Summary
描述一个立体的克隆形成实验，让胰祖细胞分化为胰岛素表达殖民地。此方法采用半固体甲基纤维素，基质胶和生长因子的媒体的优势，其中单祖细胞增殖和分化
Abstract
在体外的功能和定量分析，单细胞分析的缺乏已经阻碍了胰腺干细胞和祖细胞生物学领域。单祖细胞的分析是至关重要的，因为它们提供了明确的方式，明确地显示个别祖先的血统潜力。虽然已制定产生“pancreatospheres”从单细胞悬浮培养方法，存在一些局限性。首先，这是费时，执行单细胞的细胞大量沉积，其中大量的文化传媒和空间，反过来命令。二，造成pancreatospheres编号是劳动密集，尤其是当频率低pancreatosphere发起祖。第三，pancreatosphere检测是不是一种有效的方法，以使两个相同的文化胰腺祖细胞的增殖和分化以及，重新stricting检测的实用性。
为了克服这些限制，一个半固体培养基胰腺祖细胞的殖民地检测已开发和在本报告中提出。这种方法需要从现有的造血细胞集落检测，其中甲基纤维素是用来向媒体提供的粘度概念优势，使祖细胞在三维空间中停留，因为他们进行增殖以及分化。为了丰富胰岛素表达细胞集落形成祖从一个异构的人口，我们可以利用细胞表达神经元素（NGN）3，胰腺内分泌祖细胞标记。小鼠胚胎干细胞（ES）细胞衍生Ngn3表达细胞与增强型绿色荧光蛋白记者标签，排序和多达25,000个细胞被镀成低附件24的培养皿。满足每口井包含以下主要组件的半固体培养基500μL：hylcellulose，基质胶，烟酰胺，exendin - 4，激活素βB，空调媒体收集的小鼠胚胎干细胞源性的胰腺细胞样细胞。经过8至12天的文化，胰岛素表达菌落形态具有鲜明的形成，可以进一步使用定量RT - PCR和immunoflourescent染色，以确定每个殖民地的宗族组成的胰腺癌基因表达分析。
总之，我们的殖民地检测可以方便地检测和内细胞的异质人口的功能祖细胞定量。此外，半固态的媒体格式允许对细胞的细胞外基质成分和生长因子的统一演示，使祖细胞增殖和分化体外。这个殖民地检测胰腺祖细胞在单细胞水平的机理研究提供了独特的机会。
Protocol
1。胰腺细胞样细胞在体外的小鼠ES细胞分化生成的殖民地检测条件培养基（CM ）
小鼠胚胎干细胞的维护程序，胚体（EB）的悬浮培养和附件文化的形成，为进一步分化已先前所描述的1-3和本报告的重点。图1显示了一个在我们的分化协议所涉及的步骤示意图介绍。
为了获得高品质的空调媒体，重要的是首先产生6日龄胚，其中至少有30-40％的直径至少150微米。更大的分化应该包含在光学显微镜下的暗斑，表明增强分化（图2）。选择高品质的小牛血清（FCS）是至关重要的生成等胚。高品质的FCS地段的选择是基于自己的能力，以支持differentiatEBS的离子对胰岛素，胰高血糖素和淀粉酶2A基因表达的后期阶段（18-20天），由RT - PCR分析检测。此外，当一天6胚悬浮培养附件文化（约80 - 100胚在6孔板，每孔），重要的是，轻轻地旋转板收集到的井中心6日胚。对于原因不明，纵横捭阖，加强细胞与细胞接触EBS胰样细胞，在随后的附件文化阶段更好地发展的结果。
- 在培养第13天，取代新鲜附件文化的依恋文化传媒（DMEM/F-12（1:1），15％的血清替代淘汰赛，2毫米L -谷氨酰胺，50 U / mL青霉素，50μg/ mL链霉素）媒体containing10 MM烟酰胺，0.1纳米exendin - 4，和10毫微克/毫升的重组人激活素SSB（最终浓度）。
- 在培养第16天，收集从步骤1.1媒体和过滤0.2微米聚醚ulfone膜。从这点出发，将收集媒体称为条件培养基（CM）。分装成15毫升猎鹰管的CM，并存放于-80 ° C直到前半固体培养（见下文第3节）。
2。获得胰祖细胞在单细胞悬液，使用荧光激活细胞分选
一阵敲门声在小鼠胚胎干细胞系，4个指定为Ngn3 - EGFP，EGFP报告基因取代一个Ngn3位点的等位基因是以前2 Ngn3是一个基本的螺旋-环-螺旋（BHLH）含有转录因子分化表示5天16文化发展过程中胰腺内分泌祖通常排序，获得差异Ngn3 - EGFP +和Ngn3 - EGFP -细胞1,2
- 分化的细胞分解成单细胞悬液。
- 孵育16天，文化的Wi第0.25％胰蛋白酶- EDTA（3分钟，37℃）逐出文化井的细胞。
- 添加10％FCS停止胰蛋白酶的活性。
- 用镁和钙的细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）含有0.1％的牛血清白蛋白（BSA）和离心5分钟在300 XG。
- 去除上清液，4 mg / mL胶原酶B和2000 U / mL的脱氧核糖核酸（DNA酶）我（30分钟，37℃）培养的细胞团块，以生产单细胞悬液。使用1000μL移液器破坏细胞颗粒每10分钟，以加快解离过程。
- 洗涤细胞，用PBS含0.1％BSA和300 XG离心5分钟。
- 去除上清液和含0.1％BSA的PBS重悬细胞。
- 制备细胞进行排序。
- 每毫升细胞悬液，以防止在排序细胞reaggregation添加2μLDNA酶我（1亩/毫升）。
- 通过一个40至70微米米的单细胞悬液ESH除去大细胞聚集。
- 添加的DAPI（1μg/ mL的终浓度）的单细胞悬液。
- 在细胞分选获得的流式细胞仪检测数据。一个MoFlo MLS（Beckman Coulter公司）细胞分选，用于本报告。
- 浇注的细胞群进行排序。 Ngn3 - EGFP +和Ngn3 - EGFP -细胞门控前向散射对侧向散射（图3A），其次的DAPI与侧散射（图3B），脉冲宽度与侧散射（图3C），最后FL1与自体荧光（图3D）。最终排序门Ngn3 - EGFP +细胞是故意转移到右侧（图3E;箭头），以限制污染Ngn3 - EGFP -细胞在排序。对于阴性对照闸，无论是每天6 Ngn3 - EGFP胚胎干线或相同的阶段，每天16文化，从非转基因株系，如TL1 ES细胞（图3D，左侧面板），可用于EBS。
- 排序Ngn3 - EGFP +和Ngn3 - EGFP
3。电镀排序细胞半固体培养
- 基质胶的准备。
- 在基质胶分装至1 mL，每管使用前在-20 ° C存储。
- 冷冻分装应置于4 ° C过夜或冰刚刚解冻，使用前3个小时。解冻分装必须保持在半固态的文化准备，以避免resolidification冰。
- 甲基纤维素溶液（3.3％）的准备。
甲基纤维素粉末不能高压灭菌。为了获得细菌甲基解决方案在编制过程中，使用清洁的称量船和蒸压搅拌棒，烧杯，烧瓶和其他硬件。- 前一天的甲基纤维素溶液的制备，存储200毫升的无菌双蒸水在4 ° C此外，准备的DMEM/F12媒体（由溶解粉状DMEM / F - 12在做准备了一倍蒸馏水）含100 U / mL青霉素和500毫升2X100μg/ mL链霉素，储存于4 ° C。
- 在一天的甲基准备，加无菌双蒸水500毫升到1000毫升烧杯，在上面的铝箔片。煮沸至少30分钟，以去除水中的气泡。
- 一个2000毫升的玻璃瓶中放入一个大型搅拌棒（至少3英寸长）。
- 测量300毫升的开水，并转移到容量瓶中。
- 烧瓶放在小的轰动板（不加热）。慢慢搅拌的热水，以避免产生气泡。
- 称取甲基纤维素粉33克，非常缓慢地把它添加到热水。热水是必要的湿甲基粉效率和援助在寒冷的温度随后解散。
- 继续搅拌粉末，直到温度降低到约40-45 ° C。
- 加入200毫升冷无菌双蒸水冷却甲基混合物。紧接后，你应该开始看到的解决方案变成透明粘稠，表明甲基是水相溶解。手摇动烧瓶，以确保解决方案是彻底混合。
- 加入500毫升冷2X的DMEM/F12媒体。继续漩涡手工混合。
- 在寒冷的房间的轰动板放在烧瓶中，慢慢搅拌24-48小时甲基解决方案。
- 分装成125毫升，每储存瓶，并储存在-20 ° C的解决方案一个样品应分装到无菌petridish的，并置于37 ° C培养箱无菌测试。解冻甲基纤维素溶液可存放在冰箱中长达2个月。
- 空调媒体准备。
解冻CM（见第1条），只是在使用前。保持整个冰半固体培养制备的CM。 - 准备以下的生长因子：1.0 M，0.1微米exendin - 4，10μg/ mL的重组人激活素βB烟和10＆MU; g / mL的VEGF - A的。储存在-20烟酰胺和exendin - 4 ° C和激活素βB和VEGF - A在-80℃，解冻前立即使用。所有半固体培养媒体组件应保持在冰上，在电镀过程。应当指出，除了血管内皮生长因子- A，后来发现没有必要的集落形成。
- 小牛血清的制备。 FCS应在使用前灭活的热量。孵育30分钟的FCS在56 ° C水浴中灭活补体蛋白。如果最初的FCS股票瓶拥有超过500毫升分装成125毫升小瓶。表面积增加将确保整个卷和彻底加热。允许瓶在室温下冷却至少1小时前贮存于-20 ° C解冻的FCS是0.2μm的过滤后方可使用。
- 排序细胞混合文化的组成部分。
期间随时准备在任何时候，以防止凝固的冰细胞和所有半固态媒体组件基质胶。与基质胶包括接触的所有物资，枪头，注射器和针头，应冷。放置在-20℃至少一个半小时前使用这些用品。- 确定接种于24孔板，每孔细胞数量。可镀多达25000细胞每24孔。一个可以执行在最初的实验中的细胞密度滴定，以确定最佳的种子细胞数量。
- 添加到5毫升的聚苯乙烯管文化的组成部分，在表1中所述的顺序单元盖（请注意，最后添加，以避免过早刺激细胞）。添加3.3％的甲基聚苯乙烯管第一次和最后排序细胞。注意，3.3％甲基纤维素溶液，需要制定并添加到16 ½号针头和适当的标记的毕业注射器聚苯乙烯管。在一般情况下，为了正确测量粘性的解决方案的体积，如3.3％的甲基纤维素溶胶ution和最终混合文化，重要的是先在注射器吸一些解决方案，然后立即推的解决方案，以排出空气。 3.3％甲基纤维素溶液可被加热到室温，如果实在是太难了画出来。但是，请确保它是在冰上冷却后配发到聚苯乙烯管和前基质胶此外的。
- 板的半固体培养基含有排序细胞。
- 在确保聚苯乙烯管帽坚决落实到位，大力管，彻底动摇手。在此过程中会产生气泡。
- 管放在冰上5分钟或直到小气泡表面。
- 一个1ml注射器使用16半或18个半针头吸出内容。按照3.6.2的意见，没有空气在注射器绘制准确的体积粘性溶液。
- 到每个24孔，慢慢地免除500 UL媒体。使用低附件24孔板。直接添加媒体以及中心。半固态媒体会自动传播，在井。对于每个实验样品，quadruplicated井经常使用，以获得统计学意义的结果。只有最里面的一个水平方向的24孔板4列用于文化。用无菌水填充剩下的水井，以帮助细胞含有文化的加湿。
- 在37 ° C和5％CO 2空气培养的细胞。
- 延迟增长的因素除了。启动后的文化，它可以添加生长因子。这种演习可能被用来解决某些生长因子的生存影响。可通过1 mL注射器滴生长因子的解决方案，以每孔100μL用26克3 / 8针，并允许扩散到半固体培养基。
4。光显微镜下观察菌落形成应付
应观察细胞电镀后立即以确保单个细胞随机均匀地分布整个出井。如果大多数的细胞或造成菌落分布在井的边缘，这将表明，配药入井的半固体培养基太用力（见3.7.4节）。由于半月板效应在殖民地的文化井的边缘密度相比，那些居住在该中心可能会更高。
- 菌落总数的量化。由于媒体的3维特征，殖民地将出现在不同的重点。因此，可能需要通过光镜观察期间的重点调整为每个殖民地。附加下24孔一格，当计数，以避免两次注册相同的殖民地。网格可能会获得通过切割一个NUNC petridish墙（货号No.169558）。一个10倍的物镜，光镜下应使用OBServe和计数的殖民地。
5。代表性的成果：
以前的实验表明，2.5 × 10 5小鼠R1 ES细胞（50毫升媒体总）开始，人们可以预期产生约5000适当大小的6天的胚。 Ngn3 - EGFP胚胎干细胞的效率较低; 4倍以上的细胞产生类似大小分化第6天。由于25日6胚包含平均为1.88 ± 0.67 × 10 5细胞，可从5000 EBS 1约37.6 × 10 6细胞。在附件的文化细胞有望扩大2.72 ± 0.32倍， 因此 ，5000一天6 EBS将产生约100 × 10 6天16个单元，前排序。浇注后，Ngn3 - EGFP +细胞会弥补约10％的总人口（议定书案文第2.2.5节和图3）日16细胞。
示例的photomicrogr胰岛素对小鼠ES细胞的菌落aphs如图4所示。这些殖民地有一个独特的形态;小（60-100微米）的单个细胞的全面菌落小，皮肤黝黑，不反光的殖民地。在我们以前的出版物，实时RT - PCR和双单独钦点菌落免疫荧光染色显示表达胰岛素，C肽和胰高血糖素。这些结果表明，单Ngn3 - EGFP +细胞能够分化成至少包含两个胰岛激素同时细胞，类似如内分泌细胞的原始第一波。
分散的单个细胞集落检测，使那些有能力开始在体外（图5）的增殖和分化的祖细胞的研究。因此，这是一个实验，可以测量个别祖细胞的内在功能。的祖先有capability成为胰岛素表达殖民地被称为胰岛素表达的菌落形成单位（ICFUs）（图5）。一致的想法，Ngn3 - EGFP Ngn3标志着在发展胰腺内分泌祖细胞，5 +，但不Ngn3 - EGFP -从mES细胞衍生的人口的细胞丰富的 ICFUs 2然而，这些祖细胞的频率仍然是低;总Ngn3 - EGFP +从第16天的文化孤立人口约0.1％至0.6％ICFUs 2不管，预计Ngn3 - EGFP +细胞集落形成效率的一个明显的区别是最高的，其次由。预排序的细胞，然后Ngn3 - EGFP -细胞。
图1。时间轴在小鼠ES细胞体外分化为胰腺细胞样细胞。对于条件培养基（CM）生成，小鼠胚胎干CELLS是增长15％FCS第6天的monothioglycerol减少剂量（6.0 × 10 -3米以下四个天的前两天和6.0 × 10 -4中号）产生分化处于悬浮状态。日6 EBS（80-100每口井），然后转移到附件6以及含有15％的淘汰赛血清替代的菜。可能会增加5％FCS之间文化的6-10天，以加快EBS的附件。烟酰胺，exendin - 4和重组人激活素βB将被添加到媒体文化的第13天（见1.1节）。媒体上收集培养16天，在这一点已成为空调的媒体。 16天的细胞，然后进行排序，进入半固体培养基菌落测定镀。
图2，大天，6胚从小鼠胚胎干细胞衍生的机构代表的显微照片。理想的一天，6胚至少150微米直径度计，有黑暗的中心（箭头）。早期胰腺祖细胞标记（如PDX - 1和Sox9）的表达水平在这些EBS（数据未显示）。
图3。排序mES细胞派生日16 Ngn3 - EGFP表达的大门。 （一）正向和侧向散射门，细胞的大小和粒度分别指示，消除非细胞碎片。 （二）的DAPI是用于识别死亡细胞，将染色阳性，在405-413纳米和排放检测与四十〇分之四百五十○过滤器激发。 （三）脉冲宽度，前向散射的电子脉冲的宽度，揭示双峰，应通过荧光激活细胞分选前通过淘汰。 （四）浇注EGFP（通道FL1）与自体荧光使用16日从父母的控制，如TL1（左侧面板）细胞株细胞照亮真实的荧光，从而Ngn3 - EGFP的<SUP> +细胞群（右图）。 （五）红色箭头显示的EGFP +门手动排序，以增加假阳性细胞的分离之前右移。 （D）和（E）的门控基于对地区活动（R1 - R3）（AC）。
图4。代表显微照片胰岛素表达在半固体培养的殖民地。殖民地是随机分布，出现小暗，非反光集群。单个菌落，以后可以检测基因和蛋白表达的RT - PCR和免疫组化分析，分别为（未显示;见视频）。
图5。殖民地的实验，让单系祖细胞的功能和定量评估。造成菌落记数，用来计算频率uency之间总镀细胞的祖细胞。在每个殖民地组成的细胞发起祖的谱系潜力的指标。使用这个实验中，我们发现，丰富Ngn3 - EGFP +从小鼠胚胎干细胞衍生的细胞表达胰岛素的菌落形成单位（ICFUs），祖细胞有能力分化为胰岛素表达殖民地。
表1。半固体培养媒体组件和添加顺序。
Discussion
到目前为止一直局限于殖民地检测，允许个人胰腺祖细胞的数量和功能评估，这极大地妨碍了在胰腺干细胞和祖细胞生物学的研究进展。殖民地检测的精髓在于它措施祖细胞的内在能力，而不是仅仅其表型，使祖细胞的功能和宗族潜力待观察。这也是一个定量的工具，可以决定在一个特定人群的祖细胞数量。在造血干细胞领域，菌落检测鉴定起到了重要的角色，以及破译生长因子的要求，相互作用，以及这些细胞的谱系承诺机制，在胰腺祖细胞生物学，胰腺器官 7领域6 8或散装9-13已制定了文化，然而，这样的分析没有解决生物questi在单细胞水平上的附加。没有单细胞分析，多潜在的胰腺干/祖细胞的存在不能被明确证明14。
在这里，我们表明，胰岛素表达细胞集落形成祖细胞，可使用一个立体的，含基质胶，半固态的文化系统检测。虽然已经开发了允许单一的成人胰腺祖细胞的增殖和分化成“pancreatospheres”一个悬浮培养系统 15,16，我们的殖民地检测提供了额外的优势。首先，我们的半固体培养媒体系统允许电镀高达25000排序，每500μL培养基细胞每24而产生的集落形成的线性范围。相比之下，暂停pancreatosphere试验需要使用单从细胞分选的细胞沉积的方法，让单细胞分析，因而体积较大的文化传媒和孵化空间是必需的。因此，我们的殖民地检测，是比较容易和成本效益进行大量不同的细胞时需要同时为祖活动相比。其次，我们的半固体培养基，使细胞外基质成分和生长因子，它允许的增殖和分化发生在同一井均匀分布。相反，它是比较困难的，提供这样一个环境，尤其是矩阵，在悬浮培养细胞。我们都知道，它与我们的方法不能明确证明，每一个殖民地是从一个单细胞产生，两个祖先可能是随机定位彼此形成一个殖民地附近。不过，这个问题是可以克服的二次分析使用单细胞操纵。排序的单细胞直接手工采摘可以明确证明每个殖民地的单细胞来源。
总之，胰岛素表达细胞集落形成亲活动在半固体培养基genitors本文所述在单细胞水平胰腺祖细胞的机理研究提供了独特的机会。例如，在以前的报告中，我们发现除了基质胶，细胞外基质蛋白的原油混合物，成文化，媒体为胰岛素表达 Ngn3 - EGFP +细胞，2个殖民地，提示细胞外基质的形成需要重要的祖。使用这个殖民地检测，现在将有可能进一步剖析，并定义为这种活动的具体矩阵要求。除了 研究从小鼠胚胎干细胞衍生的祖细胞，我们目前正在调查中，这在体外检测系统是否也支持形成围产期和成年小鼠的胰腺和肝脏中产生的其他独特的殖民地，以及从人类尸体胰腺组织缺乏胰岛。
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
作者想感谢克劳斯Kaestner博士Ngn3 - EGFP的小鼠胚胎干细胞系，布朗夫人露西和分析协助细胞分选流式细胞仪核心的礼物。这项工作是由NIH资助R21DK069997授予HTK的R01DK081587和加州再生医学研究所（摆围）授予兆瓦和LS的培训补助资金部分
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X DMEM/ F-12 (1:1) | Mediatech, Inc. | 15-090-CV | |
| Fetal Calf Serum | Tissue Culture Biologicals | 201 | Refer to Section 1.1 |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| 1X Dulbecco’s PBS | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | 7.5 % |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Reduced Growth Factor |
| Methylcellulose | Sinetsu Chemical | 1,500 centipoise (high-viscosity) | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human Recombinant Activin βB | R&D Systems | 659-AB-025 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich | E7144 | |
| Human Recombinant VEGF-A | R&D Systems | 293-VE-010 | |
| 24-well plates | Costar | 3473 | Ultra-low Attachment |
| 60mm Petri Dish with Grid | Nalge Nunc international | 169558 |
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