Summary
تم وصف مولد الرمع مقايسة ثلاثية الأبعاد التي تسمح البنكرياس مثل الأسلاف على التمايز إلى المستعمرات معربا عن الانسولين. هذا الأسلوب يستفيد من شبه صلبة تحتوي على وسائل الاعلام methylcellulose ، Matrigel وعوامل النمو ، والتي تتكاثر والأسلاف واحد يفرق
Abstract
وقد أعاق مجال الجذعية البنكرياس والسلف بيولوجيا الخلية بسبب نقص في المختبر المقايسات الفنية والكمية التي تسمح للتحليل خلية واحدة. تحليلات الأسلاف واحدة هي ذات أهمية حاسمة لأنها توفر سبل نهائي لإثبات بشكل قاطع احتمال نسب أسلاف الفردية. على الرغم من أن وضعت وسائل لتوليد "pancreatospheres" في الثقافة تعليق من الخلايا واحدة ، وجود عدة قيود. الأول ، هو تستغرق وقتا طويلا لتنفيذ واحد ترسب الخلايا لعدد كبير من الخلايا ، والتي بدورها الأوامر كميات كبيرة من وسائل الإعلام والثقافة ، والفضاء. الثانية ، ترقيم pancreatospheres الناتج كثيفة العمالة ، وخصوصا عندما تردد الأسلاف pancreatosphere - الشروع منخفضة. الثالث ، ومقايسة pancreatosphere ليس وسيلة فعالة للسماح كلا من الانتشار والتفريق بين الأسلاف البنكرياس في الثقافة نفسها بشكل جيد ، وإعادةstricting فائدة الفحص.
للتغلب على هذه القيود ، وقد تم وضع شبه صلبة وسائل الاعلام القائمة على مقايسة مستعمرة الأسلاف البنكرياس ويرد في هذا التقرير. هذا الأسلوب يستفيد من مفهوم موجود من مقايسة مستعمرة المكونة للدم ، والذي يستخدم لتوفير methylcellulose اللزوجة إلى وسائل الإعلام ، والسماح للخلايا الاصلية في البقاء في الفضاء الثلاثي الأبعاد كما أنها تخضع الانتشار فضلا عن التمايز. لإثراء الانسولين معربا عن تشكيل مستعمرة الأسلاف من السكان غير متجانسة ، ونحن نعرب عن الخلايا التي استخدمت neurogenin (NGN) 3 ، والسلف البنكرياس الصماء علامة الخلية. الفئران الجذعية الجنينية (ES) الخلايا المشتقة من الخلايا معربا عن Ngn3 المفتاحية المعززة الأخضر مراسل بروتين فلوري تم فرزها وما يصل الى 25000 في الخلايا وكذلك في المرفق مطلية منخفضة 24 الأطباق الثقافة أيضا. اجتمع : كل الواردة من 500 ميكرولتر من شبه صلبة وسائل الاعلام مع المكونات الرئيسية التاليةhylcellulose ، Matrigel ، نيكوتيناميد ، exendin - 4 ، βB activin ، ووسائل الإعلام المكيفة التي تم جمعها من الفئران الخلايا المشتقة من خلية البنكرياس مثل وفاق. بعد 8 إلى 12 يوما للثقافة ، معربا عن الانسولين مع المستعمرات مميزة تشكلت مورفولوجيا ويمكن لمزيد من التحليل للتعبير الجين البنكرياس باستخدام كمية RT - PCR وتلطيخ immunoflourescent لتحديد تكوين نسب كل مستعمرة.
باختصار ، لدينا تجربة مستعمرة يسمح السهل الكشف النوعي والكمي لأسلاف ظيفية ضمن مجموعة من السكان غير متجانسة من الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، شكل وسائل الاعلام شبه صلبة تتيح عرض موحد لمكونات المصفوفة خارج الخلية ، وعوامل نمو الخلايا ، مما الأسلاف لتتكاثر والتفريق في المختبر. هذا الاختبار مستعمرة يوفر فرصا فريدة للدراسات الميكانيكية للخلايا البنكرياس السلف على مستوى خلية واحدة.
Protocol
1. تمايز خلايا البنكرياس وفاق الفئران لمثل الخلايا في المختبر لتوليد وسائل الإعلام مكيفة (CM) للمقايسة مستعمرة
إجراءات الفئران ES صيانة الخلية ، تم مضغي الشكل الجسم (EB) تشكيل الثقافة في التعليق ، وثقافة المرفق لمزيد من التمايز الموصوفة سابقا 1-3 و لم يتم التركيز في هذا التقرير. ويبين العرض التخطيطي للخطوات التي ينطوي عليها بروتوكول لدينا تمايز في الشكل 1.
من أجل الحصول على جودة عالية وسائل الإعلام مكيفة ، فمن المهم لتوليد أول 6 أيام من العمر EBS في ما لا يقل عن 30-40 ٪ منهم من يبلغ قطرها لا يقل عن 150 ميكرون. يجب أن تحتوي على أكبر EBS بقع داكنة تحت المجهر الخفيفة ، مما يشير إلى التمايز محسن (الشكل 2). اختيار نوعية عالية مصل العجل الجنين (FCS) أمر حاسم لتوليد مثل هذه EBS. ويتم اختيار الجودة العالية الكثير FCS على أساس قدرتهم على دعم differentiatايون من EBS تجاه الأنسولين 1 ، والجلوكاجون الأميليز التعبير الجيني 2A في مراحل لاحقة (اليوم 18-20) كما اكتشفت RT - PCR التحليل. علاوة على ذلك ، عندما يتم نقل اليوم EBS - 6 من ثقافة إلى ثقافة التعليق المرفق (حوالي 80 -- 100 EBS لكل بئر في 6 لوحات أيضا) أنه من المهم لتدوير بلطف لوحات لجمع EBS - 6 ايام في مركز للآبار. مناورات لأسباب غير معروفة الخلية التي تعزز الخلايا نتيجة الاتصالات في تطوير أفضل من البنكرياس مثل الخلايا من EBS في مرحلة لاحقة مرفق الثقافة.
- في يوم الثقافة 13 ، يستعاض عن وسائل الإعلام ثقافة المرفق (DMEM/F-12 (1:1) ، و 15 ٪ استبدال خروج المغلوب المصل ، 2 مم L - الجلوتامين ، 50 U / مل البنسلين ، 50 ميكروغرام / مل الستربتوميسين) المرفق مع ثقافة جديدة وسائل الاعلام نيكوتيناميد ملي containing10 ، 0.1 نانومتر exendin - 4 ، و 10 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف SSB activin (جميع التركيزات النهائية).
- في يوم الثقافة 16 ، وجمع وسائل الإعلام من الخطوة 1.1 و التصفية عليه من خلال polyethers 0.2 ميكرونulfone الغشاء. من هذه النقطة سوف تحال إلى الأمام وسائل الإعلام التي تم جمعها إلى وسائل الإعلام مكيفة (CM). قسامة من CM في 15 مل من أنابيب فالكون وتخزينه في -80 درجة مئوية حتى قبيل شبه صلبة الثقافة (انظر القسم 3 أدناه).
2. الحصول على البنكرياس مثل الأسلاف في تعليق خلية واحدة باستخدام فارز مضان تنشيط الخلايا
وتدق في الفئران وفاق خط الخلية ، تسمى EGFP 4 - Ngn3 ، حيث الجين مراسل EGFP استبدال ومتباينة one أليل من موضع Ngn3 كما هو موضح سابقا. Ngn3 2 هو عامل أساسي النسخ الحلزون ، الحلزون حلقة (bHLH) التي تحتوي على وأعرب عن طريق الأسلاف البنكرياس الصماء أثناء تطوير وفرز عادة يوم 5 - 16 للحصول على الثقافات المتباينة Ngn3 - EGFP + وNgn3 - EGFP -- خلايا 1،2
- تفكك الخلايا المتمايزة في تعليق خلية واحدة.
- احتضان يوم 16 الثقافات وايال 0.25 ٪ التربسين - EDTA (3 دقائق و 37 درجة مئوية) لإزاحة الخلايا من الآبار الثقافة.
- إضافة 10 ٪ لوقف النشاط FCS التربسين.
- غسل الخلايا مع المغنيسيوم والكالسيوم الحرة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 0.1 ٪ ألبومين المصل البقري (BSA) ، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف واحتضان كتل الخلية مع 4 ملغ / مل كولاجيناز B و 2000 U / مل ديوكسي ريبونيوكلياز (الدناز) الأول (30 دقيقة و 37 درجة مئوية) لإنتاج تعليق خلية واحدة. استخدام ماصة 1000 ميكرولتر لتعطيل كريات كل خلية 10 دقيقة لتسريع عملية التفكك.
- غسل الخلايا التي تحتوي على برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 0.1 ٪ ، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- وطاف resuspend إزالة الخلايا التي تحتوي على برنامج تلفزيوني في جيش صرب البوسنة 0.1 ٪.
- إعداد الخلايا للفرز.
- إضافة 2 ميكرولتر الدناز I (1 MU / مل) لتعليق كل خلية مل لمنع إعادة تجميع الخلية أثناء الفرز.
- تمرير تعليق خلية واحدة من خلال م 40-70 ميكرومترلإزالة الركام نبوي زنزانة كبيرة.
- إضافة دابي (1 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) إلى تعليق خلية واحدة.
- الحصول على بيانات التدفق الخلوي على فارز الخلية. واستخدمت MLS MoFlo فارز الخلية (بيكمان كولتر) لهذا التقرير.
- تبوب السكان خلية للفرز. Ngn3 - EGFP + وNgn3 - EGFP -- الخلايا المغلقة الأولى مع مبعثر إلى الأمام مقابل مبعثر الجانب (الشكل 3A) ، تليها دابي مقابل مبعثر الجانب (الشكل 3B) ، مقابل عرض نبض مبعثر الجانب (الشكل 3C) ، وأخيرا FL1 مقابل لصناعة السيارات في مضان (الشكل 3D). البوابة الفرز النهائي للEGFP - Ngn3 يتم نقل عمدا + الخلايا إلى اليمين (الشكل 3E ؛ السهم) من أجل الحد من تلوث EGFP - Ngn3 -- الخلايا أثناء الفرز. لتبوب السيطرة السلبية ، إما اليوم - 6 - EBS من Ngn3 EGFP خط ES أو نفس المرحلة ، يوم 16 من الثقافة خط غير المعدلة وراثيا ، مثل خلايا ES TL1 (الشكل 3D ، لوحة اليسار) ، ويمكن استخدامها.
- فرز Ngn3 - EGFP + وNgn3 - EGFP
3. طلاء لفرز الخلايا شبه صلبة الثقافة
- Matrigel التحضير.
- قسامة في Matrigel إلى 1 مل في أنبوب وتخزينها في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- ينبغي أن توضع aliquots المجمدة في 4 درجات مئوية خلال الليل أو على الجليد لمدة 3 ساعات لذوبان الجليد فقط قبل استخدامها. ويجب أن تبقى على aliquots إذابة الجليد خلال إعداد ثقافة شبه صلبة لتجنب resolidification.
- Methylcellulose الحل (3.3 ٪) التحضير.
لا يمكن أن يكون مسحوق Methylcellulose تعقيمها. من أجل الحصول على البكتيريا خالية من حل methylcellulose ، واستخدام القوارب نظيفة وزنها والحانات اثارة تعقيمها ، الأكواب ، وقوارير والأجهزة الأخرى أثناء عملية التحضير.- قبل يوم واحد methylcellulose إعداد الحل ، تخزين 200 مل من الماء المعقم المقطر مزدوجة في 4 درجات مئوية. أيضا ، وإعداد 500 مل من 2X DMEM/F12 وسائل الاعلام (عن طريق إذابة مسحوق تحضير DMEM / F - 12 في تضاعف الماء المقطر) تحتوي على 100 يو / مل والبنسلين100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- يوم إعداد methylcellulose ، إضافة 500 مل من الماء المقطر المعقم مزدوجة لكأس الكؤوس 1000 مل مع قطعة من رقائق الألومنيوم على القمة. يغلي لمدة 30 دقيقة على الأقل لتخليص المياه من فقاعات الهواء.
- مكان كبير بقضيب الحجم (لا يقل عن 3 بوصات في الطول) في قارورة زجاجية 2000 مل.
- قياس 300 مل من الماء المغلي وتحويلها إلى القارورة.
- ضع القارورة على طبق من اثارة (بدون تسخين). يحرك ببطء لتجنب الماء الساخن توليد فقاعات الهواء.
- تزن 33 غراما من مسحوق methylcellulose ببطء شديد وإضافته إلى الماء الساخن. الماء الساخن هو ضروري لترطيب مسحوق methylcellulose بكفاءة والمساعدة على حل اللاحقة في درجات الحرارة الباردة.
- تواصل تحريك مسحوق حتى يتم خفض درجة الحرارة الى حوالي 40-45 درجة مئوية.
- إضافة 200 مل مزدوج الباردة المعقمة الماء المقطر إلى خليط methylcellulose التبريد. فورابعد ذلك ، يجب أن تبدأ في رؤية حل شفاف ولزج بدوره ، مشيرا إلى أن methylcellulose هو حل في المرحلة المائية. يتم خلط دوامة ناحية القارورة لضمان حل شامل.
- إضافة 500 مل الباردة 2X DMEM/F12 وسائل الإعلام. تواصل دوامة باليد إلى المزيج.
- ضع القارورة على طبق من اثارة في غرفة باردة ، ويحرك ببطء لحل methylcellulose 24-48 ساعة.
- قسامة الحل في 125 مل زجاجة الواحدة التخزين ، وتخزينها في -20 درجة مئوية. وينبغي الاستغناء عينة الى petridish معقمة ووضع في الحاضنة 37 درجة مئوية لاختبار العقم. يمكن الاحتفاظ إذابة حل methylcellulose في الثلاجة لمدة تصل إلى 2 أشهر.
- إعداد وسائل الإعلام مكيفة.
CM ذوبان الجليد (انظر القسم 1) فقط قبل استخدامه. إبقاء CM على الجليد طوال إعداد ثقافة شبه صلبة. - تعد عوامل النمو التالية : 1.0 M نيكوتيناميد ، 0.1 ميكرومتر exendin - 4 ، 10 ميكروغرام / مل المؤتلف الإنسان activin βB ، و 10 م وش ؛ ز / مل VEGF - A. تخزين ونيكوتيناميد exendin في 4 -20 درجة مئوية وactivin βB وVEGF - A على -80 درجة مئوية ، وأذاب عنهم فورا قبل الاستخدام. وينبغي أن تظل جميع شبه صلبة مكونات الثقافة الإعلامية على الجليد أثناء الطلاء. وتجدر الإشارة إلى أنه إضافة VEGF - A تم العثور في وقت لاحق ليست ضرورية لتشكيل مستعمرة. 2
- العجل الجنين إعداد المصل. وينبغي أن تكون الحرارة FCS المعطل قبل الاستخدام. احتضان السفح لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية في حمام مائي لتعطيل البروتينات المتممة. إذا كانت الأسهم الأولي FCS زجاجة تحمل أكثر من 500 مل قسامة عليه في قارورة 125 مل. وزادت مساحة السطح ضمان التدفئة حتى وشامل لحجم كامل. السماح لتبريد زجاجات في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل تخزينها في -20 درجة مئوية. يتم تصفية 0.2μm FCS إذابة قبل الاستخدام.
- مزيج مكونات الثقافة مع الخلايا التي تم فرزها.
إبقاء الخلايا وجميع مكونات شبه صلبة وسائل الاعلام على الجليد أثناء إعداد في جميع الأوقات لمنع تصلبMatrigel. جميع الإمدادات التي تأتي في اتصال مع Matrigel بما في ذلك ، ينبغي نصائح ماصة ، والمحاقن والإبر ، وتكون باردة. هذه الإمدادات في مكان -20 ° C ساعة على الأقل قبل نصف الاستخدام.- تحديد كمية الخلايا لتكون المصنفة لكل بئر في صفيحة 24 أيضا. يمكن أن يصل إلى 25000 مطلية خلايا لكل بئر - 24. يمكن للمرء أن إجراء معايرة كثافة خلية في التجارب الأولية لتحديد الخلية بذر عدد الأمثل.
- إضافة إلى مكونات الثقافة أنبوب البوليسترين 5 مل مع غطاء المفاجئة في التسلسل موضح في الجدول رقم 1 (لاحظ أن يتم إضافة خلايا الماضي لتجنب التحفيز قبل الأوان). إضافة methylcellulose 3.3 ٪ للأنابيب البوليسترين الأول والأخير للخلايا التي تم فرزها. علما بأن الحل methylcellulose 3.3 ٪ يجب أن يكون وضعها وإضافتها إلى أنابيب البوليسترين مع إبرة قياس 16 ½ حقنة وضعت على نحو كاف تخرج. بشكل عام ، وذلك لقياس حجم بشكل صحيح من حلول لزجة ، مثل سول methylcellulose 3.3 ٪ution وخليط ثقافة النهائي ، فمن المهم أن نضح بعض الحل في المحقنة أولا ، ثم دفع على الفور إلى حل طرد الهواء. قد يكون الحل methylcellulose تحسنت بنسبة 3.3 ٪ إلى درجة حرارة الغرفة إذا كان من الصعب جدا استخلاص. ومع ذلك ، تأكد من يتم تبريده على الجليد بعد الاستغناء عليه في أنابيب البوليسترين وقبل إضافة Matrigel.
- لوحة وسائل الإعلام شبه الصلبة التي تحتوي على الخلايا التي تم فرزها.
- بعد التأكد من القمم من أنابيب البوليسترين راسخة في مكانها ، يهز أنابيب يد بقوة وبدقة. وسيتم توليد فقاعات الهواء خلال هذه العملية.
- وضع أنابيب على الجليد لمدة 5 دقائق أو حتى يصبح السطح فقاعات الهواء الصغيرة.
- استخدام حقنة بإبرة 1mL ½ عيار 16 أو 18 ونصف لنضح المحتويات. اتبع النصيحة في 3.6.2 لرسم دقيق لحجم دون حل لزج الهواء في المحاقن.
- الاستغناء عن 500 UL ببطء من وسائل الاعلام الى جانب 24 لكل منهما. استخدمالمرفق منخفضة 24 جيدا لوحات فقط. إضافة وسائل الاعلام مباشرة إلى وسط البئر. فإن وسائل الإعلام شبه صلبة تنتشر تلقائيا في الآبار. لكل نموذج تجريبي ، وتستخدم بشكل روتيني quadruplicated الآبار من أجل الحصول على نتائج مهمة احصائيا. فقط يتم استخدام الأعمدة 4 قعر طبق 24 أفقيا جيدا الموجهة للثقافة. ملء الآبار المتبقية مع الماء المعقم لمساعدة الترطيب للثقافة الخلية التي تحتوي على.
- احتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO 2 الجوي.
- بالإضافة إلى ذلك من العوامل تأخر النمو. فمن الممكن أن تضيف عوامل النمو بعد الشروع في الثقافة. ويمكن استخدام مثل هذه المناورات لمعالجة آثار بقاء بعض عوامل النمو. قد تكون الحلول عامل نمو تصل إلى 100 ميكروليتر لكل بئر يسيل عبر حقنة 1 مل مع G 26 3 / 8 إبرة وسمح لنشر في وسائل الإعلام شبه صلبة.
4. مراقبة تشكيل مستعمرة تحت ضوء MICROSتغلب
ينبغي التقيد الخلايا مباشرة بعد الطلاء للتأكد من أن الخلايا هي واحدة عشوائيا وزعت بالتساوي في جميع أنحاء خارج الآبار. إذا كان يتم توزيع معظم الخلايا أو المستعمرات الناتجة على هامش الآبار ، وهذا يشير إلى أن الاستغناء عن وسائل الإعلام شبه صلبة في آبار كان قويا جدا (انظر القسم 3.7.4). قد يرجع ذلك إلى كثافة مستعمرة هلالة تأثير على هامش الآبار ثقافة تكون أعلى بالمقارنة مع أولئك الذين يقيمون في المركز.
- مستعمرة عدد الكمي. يرجع ذلك إلى ميزة 3 الابعاد وسائل الإعلام ، وسوف تظهر في المستعمرات نقاط الاتصال المختلفة. وبالتالي ، قد تكون هناك حاجة إلى تعديل للتركيز على كل مستعمرة خلال المراقبة بواسطة المجهر الضوئي. إرفاق الشبكة بشكل جيد تحت 24 وعند العد من أجل تفادي تسجيل مستعمرة نفسه مرتين. ويمكن الحصول على الشبكة عن طريق خفض جدار petridish نونك (الفئة No.169558). وينبغي استخدام عدسة الهدف 10X على ضوء المجهر لOBServe وعدد المستعمرات.
5. ممثل النتائج :
وقد أظهرت التجارب السابقة أن تبدأ مع 2.5 × 10 5 الفئران خلايا ES R1 (مجموع وسائل الاعلام في 50 مل) يمكن للمرء أن يتوقع أن تولد حوالي 5000 الحجم المناسب يوم 6 EBS. كانت Ngn3 خلايا ES - EGFP أقل كفاءة ؛ هناك حاجة إلى مزيد من الخلايا 4 مرات لتوليد مماثلة الحجم من قبل EBS يوم 6. لأن 25 يوما 6 EBS تحتوي على ما معدله 1.88 ± 0.67 ويمكن الحصول على الخلايا 5 × 10 ، 1 حوالي 37.6 × 10 6 خلايا من EBS 5000. خلال ثقافة المرفق من المتوقع أن خلايا لتوسيع 2.72 ± 0.32 أضعاف. 1 وهكذا ، 5000 يوم 6 EBS سيحقق ما يقرب من 100 × 10 6 16 يوما الخلايا قبل الفرز. بعد النابضة ، فإن Ngn3 - EGFP + الخلايا يشكلون حوالي 10 ٪ من مجموع السكان اليوم 16 خلية (البروتوكول نص القسم 2.2.5 والشكل 3).
مثال على photomicrogrويرد aphs من المستعمرات الانسولين معربا عن المستمدة من الخلايا ES الفئران في الشكل 4. هذه المستعمرات لها مورفولوجيا مميزة ؛ صغيرة (~ 60-100 ميكرون) مستعمرات مستديرة مع الخلايا الفردية في المستعمرات التي هي صغيرة ومظلمة ، وليس الضوء العاكس. في المنشور السابق ، كشفت 2 في الوقت الحقيقي RT - PCR وتلطيخ مناعي المزدوج للمستعمرات بشكل فردي اختارهم التعبير من الانسولين ، C - الببتيد والجلوكاجون. هذه النتائج تثبت قدرة الخلايا واحد + Ngn3 - EGFP على التمايز إلى خلايا تحتوي على ما لا يقل عن اثنين من الهرمونات جزيرة في وقت واحد ، تشبه البدائية الأولى الموجة مثل خلايا الغدد الصماء.
في مقايسة مستعمرة للخلايا واحدة فرقت تمكن الدراسة لتلك الأسلاف التي لديها القدرة على بدء انتشار والتمايز في المختبر (الشكل 5). وبالتالي ، فإن هذا الفحص التي يمكن قياس وظيفة جوهرية من الخلايا السلف الفردية. الأسلاف التي لديها capabiوتسمى lity لتصبح الانسولين معربا عن المستعمرات الانسولين معربا عن تشكيل وحدة مستعمرة (ICFUs) (الشكل 5). تتفق على فكرة أن Ngn3 علامات الخلايا الاصلية الغدد الصماء في البنكرياس النامية ، 5 - Ngn3 EGFP + ، ولكن ليس Ngn3 - EGFP -- يتم إثراء خلايا من السكان الخلايا المشتقة زارة التربية والعلم لICFUs 2 ومع ذلك ، فإن تواتر هذه الأسلاف لا تزال منخفضة ، ما يقرب من 0.1 ٪ الى 0.6 ٪ من مجموع السكان + Ngn3 - EGFP معزولة عن الثقافة اليوم هي 16 ICFUs 2 بغض النظر ، وفرقا واضحا في تشكيل مستعمرة الكفاءة هو متوقع ، مع خلايا + Ngn3 - EGFP أعلى ، تليها. presorted الخلايا ، ثم Ngn3 - EGFP -- الخلايا.
الشكل 1. الجدول الزمني للالفئران في المختبر ES خلايا البنكرياس لتمايز الخلايا الشبيهة. لتكييف الجيل (CM) وسائل الإعلام ، فأري ES سلوتزرع في تعليق ليرة سورية مع FCS 15 ٪ خلال الأيام الستة الأولى بجرعات متناقصة من monothioglycerol (6.0 × 10 -3 م لأول يومين و 6.0 × 10 م -4 في الأيام الأربعة التالية) لتوليد EBS. ثم يتم نقلها اليوم EBS - 6 (8-10 لكل بئر) لمرفق 6 - جيدا الأطباق التي تحتوي على 15 ٪ استبدال خروج المغلوب المصل. ويمكن إضافة 5 ٪ FCS بين 6-10 أيام الثقافة للإسراع في إلحاق EBS. نيكوتيناميد ، ثم تضاف exendin - 4 ، والمؤتلف βB activin الإنسان إلى وسائل الإعلام في يوم الثقافة 13 (انظر القسم 1.1). وتجمع وسائل الاعلام يوم 16 و الثقافة في هذه المرحلة أصبحت وسائل الإعلام مكيفة. ثم يتم فرز الخلايا ويوم 16 مطلي شبه صلبة في وسائل الإعلام لفحص المستعمرة.
الشكل 2. صورة مجهرية ممثل كبير الهيئات يوم 6 مضغي الشكل مشتقة من الفئران الخلايا الجذعية الجنينية. يوم مثالي - 6 EBS ما لا يقل عن 150 ميكرومتر في ديامالعطر ولها مراكز مظلمة (الأسهم). ومما يعزز التعبير عن علامات مبكرة السلف البنكرياس (مثل PDX - 1 و Sox9) في هذه EBS 3 (لا تظهر البيانات).
الشكل 3. فرز بوابات لخلية الخلايا المشتقة MES Ngn3 - EGFP يوم 16 الإعراب. (أ) بوابات مبعثر الأمام والجانب ، مما يدل على حجم الخلية وتحبب على التوالي ، والقضاء على الخلايا غير الحطام. (ب) يستخدم لتحديد دابي الخلايا الميتة ، والتي سوف تكون ملطخة إيجابية عندما متحمس في 405-413 نانومتر ، والكشف عن الانبعاثات مع فلتر 450/40. (ج) العرض النبض ، وعرض للنبض مبعثر الإلكترونية إلى الأمام ، ويكشف doublets ، التي ينبغي القضاء عليها قبل أن يتم تمريرها من خلال تنشيط الخلية فارز ومضان. (D) المحاصرة من EGFP (قناة FL1) مقابل تألق ذاتي باستخدام خلايا يوم 16 من خلية خط السيطرة الأبوية مثل TL1 (اللوحة اليسرى) ينير مضان الحقيقية وبالتالي Ngn3 EGFP - <سوب> السكان خلية + (اللوحة اليمنى). (E) السهم الأحمر يظهر دليل حق التحول من البوابة + EGFP قبل الفرز لزيادة الفصل بين الخلايا إيجابية كاذبة. الأحداث في كل من (D) و (E) هي بوابات على أساس المناطق (R1 -- R3) هو مبين في (ميلان).
photomicrographs الممثل الشكل 4. الأنسولين ، معربا عن مستعمرات في شبه صلبة الثقافة. وتوزع بشكل عشوائي المستعمرات وتظهر مجموعات صغيرة مظلمة غير الضوء ، العاكسة. يمكن أن يكون الفرد في وقت لاحق المستعمرات يعاير للتعبير الجينات والبروتينات التي كتبها RT - PCR والتحاليل المناعية ، على التوالي (لا يظهر ، انظر الفيديو).
الشكل 5 ألف مقايسة مستعمرة تسمح التقييمات الفنية والكمية من الخلايا الاصلية واحد. يستخدم الترقيم من المستعمرات الناتجة لحساب التكرارuency من الخلايا الاصلية بين خلايا مطلي الإجمالي. تشكيل خلايا داخل كل مستعمرة يدل على احتمال نسب السلف بدء. باستخدام هذا الاختبار ، وجدنا أنه تم المخصب Ngn3 - EGFP + الخلايا المشتقة من الخلايا الجذعية الجنينية الفئران للانسولين والتعبير عن مستعمرة تشكيل وحدات (ICFUs) ، الخلايا الاصلية التي لديها القدرة على التمايز إلى الانسولين معربا عن المستعمرات. 2
الجدول 1. شبه الصلبة ومكونات الثقافة الإعلامية ترتيب اضافتها.
Discussion
واقتصرت مستعمرة المقايسات التي تسمح التقييمات الكمية والفنية للأسلاف البنكرياس الفردية حتى الآن ، مما أعاق كثيرا من التقدم في دراسات الجذعية البنكرياس والسلف بيولوجيا الخلية. جوهر مقايسة مستعمرة هو أنه يقيس القدرة الذاتية للخلايا الاصلية ، بدلا من النمط الظاهري فقط ، مما يسمح لوحظ أن وظائف وإمكانات نسب من الخلايا الاصلية. بل هو أيضا أداة الكمية التي يمكن تحديد عدد الأسلاف في عدد معين من السكان. في مجال الخلايا الجذعية المكونة للدم ، لعبت أدوارا مهمة المقايسات مستعمرة في تحديد الهوية ، فضلا عن فك رموز متطلبات عامل النمو ، والتفاعلات ، والآليات التي تحكم التزام نسب هذه الخلايا. 6 وفي مجال السلف البنكرياس بيولوجيا الخلية وجهاز البنكرياس 7 (8) ، أو الجزء الأكبر الثقافات 9-13 وقد وضعت ولكن هذه المقايسات لا تعالج questi البيولوجيةإضافات على مستوى خلية واحدة. دون تحليلات خلية واحدة ، لا يمكن وجود البنكرياس الجذعية المتعددة المحتملة / أسلاف يثبت بشكل لا لبس فيه (14).
هنا نظهر أن الانسولين معربا عن تشكيل مستعمرة الأسلاف يمكن يعاير باستخدام ثلاثي الأبعاد ، والتي تحتوي على Matrigel ، ثقافة النظام شبه صلبة. على الرغم من أنه تم تطوير نظام تعليق 15،16 الثقافة الذي يسمح احد الأسلاف البنكرياس البالغين لتتكاثر وتتمايز إلى "pancreatospheres" ، مقايسة لدينا مستعمرة يوفر مزايا إضافية. أولا ، لدينا شبه صلبة وسائل الاعلام نظام يسمح الثقافة الطلاء لمدة تصل إلى 25،000 الخلايا فرز لكل 500 ميكرولتر الثقافة وسائل الإعلام لكل بئر - 24 مع الحفاظ على تشكيل مستعمرة مما أدى إلى مجموعة خطية. 2 وفي المقابل ، فإن مقايسة pancreatosphere تعليق يتطلب استخدام واحد طريقة ترسب الخلايا من الخلية فارز للسماح بتحليل خلية واحدة ، وبالتالي حجم أكبر من وسائل الإعلام والثقافة ، وحاضنة الفضاءمطلوبة. لذلك ، لدينا تجربة مستعمرة من السهل نسبيا وفعالة من حيث التكلفة لإجراء عندما بدأت أعداد كبيرة من خلايا مختلفة تحتاج إلى وقت واحد مقابل لأنشطة السلف. الثانية ، لدينا شبه صلبة وسائل الإعلام يسمح التوزيع الموحد لمكونات المصفوفة خارج الخلية ، وعوامل النمو ، والذي يسمح كل من انتشار الأسلحة النووية وتمايز تحدث في نفس البئر. في المقابل ، فإنه من الصعب توفير هذه البيئة ، ولا سيما مصفوفة ، إلى الخلايا في الثقافة الايقاف. نحن ندرك أنه مع اسلوبنا لا يمكن أن تثبت بشكل قاطع أن يتم اشتقاق كل مستعمرة من خلية واحدة ، كما يمكن ان اثنين من أسلاف المتمركزة بالقرب من كل مستعمرة عشوائيا الآخر والشكل. ومع ذلك ، يمكن التغلب على هذه المشكلة عن طريق تحليل ثانوي التلاعب به واحد الخلية. ويمكن مباشرة انتقاء واحد من الخلايا فرز تثبت بشكل قاطع الأصل خلية واحدة في كل مستعمرة.
باختصار ، للانسولين والتعبير عن تشكيل مستعمرة نشاط المواليةوصف genitors في شبه صلبة وسائل الاعلام هنا يوفر فرصا فريدة للدراسات الميكانيكية للأسلاف البنكرياس على مستوى خلية واحدة. على سبيل المثال ، في تقرير سابق وجدنا أن إضافة Matrigel ، وهي مزيج النفط الخام من البروتينات المصفوفة خارج الخلية ، في الثقافة هو مطلوب وسائل الاعلام عن تشكيل الانسولين معربا عن مستعمرات من خلايا + Ngn3 - EGFP (2) ، مما يدل على المصفوفة خارج الخلية هو المهم بالنسبة لأولئك الأسلاف. باستخدام هذا الاختبار مستعمرة ، سيكون من الممكن الآن لمزيد من تشريح وتحديد الاحتياجات مصفوفة محددة لمثل هذا النشاط. بالإضافة إلى دراسة الأسلاف المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية ، ونحن حاليا بالتحقيق في ما إذا كان هذا الفحص المختبري في النظام كما يدعم تشكيل المستعمرات المميزة الأخرى المستمدة من البنكرياس والكبد من الفئران قبل الولادة والكبار ، وكذلك من الأنسجة البشرية البنكرياس جثي خالية من الجزر.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور كلاوس Kaestner لهبة Ngn3 - الفئران الجذعية الجنينية EGFP خط الخلية ، والسيدة لوسي براون وجوهر الخلوي التحليلية للمساعدة في فرز الخلايا. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المنح والمعاهد الوطنية للصحة R21DK069997 R01DK081587 ومنحت لHTK من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) المنح التدريبية التي تمنح للميغاواط وLS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X DMEM/ F-12 (1:1) | Mediatech, Inc. | 15-090-CV | |
| Fetal Calf Serum | Tissue Culture Biologicals | 201 | Refer to Section 1.1 |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| 1X Dulbecco’s PBS | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | 7.5 % |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Reduced Growth Factor |
| Methylcellulose | Sinetsu Chemical | 1,500 centipoise (high-viscosity) | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human Recombinant Activin βB | R&D Systems | 659-AB-025 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich | E7144 | |
| Human Recombinant VEGF-A | R&D Systems | 293-VE-010 | |
| 24-well plates | Costar | 3473 | Ultra-low Attachment |
| 60mm Petri Dish with Grid | Nalge Nunc international | 169558 |
References
- Ku, H. T. Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro. Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).
- Ku, H. T. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Chen, C. Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis. Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).
- Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity. Genes. 16, 1488-1497 (2002).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors. Development. 122, 439-447 (1996).
- Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).
- Bonner-Weir, S. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).
- Gao, R. Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture. Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).
- Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells. Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).
- Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).
- Hao, E. Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas. Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Seaberg, R. M. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).
- Rovira, M. Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).
