखें).
5. 600nm ₍₆₀₀₎ संस्कृति के absorbance के उपाय और एक अनुमानित ₆₀₀ .035 के सीडीएम का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं पतला. यह आयुध डिपो सुनिश्चित करता है कि उपयुक्त अंतराल के साथ एकल कक्षों समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए खुर्दबीन स्लाइड पर देखा जाता है.

2. खुर्दबीन नमूना तैयार करना (यह भी देखें चित्र 2)

एक घंटे से पहले कोशिकाओं मध्य घातीय वृद्धि तक पहुँचने, निम्नानुसार खुर्दबीन स्लाइड तैयार:

1. 70% इथेनॉल और पानी के साथ दो माइक्रोस्कोप कांच स्लाइड्स (जैसे Knittel ग्लास, 7.6 x 2.6 सेमी) साफ करें.
2. एक जीन फ्रेम (ABgene, 1.7 x 2.8 सेमी) ले लो और ध्यान जीन फ्रेम के दूसरे पक्ष पर प्लास्टिक कवर के disassembly के कारण के बिना एक जीन फ्रेम से प्लास्टिक foils के हटायें.
3. गिलास स्लाइड के सिर्फ एक तरफ पहला संपर्क की सुविधा के द्वारा, एक नाखून के साथ शेष जीन फ्रेम के निर्देशित लगाव द्वारा पीछा के बीच में जीन फ्रेम संलग्न. जबकि गिलास स्लाइड के लिए जीन फ्रेम संलग्न हवाई बुलबुले को रोकें.
4. एक माइक्रोवेव का उपयोग करने के लिए 150 मिलीग्राम (1.5%) उच्च संकल्प कम पिघलने 10 मिलीलीटर सीडीएम में agarose (सिग्मा) को भंग. agarose जरूरतों को पूरी तरह भंग किया जा करने के लिए कम से कम समय चूक माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए आवश्यक पृष्ठभूमि प्राप्त है. यदि आवश्यक हो, inducer या अन्य यौगिकों के साथ इस समय agarose-सीडीएम पूरक
5. जीन फ्रेम के बीच में गर्म agarose-सीडीएम के 500 μl स्थानांतरण. सुनिश्चित करें कि पूरे क्षेत्र सहित (सीमाओं) पूरी तरह से कवर किया जाता है.
   निम्नलिखित कदम (2.6 - 2.10) के लिए बाहर ले जाने जल्दी agarose सीडीएम के अत्यधिक सुखाने को रोकने के लिए है.
6. Agarose सीडीएम भरा जीन फ्रेम पर दूसरा गिलास स्लाइड प्लेस. हवाई बुलबुले से बचने की कोशिश करें. 4 में 45 मिनट के लिए एक क्षैतिज स्थिति में sandwiched स्लाइड्स प्लेस डिग्री सेल्सियस agarose सीडीएम पर्याप्त जमना की अनुमति रेफ्रिजरेटर में.
7. ध्यान से ऊपरी गिलास स्लाइड स्लाइड. एक धार का प्रयोग करने के लिए बाहर ~ जीन सीमा के भीतर 5 मिमी चौड़ाई, जिस पर कोशिकाओं हो जाएगा अगर स्ट्रिप्स में कटौती. अधिकतम तीन स्ट्रिप्स के एक स्लाइड प्रति इस्तेमाल किया जा सकता है, ~ 4 मिमी अंतरिक्ष द्वारा दोनों ओर से अलग है. इन रिक्त स्थान हवा जो बी के लिए आवश्यक है प्रदान करेगा subtilis विकास. यदि चार अलग अलग उपभेदों के लिए समय में पीछा किया जाना चाहिए, दो स्ट्रिप्स और बनाया जा सकता है आधे में कटौती के लिए चार छोटे वर्गों में परिणाम. किसी भी अवशिष्ट ठोस मध्यम निकालें.
8. ध्यान से जीन फ्रेम से दूसरे और अंतिम प्लास्टिक कवर को हटाने के लिए जीन फ्रेम के चिपचिपा पक्ष का पर्दाफाश
9. यह pipet टिप के साथ छू बिना ठोस मध्यम पर एकल कक्षों (1.5 कदम से) लोड. एक पूरी पट्टी, या एक छोटे वर्ग के लिए 1 μl के लिए 2.5 μl का प्रयोग करें. हमेशा agarose पैड के शीर्ष पर शुरू और तरल अपनी सौंपा विकास क्षेत्र पर समान रूप से स्लाइड मोड़ और नीचे से फैलाने के लिए अनुमति देते हैं. स्लाइड तैयार है, के रूप में जल्द ही के रूप में तरल के किनारों नालीदार और तरल के आंदोलन बन नहीं रह गया है दिखाई जब स्लाइड मोड़.
10. जीन एक पक्ष से दूसरे को फ्रेम (हवाई बुलबुले से बचने के लिए) पर एक स्वच्छ खुर्दबीन स्लाइड कवर पर्ची (24 x 50 मिमी) रखें. अपने नाखून के साथ जीन फ्रेम के साथ कवर पर्ची पर दबाव लागू करने के द्वारा पूरा लगाव आश्वासन. यदि कवर पर्ची उन्हें काफी लंबे समय से सूखे के लिए अनुमति के बिना कोशिकाओं पर रखा गया है, कोशिकाओं के प्रयोग के दौरान एक दूसरे के शीर्ष पर विकसित करते हैं. इसके अलावा करने के लिए इंतजार नहीं भी लंबे समय के कवर पर्ची लागू करने से पहले, के बाद से agarose फिर भी सूख जाएगा सावधान रहना.
11. पूर्व गर्म 30 में 1 घंटे के लिए स्लाइड डिग्री सेल्सियस यदि स्लाइड would सीधे पूर्व गर्म पर्यावरण कक्ष में रखा खुर्दबीन (3.1 कदम देखें) हो सकता है, तापमान के उतार चढ़ाव के प्रयोग के पहले घंटे में autofocus समस्याओं के कारण हो सकता है.

3. समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (भी चित्रा 3 और 1 मूवी देखने)

1. प्री - समय पर गर्म पर्यावरण कक्ष (हमारे हाथ में प्रयोग के शुरू होने से पहले कम से कम 2) के क्रम में प्रयोग शुरू करने के बाद autofocus समस्याओं को रोकने के. आवश्यक समय पर्यावरण हीटिंग सिस्टम और माइक्रोस्कोप के रूप में प्रयोग किया जाता के रूप में अच्छी तरह से कक्ष पर निर्भर करता है.
2. अपने प्रयोगात्मक सेट अप के अनुसार उपयुक्त उद्देश्य, फिल्टर और dichroic दर्पण का चयन करें. के लिए लंबे समय प्रयोगों को यकीन है कि है कि एक यूवी फिल्टर प्रकाश स्रोत और नमूने के बीच रखा गया है बनाते हैं. इसके अलावा, यदि संभव हो तो, उत्तेजना तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग कर के जोखिम को कम करने के लिए प्रकाश के कुछ ब्लॉक.

निम्नलिखित उपकरण (DeltaVision, ब्रिटेन द्वारा प्रदान) समय चूक माइक्रोस्कोपी डी जोंग एट अल में प्रकाशित प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया था ²⁰¹⁰ 5: IX71 माइक्रोस्कोप (ओलिंप), CoolSNAP HQ2 कैमरा (प्रिंसटन उपकरण), 300W क्सीनन प्रकाश स्रोत, 60x उज्ज्वल . क्षेत्र (1.25 एनए) उद्देश्य GFP (Chroma, 470/40 एनएम पर उत्तेजना, उत्सर्जन 525/50 एनएम) filterset, mCherry filterset (Chroma, 572/35 एनएम पर उत्तेजना, उत्सर्जन 632/60 एनएम). Autofocus diascopic प्रकाश के उपयोग और Deltavision Softworx सॉफ्टवेयर में autofocus दिनचर्या वर्तमान का उपयोग किया था. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वहाँ अब अन्य autofocus प्रणाली है कि यह भी Zeiss निश्चित फोकस, Nikon है बिल्कुल सही फोकस सिस्टम और Leica अनुकूली फोकस नियंत्रण जैसे उपयुक्त एक नंबर रहे हैं.

3. अपने प्रयोगात्मक सेट अप के अनुसार अपने प्रयोग कार्यक्रम. अन्य समय चूक सूक्ष्मदर्शी या बैक्टीरिया के वास्तविक प्रयोग करने के लिए पहले के लिए प्रकाश की मात्रा को विशिष्ट constructs के लिए आवश्यक, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से autofocus सेटिंग्स निर्धारित करने के लिए बुद्धिमान है. छोटा जोखिम बार और उत्तेजना प्रकाश की कम राशि विरंजन और phototoxicity कम कर देंगे. Autofocus दिनचर्या के लिए diascopic प्रकाश का प्रयोग करें.

समय चूक माइक्रोस्कोपी डी जोंग एट अल में प्रकाशित प्रयोगों के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का इस्तेमाल ^किया गया 5 2010: फिल्मों के लिए फोटो 8 या 12 मिनट का उपयोग कर 10% APLLC व्हाइट के अंतराल पर ले जाया गया एलईडी उज्ज्वल क्षेत्र चित्रों के लिए प्रकाश और 0.05 एस जोखिम 10% क्सीनन प्रकाश और GFP का पता लगाने, और 32% क्सीनन प्रकाश और mCherry का पता लगाने, क्रमशः के लिए 0.8 एस जोखिम के लिए 0.5 एस जोखिम. 3.6.0 softWoRx (एप्लाइड Presicion) का उपयोग कच्चे डेटा संग्रहीत किया गया. autofocus के 0.06 सुक्ष्ममापी कदम और 1.2 सुक्ष्ममापी की कुल सीमा के लिए क्रमादेशित था.

4. माइक्रोस्कोप के पूर्व गर्म पर्यावरण कक्ष में तैयार स्लाइड (खंड 2) प्लेस और एक microcolony monolayer में एकल कक्षों के 30 ° सी. परिणाम की निगरानी

विशिष्ट युक्तियाँ:

• एकल कक्षों है कि अगर पैड के बीच में स्थित हैं का चयन करें. अगर के किनारों और अधिक आसानी से सूखी पैड. एक्स, वाई, जेड स्थिति माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर का उपयोग कर स्टोर.
• एक्स, वाई और Z दिशा में मंच के बड़े आंदोलनों agarose उपद्रव और फलस्वरूप autofocus दिनचर्या द्वारा कोशिकाओं की पहचान प्रभावित हो सकता है. सामान्य में, एक्स, वाई, जेड आंदोलन कम से कम करने के लिए, हम प्रयोग के अनुसार 10 से अधिक पदों का चयन न करें भले ही एक स्लाइड के कई उपभेदों हैं.
• प्रथम कक्ष का चयन करने के बाद, केवल सॉफ्टवेयर के साथ Z फोकस समायोजित. इस बिंदु से, खुर्दबीन "Z - घुंडी" जब तक इस डिजिटल encoded है शरीर का उपयोग पर ध्यान केंद्रित मैन्युअल रूप से बदल नहीं करते. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक autofocus दिनचर्या के बाद नई एक्स, वाई, जेड स्थिति सॉफ्टवेयर के द्वारा संग्रहीत किया जाता है.
• जाँचें कि क्या autofocus सेटिंग चलाने के लिए शुरू करने से पहले प्रयोग के लिए उपयुक्त हैं,. चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग autofocus brightfield या डीआईसी माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए तुलना दिनचर्या, बढ़ाया विपरीत कारण सुधार कर सकते हैं. हालांकि, चरण विपरीत उद्देश्यों में चरण की अंगूठी प्रकाश प्रतिदीप्ति इकट्ठा करने में उन्हें कम संवेदनशील (लगभग 10%) बनाता है. तो कमजोर फ्लोरोसेंट नमूने के लिए, चरण की अंगूठी के बिना एक उद्देश्य बेहतर अनुकूल है.
• जाँचें कि चयनित कक्षों में हर आधे घंटे पर ध्यान केंद्रित करने में अभी भी कर रहे हैं, जब तक प्रयोग चल रहा stably है. जब इस बिंदु पर कोशिकाओं ध्यान से बाहर हैं, मैन्युअल रूप से समायोजित करें. तापमान भिन्नरूपों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से खराब सूखे नमूने के कारण, इस पहले घंटे के दौरान आवश्यक हो सकता है. इसके अलावा, बढ़ाया विपरीत कारण, autofocus के बेहतर काम करता है जब और अधिक कोशिकाओं को देखने के क्षेत्र में हैं.

5. प्रयोग के बाद समाप्त हो गया है, अलग फिल्म है और उन्हें अलग - अलग फ़ाइलों के रूप में सुरक्षित के विभिन्न चैनलों (यानी चरण के विपरीत, GFP, mCherry) यदि आवश्यक (कुछ अधिग्रहण संकुल एक एकल फ़ाइल में खड़ी सभी चैनलों जगह होगी). प्रकाशन के लिए, चित्र 2D deconvolution, जो विशेष रूप से हमें है द्वारा बढ़ाया जा सकता है हैप्रोटीन स्थानीयकरण अध्ययन के लिए eful. अपने खुर्दबीन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों Deconvolve या Huygens (जैसे एक वाणिज्यिक पैकेज के साथ www.svi.nl).
6. (ImageJ का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण http://rsbweb.nih.gov/ij/) (इस के लिए, कच्चे unprocessed छवि फ़ाइलों का उपयोग) और Microsoft Excel या सिग्मा प्लॉट. ढेर उदाहरण के लिए एक "avi." ImageJ में चलचित्र फ़ाइल के रूप में सहेजा जा सकता है. प्रतिदीप्ति कैसे एकल कक्षों के समय में मापा जा सकता है है की एक विस्तृत वर्णन नीचे दिया गया है.

4. प्रमोटर गतिविधि गतिशीलता के डेटा विश्लेषण ImageJ का उपयोग

हम ध्यान दें कि अन्य अच्छा सॉफ्टवेयर संकुल उपलब्ध हैं जो BHV ^{सॉफ्टवेयर 9, 4,} 10 ^Schnitzcell, 11 PSICIC, और सूक्ष्म जीव - ^{ट्रैकर 12,} के रूप में समय चूक माइक्रोस्कोपी छवियों का विश्लेषण करने में विशेष कर रहे हैं, लेकिन यहाँ हम स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ImageJ पैकेज पर ध्यान केंद्रित है.

1. डाउनलोड करें (ImageJ http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) और (यदि आवश्यक) सही करने के लिए अपने फ़ाइल (खड़ी) खोलने प्लगइन. उदाहरण के लिए, फिल्में deltavision माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज ImageJ में deltavision सलामी बल्लेबाज प्लगइन के साथ खोला जा सकता है. DV-प्लगइन ImageJ प्लगइन फ़ोल्डर में प्रतिलिपि बनाएँ और कार्यक्रम शुरू. / विकल्प / 1250 स्मृति धागे को संपादित में स्मृति क्षमता बदलें. इस समय चूक फिल्मों से प्राप्त उन लोगों के रूप में बड़ी फ़ाइलों के साथ काम करने की अनुमति देता है.
2. एक एकल कोशिका के सेल के इतिहास का मूल्यांकन करने के लिए, एक microcolony और फिल्म में रुचि के अंतिम फ्रेम के लिए स्क्रॉल के मूल चरण विपरीत फिल्म खुला. "खंडों लाइनों" चयन मेनू में बटन का चयन करें.
3. पृष्ठभूमि में एक लाइन ड्रा और प्रेस "Ctrl" + "टी". यह हित प्रबंधक (आरओआई) के क्षेत्रों खुल जाएगा. (इसी पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मूल्य मैन्युअल पृष्ठभूमि घटाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - नीचे देखें वैकल्पिक रूप से, ImageJ भीतर पृष्ठभूमि घटाव दिनचर्या वर्तमान का उपयोग करें) इसके अलावा ब्याज की सेल में एक पंक्ति आकर्षित और आरओआई प्रबंधक को आरओआई जोड़ने. के बाद से हम इस मामले का अध्ययन में प्रमोटर - GFP fusions जांच कर रहे हैं और GFP cytoplasm भर में फैला हुआ है, पूरे सेल सेल की लंबाई भर में प्रत्येक एकल पिक्सेल के लिए इसी तरह प्रतिदीप्ति मूल्यों चाहिए. एक फ्रेम समय में वापस स्क्रॉल करें और ब्याज की एक ही सेल में एक नया रॉय का चयन करें. इस तीसरे रॉय सहेजें और प्रक्रिया के साथ जारी है जब तक फिल्म का पहला फ्रेम में इसी रॉय सहेज लिया गया है.
   पता है कि बेटी कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति बहुत कोशिका विभाजन के बाद भिन्न हो सकते हैं. या तो एक झिल्ली डाई जो प्रतिदीप्ति कोशिकाओं (जैसे लाल झिल्ली ^डाई ® एफएम 5-95 (Invitrogen) और GFP के संयोजन के रूप) द्वारा उत्पादित पट गठन कल्पना प्रोटीन के साथ एक साथ लागू किया जा सकता का उपयोग करें. इस मामले में इसी प्रतिदीप्ति चैनल और चरण विपरीत फिल्म नहीं समय में कोशिकाओं का पालन किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, एक सुरक्षित पक्ष पर किसी कक्ष का केवल एक आधा में आरओआई है का चयन करके रह सकते हैं.
4. आरओआई प्रबंधक के भीतर, क्लिक करें "सहेजें". यदि फ़ाइल का अंत "ROI" है, तो एक ROI सूची में चयनित है, और केवल इस एक को बचाया जाएगा. यदि फ़ाइल का अंत "ज़िप" है, तो पूरे सेट () की आवश्यकता बचाया जाएगा.
5. चरण विपरीत फिल्म बंद करें और मूल प्रतिदीप्ति फिल्म (जैसे GFP) खुला. क्लिक करें और "सभी शो" आरओआई प्रबंधक में "उपाय". एक नई विंडो परिणाम () खुल जाएगा. एक एक्सेल शीट में परिणाम कॉपी और मध्यम की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से प्रत्येक एकल कक्ष के लिए मतलब प्रतिदीप्ति घटाना. परिणामस्वरूप शुद्ध प्रतिदीप्ति समय में ब्याज की कोशिका के प्रमोटर गतिविधि प्रकट करने के लिए समय के खिलाफ प्लॉट किया जा सकता है है.
6. वैकल्पिक रूप से, microcolony की सभी कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति एक विशिष्ट समय बिंदु पर विश्लेषण किया जा सकता है. आदेश में करने के लिए इस चयन करें और आरओआई पृष्ठभूमि और हर एक कोशिका के लिए एक फ्रेम में ऊपर वर्णित के रूप में बचा, प्रतिदीप्ति मानों की प्रतिलिपि Excel में और "उपकरण" मेनू में "हिस्टोग्राम" समारोह का उपयोग histograms का उत्पादन.
7. प्रकाशन के लिए एकल फ्रेम से चित्रों को प्राप्त करने के लिए, ब्याज की फ्रेम का चयन करें, "छवि" का चयन करें - "डुप्लिकेट छवि" और "आरजीबी" या "छवि" का चयन करके "8 बिट" छवि के प्रकार बदलना - "प्रकार" "रंग आरजीबी" या "8 बिट". सहेजें के रूप में "झगड़ा." दोहराया फ्रेम. RGB/8-bit चित्र CorelDraw या Adobe Illustrator के रूप में पारंपरिक ड्राइंग प्रोग्राम द्वारा खोला जा सकता है है. ImageJ में "खिड़की / स्तर" - "समायोजित" - "चमक / विपरीत" या "छवि" - "समायोजित" यदि आवश्यक हो, चित्र "छवि" का उपयोग कर अनुकूलित किया जा सकता है.

5. ImageJ के साथ प्रकाशन के लिए फिल्में निर्माण

1. मूल चरण विपरीत और ImageJ में इसी प्रतिदीप्ति फिल्म (ओं) के रूप में ऊपर वर्णित खोलें. आयताकार चयन बटन का चयन करें (बाईं ^ओर एक सेंट) और इस तरह पहली फ्रेम में एक आयत आरओआई आकर्षित करने के लिए, कि विकासशील microcolony आरओआई throu से घिरा हैपूरी फिल्म ghout. "फसल" और सुरक्षित एक नए नाम के तहत फिल्म के इस छोटे संस्करण - "छवि" का चयन करें. प्रतिदीप्ति फिल्म में आरओआई प्रबंधक के माध्यम से एक ही आरओआई का चयन करें और के रूप में पहले आगे बढ़ना.
2. या तो क्षैतिज या खड़ी फिल्में गठबंधन करने के लिए, "प्लगइन" का चयन करें - "ढेर combiner". अगर वांछित है, एक समय Stamper "प्लगइन" के माध्यम से जोड़ा जा सकता है - "समय Stamper". संयुक्त ढेर एक बार के रूप में "डीवी." या "झगड़ा" और एक बार के रूप में सहेजें "avi." या QuickTime चलचित्र.

स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया के लिए वैकल्पिक प्रोटोकॉल रूपांतरों (4 चित्रा और मूवी 2) :

6. एस की तैयारी निमोनिया संस्कृतियों

1. एस आगे बढ़ें निमोनिया कोशिकाओं (D39 ¹³ तनाव, या unencapsulated R6 37 में ¹⁴ तनाव सी + वाई ¹⁵ मध्यम में खड़े संस्कृतियों के रूप में capsulated ° सी जब तक लगभग 0.4 _की एक 600nm एक आयुध डिपो पर पहुंच गया. 14000 rpm पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और resuspend सेल ताजा सी + Y 14.5% (v / v) ग्लिसरॉल है है कि वास्तव में 0.4 _की एक 600nm एक में परिणाम होगा युक्त मध्यम कोशिकाओं विभाज्य और उन्हें -80 पर डिग्री सेल्सियस भविष्य के उपयोग के लिए दुकान का एक मात्रा में गोली.
2. समय चूक माइक्रोस्कोपी के लिए, पहले सुसंस्कृत एस के एक विभाज्य ले निमोनिया कोशिकाओं. 4 मिलीलीटर टीका लगाना ताजा सी + -80 ° सी विभाज्य से कोशिकाओं के साथ वाई 1:100 मध्यम. 0,2 - 0,1 के एक _600nm के एक आयुध डिपो मध्य घातीय चरण तक कोशिकाओं को विकसित. आमतौर पर, इस बारे में 2 घंटे लगते हैं जब -80 ° सी aliquots से कोशिकाओं का उपयोग.

7. खुर्दबीन नमूना तैयार

1. एक खुर्दबीन स्लाइड तैयार के रूप में बी के लिए ऊपर वर्णित subtilis लेकिन यकीन है कि agarose जटिल सी + Y मध्यम होता है. एस के बाद से निमोनिया एक microaerophile है, agarose स्ट्रिप्स के बीच हवा जेब बी के लिए की तुलना में छोटा होना चाहिए subtilis (~ 1 मिमी दोनों पक्षों पर अंतरिक्ष).
2. 600 एनएम ₍₆₀₀ ए) में संस्कृति के absorbance के उपाय करने के _लिए, एक अनुमानित 600 .05 के सी + वाई माध्यम का उपयोग तेजी से बढ़ एस निमोनिया कोशिकाओं को कमजोर और इस कमजोर पड़ने का उपयोग करने के लिए agarose स्लाइड लोड.

8. समय चूक चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी

एस के लिए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स समायोजित करें निमोनिया: एस के बाद से उपयोग चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी निमोनिया उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग की पहचान करने के लिए मुश्किल है. प्रोटोकॉल जारी रखें के रूप में बी के लिए वर्णित subtilis (2.9 चरणों का पालन करें - 3.7) एस. निमोनिया कोशिकाओं में उगाया जा सकता है है 30 या तो डिग्री सेल्सियस या 37 डिग्री सेल्सियस (वे 37 सी सेंटीग्रेड पर तेजी से बढ़ने) .

9. प्रतिनिधि परिणाम:

प्रतिदीप्ति समय चूक प्रयोग किया गया है सफलतापूर्वक किया है, अगर बैक्टीरिया microcolony monolayer, जो पूरी तरह से प्रयोग के अंत में देखने के क्षेत्र के भीतर स्थित है (5A - सी चित्रा देखें) में वृद्धि हुई है. यदि कोशिकाओं को एक दूसरे के शीर्ष पर बढ़ी है, यह न केवल असंभव है सही वापस अपने इतिहास का पता लगाने, लेकिन यह भी अतिव्यापी कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति स्तर को सही ढंग से मापा नहीं जा सकता. कक्ष के लिए एक दूसरे के शीर्ष पर विकसित करते हैं, अगर देखा कोशिकाओं पर्याप्त नहीं सूख (2.9 कदम) थे या अगर मध्यम संरचना करने के लिए धीमी वृद्धि प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा जरूरत है. यदि एक microcolony देखने के बाहर हो गया है, तो एक कॉलोनी के भीतर प्रतिदीप्ति संकेतों के वितरण निर्धारित किया जा नहीं कर सकते. "Microcolony आंदोलन" के लिए कारण देखा कोशिकाओं की अपर्याप्त सुखाने (2.9 कदम) हो सकता है सकते हैं, या अगर सॉफ्टवेयर के विकास के दौरान microcolony ट्रैक नहीं क्रमादेशित था. इसके अलावा, यह महत्वपूर्ण है कि वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति के स्थानीय पैच माध्यम में detectable नहीं कर रहे हैं के रूप में इस प्रतिदीप्ति कोशिकाओं (5D-एफ देखें चित्र) से आने के संकेतों obscures है. पृष्ठभूमि से संबंधित समस्याओं मीडिया यौगिकों, airbubbles या undissolved agarose clumps से उत्पन्न कर सकते हैं. यह कल्पना करने के लिए, हम चित्र में दिखा. 5F जब छवि लाल फ्लोरोसेंट रंजक के लिए उत्तेजना / उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर लिया गया था इस विशिष्ट स्लाइड की पृष्ठभूमि का संकेत है. के रूप में देखा है, उज्ज्वल autofluorescent धब्बे मौजूद है जो इमेजिंग में बाधा सकता है. इस तरह के धब्बे को रोकने के लिए, सुनिश्चित करें agarose पूरी तरह भंग कर रहा है और वहाँ कोई airbubbles नहीं हैं जब खुर्दबीन स्लाइड पर coverslip रखने.

चित्रा 1: प्रायोगिक सिंहावलोकन

चित्रा 2: खुर्दबीन नमूना तैयार

चित्रा 3: समय चूक बी के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी subtilis एक पी GFP-संलयन _kinB शरण कोशिकाओं. स्नैपशॉट्स एक मूवी से लिया जाता है. शीर्ष पैनल उज्ज्वल क्षेत्र, नीचे पैनल:: GFP चैनल.

अंजीरure 4: समय चूक एस के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी निमोनिया जंगली प्रकार तनाव R6. स्नैपशॉट्स मूवी 2 से लिया हैं.

चित्रा 5: संभव (समय चूक) माइक्रोस्कोपी परिणामों के चित्रण. एसी कारक है कि diascopic प्रकाश सेटिंग्स के साथ प्राप्त डेटा के लिए विचार किया जाना चाहिए पता चलता है. (ए) एक microcolony monolayer के brightfield बी sporulating का (सकारात्मक परिणाम) माइक्रोग्राफ subtilis कोशिकाओं (बी) एक बी की brightfield छवि microcolony subtilis में जो कुछ कोशिकाओं एक दूसरे के शीर्ष पर बढ़ी (नकारात्मक परिणाम) (सी) एक sporulating बी के brightfield छवि subtilis microcolony कि ध्यान के क्षेत्र (नकारात्मक परिणाम) के बाहर हुआ. लोमो शो कारक है कि episcopic प्रकाश सेटिंग्स के साथ प्राप्त डेटा के लिए विचार किया जाना चाहिए (डी) बी के पहले चरण के विपरीत चित्र घातीय कल्पना करने के लिए जहां ई और एफ में प्रतिदीप्ति संकेतों (ई) डी. नोट कि पृष्ठभूमि संकेतों प्रत्येक पिक्सेल (सकारात्मक परिणाम) में समान हैं में दिखाया गया है कोशिकाओं के GFP संकेतों से उत्पन्न दर्शाया चरण में subtilis कोशिकाओं. यह भी ध्यान रखें कि समय जोखिम बहुत ज्यादा होने के बाद से एक कक्ष एक संतृप्त संकेत सिग्नल (नकारात्मक परिणाम) (एफ) डी. नोट में दिखाया गया है कोशिकाओं की लाल चैनल है कि पृष्ठभूमि वृद्धि हुई लाल प्रतिदीप्ति (स्तर के साथ क्षेत्रों के माध्यम से प्राप्त से पता चलता है हो सकता है नकारात्मक परिणाम).

मूवी 1. समय चूक बी के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी subtilis एक पी GFP-संलयन _kinB शरण कोशिकाओं. स्नैपशॉट्स 8 मिनट के अंतराल में ले जाया गया. वाम: उज्ज्वल क्षेत्र, अधिकार: GFP चैनल फिल्म देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

मूवी 2. समय चूक एस के चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी निमोनिया जंगली प्रकार तनाव R6. स्नैपशॉट्स 10 मिनट के अंतराल में ले जाया गया. लिए यहाँ क्लिक करें फिल्म देखने.

Discussion

कई अन्य एकल कक्ष तकनीकों के विपरीत, समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी यहाँ वर्णित विधि के अपने पूर्वजों, अपने व्यवहार, और विभाजन की घटनाओं के संबंध में एक विशेष सेल के इतिहास का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Fluorescently लेबल लक्ष्य प्रमोटरों या प्रोटीन के साथ संयोजन में विशिष्ट विकास मार्ग सक्रियण समय और प्रोटीन के रूप में अच्छी तरह के रूप में स्थानीयकरण प्रोटीन गतिशीलता बैक्टीरियल विकास के दौरान निगरानी किया जा सकता है है में पीछा किया जा सकता है.

जैसा कि ऊपर संकेत, अलग बैक्टीरियल प्रजातियों पर ध्यान केंद्रित अध्ययन एक विशिष्ट जीवाणु के लिए आवश्यकताओं के अनुसार विकास की स्थिति के अनुकूल किया जा सकता है. केवल सीमाओं हम का सामना करना पड़ा विकास की स्थिति और नमूना आकार से संबंधित हैं. एक मोहरबंद वातावरण के कारण, मध्यम शर्तों प्रयोग के दौरान नहीं किया जा बदला जा सकता है. इसके अलावा, प्रति चार उपभेदों प्रयोग में अधिकतम कुशलता से नजर रखी जा सकती है.

कुछ महत्वपूर्ण कदम को ध्यान में रखते हुए, एकल कक्ष विश्लेषण विधि यहाँ वर्णित आसानी से किसी भी स्वचालित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लागू किया जा सकता है. बाद में, इन महत्वपूर्ण कदम के एक सिंहावलोकन दिया जाएगा. विस्तृत जानकारी मुख्य पाठ में पाया जा सकता है सामान्य तैयारी: यह autofocus के प्रयोग करने के लिए पहले एक विशिष्ट जीवाणु के लिए आवश्यक सेटिंग्स की जाँच करने के लिए बुद्धिमान है. इसी तरह, प्रतिदीप्ति के दृश्य के लिए लगभग इष्टतम सेटिंग्स अग्रिम में निर्धारित किया जाना चाहिए, यदि संभव हो तो. इसके अलावा, तैयार समय लाइन का पालन करने के लिए सभी समय में उपयोग करने के लिए तैयार सामग्री (पूर्व वार्मिंग खुर्दबीन कक्ष खुर्दबीन सेटिंग प्रोग्रामिंग, स्लाइड एक घंटे की तैयारी पहले कोशिकाओं को वांछित विकास के चरण में हैं, चित्रा 1) में मदद करता है है बी के विकास. TLM और सीडीएम में subtilis: TLM और सीडीएम रासायनिक भुखमरी मीडिया में परिभाषित कर रहे हैं जिसमें बी. subtilis केवल धीरे धीरे बढ़ता है . समय अवधि में जो कोशिकाओं को मीडिया में बड़े हो रहे हैं विशिष्ट तनाव के आधार पर लंबे समय तक किया जा सकता है. धीमा विकास एक दूसरे पर जमा से कोशिकाओं खुर्दबीन नमूना तैयार रोकता है: जीन फ्रेम, गिलास स्लाइड और कवर पर्ची के बीच वायु बुलबुले agarose आधारित माध्यम के व्यापक सुखाने को रोकने के लिए रोका जा. वही पर्ची / मध्यम कवर इंटरफ़ेस के लिए रखती है. चलो कोशिकाओं को पर्याप्त सूखे, तैराकी और / या एकाधिक परत वृद्धि को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है, समय चूक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में अच्छी तरह के रूप में पर्यावरण चैम्बर स्लाइड के पूर्व वार्मिंग प्रमुख autofocus समस्याओं को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है. अगर पैड के बीच में कक्ष चयनित किया जाना चाहिए, क्योंकि इन उच्चतम प्रयोग (बशर्ते नमूना काफी अच्छी तरह से सूख गया था) के दौरान क्षेत्र और ध्यान केंद्रित में रहने का मौका है. प्रयोगों प्रति 10 स्थानों की एक अधिकतम अभी भी ठीक से काम करता है. होने चयनित करने के बाद ब्याज की पहली सेल केवल सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए ध्यान केंद्रित समायोजित (विवरण के लिए पाठ देखें). जाँचें कि क्या कोशिकाओं को ध्यान में अभी भी 30 मिनट के अंतराल में प्रयोग के विश्लेषण के पहले घंटे के दौरान कर रहे हैं: यह महत्वपूर्ण है पहले विस्तारित विश्लेषण प्रक्रियाओं के लिए जाँच करें कि क्या माध्यम की पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति चैनल में इसी तरह मान है. लघु धूल कणों, मध्यम घटकों, गंदे लेंस या छोटे clumps agarose स्थानीय रूप से वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति योगदान, फिल्म मुश्किल या असंभव के लिए मुसीबत शूटिंग का विश्लेषण कर सकते हैं: यदि कोशिकाओं को एक दूसरे के शीर्ष पर हो जाना, यह भी संकेत मिलता है कि coverslip था हो सकता है. भी जल्द ही है कि मध्यम microcolony monolayers के विकास के लिए अनुकूल नहीं है संलग्न. यदि ब्याज की कोशिकाओं को लगातार समय से पहले मर जाते हैं, जबकि स्लाइड पर अन्य कक्षों को खुशी से विभाजित करने के लिए, आप के लिए जाँच करें कि क्या आप स्थिति में यूवी फिल्टर डाल करना चाहते हो सकता है. यह भी जोखिम या लंबे समय के प्रयोगों के दौरान प्रकाश की तीव्रता के समय कम मदद कर सकता है.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gene Frame	ABgene Limited	AB-0578	1.7 x 2.8 cm
high-resolution low melting agarose	Sigma-Aldrich	A4718
big cover slip	Multiple Suppliers		24 x 50 mm
if desired, membrane dye, e.g. FM 5-95	Invitrogen	T23360	other membrane dyes are also available: http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp34653.pdf
Time-lapse microscope with environmental chamber	Multiple Suppliers		see details for our device in the corresponding sections