Summary
En tre-dimensionelle clonogenic analyse, der giver pancreas-lignende stamceller til at differentiere til insulin-udtrykkende kolonier er beskrevet. Denne metode benytter sig af semi-faste medier indeholdende methylcellulose, Matrigel og vækst faktorer, og hvor enkelt progenitorer formere sig og differentiere
Abstract
Feltet af pancreas stamceller og stamceller biologi er blevet hæmmet af mangel på in vitro funktionelle og kvantitative analyser, som giver mulighed for analyse af enkelt celle. Analyser af enkelte forfædre er af afgørende betydning, fordi de giver definitive måder at utvetydigt demonstrere afstamning potentialet i de enkelte stamceller. Selvom metoder er blevet udviklet til at generere "pancreatospheres" i suspension kultur fra enkelte celler, flere begrænsninger eksisterer. Det første er det tidskrævende at udføre enkelt celle deposition for et stort antal celler, som igen kommandoer store mængder af dyrkningsmedier og rum. For det andet, tælling af den resulterende pancreatospheres er arbejdskrævende, især når frekvensen af pancreatosphere-indlede stamceller er lav. For det tredje pancreatosphere analysen er ikke en effektiv metode til at give både spredning og differentiering af bugspytkirtlen forfædre i den samme kultur godt, restricting nytten af analysen.
For at overvinde disse begrænsninger, har en halvfast medier baseret koloni assay for bugspytkirtlen progenitorer blevet udviklet og er præsenteret i denne rapport. Denne metode benytter sig af et eksisterende koncept fra hæmatopoietisk koloni assay, hvor methylcellulose bruges til at give viskositet til medierne, så stamceller til at opholde sig i tre-dimensionelle rum, som de gennemgår spredning samt differentiering. At berige insulin-udtrykkende kolonidannende progenitorer fra en heterogen population, vi udnyttet celler, der udtrykker neurogenin (NGN) 3, en bugspytkirtlen endokrine progenitorceller markør. Murine embryonale stamceller (ES) celle-afledte Ngn3 udtrykker celler tagget med den forbedrede grønne fluorescerende protein reporter blev sorteret og helt op til 25.000 celler per brønd blev forgyldt i lav-fastgørelse 24-såvel kultur retter. Hver brønd indeholdt 500 μL af semi-faste medier med følgende komponenter: opfyldthylcellulose, Matrigel, nikotinamid, exendin-4, activin βB, og konditioneres medier indsamlet fra murin ES celle-deriverede pancreas-lignende celler. Efter 8 til 12 dage af kultur,-insulin udtrykker Kolonier med karakteristisk morfologi blev dannet og kunne yderligere analyseres for bugspytkirtlen genekspression ved hjælp af kvantitativ RT-PCR og immunoflourescent farvning til at bestemme afstamning sammensætningen af hver koloni.
Sammenfattende giver vores koloni assay nemme påvisning og kvantificering af funktionelle stamceller inden for en heterogen population af celler. Desuden giver det semi-faste medier format ensartet præsentation af ekstracellulær matrix komponenter og vækstfaktorer til celler, der gør det muligt progenitorer til at formere sig og differentiere in vitro. Denne koloni analyse giver enestående muligheder for mekanistiske studier af pancreas stamceller på enkelt celle niveau.
Protocol
1. Differentiering af murine ES celler til bugspytkirtlen-lignende celler in vitro til at generere betinget medier (CM) for koloni assay
Procedurer for murin ES celle vedligeholdelse, har embryoid krop (EB) dannelse i suspension kultur og vedhæftede kultur for yderligere differentiering er tidligere blevet beskrevet 1-3 og er ikke i fokus i denne rapport. En skematisk præsentation af de trin, der er involveret i vores differentiering protokol er vist i figur 1.
For at opnå høj kvalitet conditioned medier, er det vigtigt først at generere 6-dages-gamle EB'er, hvor mindst 30-40% af dem er med en diameter på mindst 150 μm. De større EB'er skal indeholde mørke pletter under lysmikroskop, hvilket tyder på øget differentiering (Figur 2). Udvælgelse af høj kvalitet føtalt kalveserum (FCS) er afgørende for at skabe en sådan EBS. Høj kvalitet FCS partier er udvalgt baseret på deres evne til at understøtte differentiation af EBS i retning af insulin 1, glucagon og amylase 2A genekspression i de senere faser (dag 18-20) som påvist ved RT-PCR-analyse. Desuden er, når dagen-6 EB'er overført fra suspension kultur til fastgørelse kultur (ca. 80 til 100 EB'er per brønd i 6 vel plader) er det vigtigt at forsigtigt rotere plader for at samle den dag-6 EB'er ind i midten af brøndene. Af ukendte årsager, manøvrer, der øger celle-celle kontakter resultere i en bedre udvikling af pancreas-lignende celler fra EB'er i den efterfølgende vedhæftede fil dyrkningsfasen.
- På kultur Dag 13, erstatte den vedhæftede fil dyrkningsmedier (DMEM/F-12 (1:1), 15% knockout serum udskiftning, 2 mM L-glutamin, 50 U / ml penicillin, 50 mg / ml streptomycin) med frisk vedhæftet fil kultur medier containing10 mM nikotinamid, 0,1 nM exendin-4, og 10 ng / ml human rekombinant activin SSB (alle koncentrationer er endelig).
- På kultur dag 16, indsamle medierne fra trin 1,1 og filtreres gennem et 0,2 μm polyethereulfone membran. Fra dette punkt fremad de indsamlede medier vil blive omtalt som betinget medier (CM). Alikvot CM i 15 ml Falcon rør og opbevar det ved -80 ° C, indtil lige før halvfast kultur (se afsnit 3 nedenfor).
2. Indhentning af pancreas-lignende stamceller i single cellesuspension ved hjælp af en fluorescens aktiveret celle sorteringsanlæg
En knock-in murin ES cellelinie, der er udpeget 4 som Ngn3-EGFP, hvor EGFP reportergen erstattet en allel af de Ngn3 locus blev differentieret som tidligere beskrevet. 2 Ngn3 er en grundlæggende helix-loop-helix (bHLH), der indeholder transskription faktor . udtrykt ved pancreas endokrine stamceller under udvikling 5 Dag-16 kulturer var normalt sorteret for at opnå differentierede Ngn3-EGFP + og Ngn3-EGFP -. celler 1,2
- Dissociation af differentierede celler i en enkelt celle suspension.
- Inkubér dag-16 kulturer with 0,25% trypsin-EDTA (3 min, 37 ° C) til at løsne cellerne fra kultur brønde.
- Tilsæt 10% FCS at stoppe trypsin aktivitet.
- Vask cellerne med magnesium og calcium-fri fosfat-bufferet saltvand (PBS) indeholdende 0,1% bovint serumalbumin (BSA), og der centrifugeres ved 300 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og inkuber cellen klumper med 4 mg / ml collagenase B og 2000 U / mL deoxyribonuclease (DNase) Jeg (30 min, 37 ° C) til at producere en enkelt celle suspension. Brug en 1000 μL pipette at forstyrre cellen piller hver 10 min at fremskynde dissociation processen.
- Vask celler med PBS indeholdende 0,1% BSA, og centrifuger ved 300 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten og cellerne i PBS indeholdende 0,1% BSA.
- Forberedelse af celler til sortering.
- Tilsæt 2 μL DNase I (1 MU / ml) for hver ml cellesuspension at forhindre cell reaggregation under sorteringen.
- Før enkelt celle suspension gennem en 40 til 70 μm mESH at fjerne store celle-aggregater.
- Tilføj DAPI (1 mg / ml slutkoncentration) til enkelt celle suspension.
- Erhverve flowcytometri data på en celle sorteringsanlæg. En MoFlo MLS (Beckman Coulter) celle sorteringsanlæg blev brugt til denne rapport.
- Gating af cellepopulationer til sortering. Ngn3-EGFP + og Ngn3-EGFP - celler er gated først med Forward Scatter vs Side Scatter (figur 3A), efterfulgt af DAPI vs Side Scatter (figur 3B), pulsbredde vs Side Scatter (figur 3C), og endelig FL1 versus auto-fluorescens (Figur 3D). Den sidste slags port Ngn3-EGFP + celler er bevidst flyttet til højre (Figur 3E, pil) for at begrænse forurening af Ngn3-EGFP - celler under sortering. For negativ kontrol gating, enten dag-6 EB'er fra Ngn3-EGFP ES linje eller den samme scene, dag-16 kultur fra en ikke-transgene linje, som f.eks TL1 ES-celler (Figur 3D, venstre panel), kan bruges.
- Sorter Ngn3-EGFP + og Ngn3-EGFP
3. Plating sorteret celler til halvfast kultur
- Matrigel forberedelse.
- Alikvot de Matrigel til 1 ml pr rør og opbevares ved -20 ° C før brug.
- Frosne alikvoter bør anbringes ved 4 ° C natten over eller på is i 3 timer at tø lige før brug. Optøede portioner skal forblive på is under halvfast kultur præparat for at undgå resolidification.
- Methylcellulose løsning (3,3%) forberedelse.
Methylcellulose pulver ikke kan autoklaveres. For at opnå bakteriefrit methylcellulose løsning, bruge ren vejebåde og autoklaveres røre barer, bægre, kolber og anden hardware under forberedelsesprocessen.- En dag før methylcellulose løsning forberedelse, opbevare 200 ml sterilt dobbelt destilleret vand ved 4 ° C. Også forberede 500 ml 2x DMEM/F12 medier (forberede ved at opløse pulveriserede DMEM / F-12 i fordoblet destilleret vand) indeholder 100 E / ml penicillin og100 mg / ml streptomycin og opbevares ved 4 ° C.
- På dagen for methylcellulose forberedelse, tilsættes 500 ml sterilt dobbeltdestilleret vand til en 1000 ml glas bægerglas med et stykke aluminiumsfolie på toppen. Kog i mindst 30 minutter at befri vand af luftbobler.
- Placer en stor størrelse røre bar (mindst 3 inches i længden) i en 2000 ml glasflaske.
- Mål 300 ml kogende vand og overføre den til kolben.
- Kolben anbringes på en opsigt plade (uden opvarmning). Langsomt røre det varme vand for at undgå at skabe luftbobler.
- Afvejes 33 g methylcellulose pulver og meget langsomt føje den til varmt vand. Varmt vand er nødvendigt for at fugte methylcellulose pulver effektivt og støtte den efterfølgende opløsning i lave temperaturer.
- Fortsæt med at røre pulveret indtil temperaturen er reduceret til ca 40-45 ° C.
- Tilsæt 200 ml koldt sterilt dobbeltdestilleret vand til køling methylcellulose blanding. Straksefter, bør du begynde at se løsningen tur gennemsigtig og tyktflydende, hvilket indikerer, at methylcellulose er i opløsning i den vandige fase. Hånd der omrystes for at sikre, at løsningen er blandet grundigt.
- Tilsæt 500 ml koldt 2x DMEM/F12 medier. Fortsæt med at hvirvle i hånden for at blande.
- Kolben anbringes på en røre pladen i et kølerum, og langsomt omrøres methylcellulose løsning for 24-48 timer.
- Alikvot opløsningen i 125 ml pr opbevaring flaske, og opbevares ved -20 ° C. En prøve skal udleveres i en steril petridish og placeret i 37 ° C inkubator for at teste sterilitet. Optøede methylcellulose løsning kan opbevares i køleskabet i op til 2 måneder.
- Konditionerede medier forberedelse.
Optø CM (se afsnit 1) lige før brug. Hold CM på is i hele halvfast kultur forberedelse. - Forbered følgende vækstfaktorer: 1,0 M nikotinamid, 0,1 μM exendin-4, 10 mikrogram / ml rekombinant human activin βB, og 10 & mu g / mL VEGF-A. Opbevar nicotinamid og exendin-4 ved -20 ° C og activin βB og VEGF-A ved -80 ° C, og tø dem umiddelbart før brug. Alle halvfaste dyrkningsmedier komponenter skal opbevares på is i plating. Det skal bemærkes, at tilsætning af VEGF-A blev senere fundet ikke nødvendig for koloni dannelse. 2
- Føtalt kalveserum forberedelse. FCS skal være varme-inaktiveret før brug. Inkubér FCS i 30 minutter ved 56 ° C i et vandbad for at inaktivere et supplement til proteiner. Hvis den oprindelige FCS bestanden flaske ejer mere end 500 ml alikvot det ind i 125 ml hætteglas. Den øgede areal vil sikre en jævn og grundig opvarmning af hele mængden. Lad flasker afkøle ved stuetemperatur i mindst 1 time før opbevaring ved -20 ° C. Optøet FCS er 0.2μm filtreres før brug.
- Bland kultur komponenter med sorterede celler.
Hold celler og alle semi-faste medier komponenter på is under forberedelsen til enhver tid for at forhindre størkning afMatrigel. Alle leverancer, der kommer i kontakt med Matrigel herunder, skal pipettespidser, sprøjter og kanyler, være koldt. Placer disse forsyninger ved -20 ° C mindst en halv time før brug.- Bestem mængden af celler, der skal seedet per brønd i en 24-brønds plade. Op til 25.000 celler kan være belagt hver 24-godt. Man kunne udføre en titrering af celletæthed i indledende eksperimenter for at bestemme den optimale seeding celle nummer.
- Tilføj kultur komponenter til et 5 ml polystyren rør med snap låg i den rækkefølge, der er beskrevet i tabel 1 (bemærk at de celler tilsættes sidste for at undgå for tidlig stimulation). Tilsæt 3,3% methylcellulose til polystyren rør første og sorteres celler sidste. Bemærk, at 3,3% methylcellulose Løsningen skal udarbejdes og føjes til polystyren rør med en 16 ½ kanyle og et passende mærket gradueret sprøjte. Generelt For at rigtigt måle mængden af tyktflydende løsninger, såsom 3,3% methylcellulose solution og den endelige kultur blanding, er det vigtigt at aspirere nogle opløsning i sprøjten først, og derefter straks skubbe opløsningen ud for at presse luften. De 3,3% methylcellulose opløsning kan opvarmes til stuetemperatur, hvis det er for vanskeligt at trække ud. Men sikre, at det er afkølet på is, efter at det er hældes i polystyren rør og før tillæg af Matrigel.
- Plate den semi-faste medier, der indeholder sorteret celler.
- Efter at have sikret hætterne af polystyren rør er på plads, ryste rør ved hænderne energisk og grundigt. Luftbobler vil blive genereret i løbet af denne proces.
- Placer rørene på is i 5 minutter, eller indtil de små luftbobler overflade.
- Brug en 1 ml sprøjte med en 16 ½ eller 18 ½-gauge kanyle til at suge indholdet. Følg rådene i 3.6.2 til at drage præcise mængde af tyktflydende løsning uden luft i sprøjter.
- Langsomt dispensere 500 uL af medie i hver 24-godt. Brugden lave vedhæftede 24-godt plader alene. Tilføj medierne direkte til centrum af brønden. Den semi-faste medier vil automatisk spredt ud i brøndene. For hver eksperimentelle prøve, er quadruplicated brønde rutinemæssigt anvendes for at opnå statistisk signifikante resultater. Kun de 4 inderste søjler af en vandret orienteret 24-brønds plade anvendes til kultur. Fyld de resterende brønde med sterilt vand til hjælp befugtning af cellen, der indeholder kultur.
- Inkuber cellerne i 37 ° C og 5% CO 2 luft.
- Forsinket tilsætning af vækstfaktorer. Det er muligt at tilføje vækstfaktorer efter indledningen af kulturen. Sådanne manøvrer kan bruges til at behandle overlevelse virkninger af visse vækstfaktorer. Vækstfaktor løsninger op til 100 μL pr vel kan være dryppede via en 1 ml sprøjte med en 26 G 3 / 8 nål og lov til at diffunderer ind i semi-faste medier.
4. Observere koloni formation under lyset Microshåndtere
Cellerne skal observeres umiddelbart efter plating at sikre, at enkelte celler er tilfældigt og jævnt fordelt over hele ud af brøndene. Hvis de fleste af cellerne eller de resulterende kolonier er fordelt på marginen af boringerne, vil dette indikere, at afgive den halvfast medier i brøndene var for insisterende (se afsnit 3.7.4). På grund af den menisk effekt koloni massefylde ved tilknytning til kultur, brønde kan være højere end dem, der bor i centrum.
- Colony nummer kvantificering. På grund af den 3-dimensionelle element i medierne, vil kolonierne vises i forskellige fokuspunkter. Således kan en justering af fokus for hver koloni være påkrævet under observation af lys mikroskopi. Vedhæft et net i henhold til den 24-godt, når tælle for at undgå registrering af samme koloni to gange. Et gitter kan opnås ved at skære væggen i et NUNC petridish (Kat. No.169558). Et 10x objektiv på et lysmikroskop bør bruges til obs.Erve og tæl kolonierne.
5. Repræsentative resultater:
Tidligere eksperimenter har vist, at fra og med 2,5 x 10 5 murine R1 ES-celler (i 50 ml medier i alt) man kunne forvente at generere ca. 5000 passende størrelse dage-6 EBS. Den Ngn3-EGFP ES-celler var mindre effektiv; 4 gange flere celler, var forpligtet til at generere lignende mellemstore EB'er Efter 6 dage. Fordi 25 dage-6 EB'er indeholder et gennemsnit på 1,88 ± 0,67 x 10 5 celler, 1 ca 37,6 x 10 6 celler kan fås fra 5000 EBS. Under vedhæftet fil kultur cellerne forventes at ekspandere 2,72 ± 0,32 gange. 1 vil således 5000 dage-6 EB'er give cirka 100 x 10 6 dage 16 celler før sorteringen. Efter gating vil Ngn3-EGFP + celler udgør cirka 10% af den samlede dag-16 cellepopulation (protokollen tekstafsnit 2.2.5 og figur 3).
Eksempel på photomicrographs af insulin-udtrykkende kolonier afledt fra murine ES-celler er vist i figur 4. Disse kolonier har en karakteristisk morfologi, lille (~ 60-100 μm), runde kolonier med individuelle celler i kolonier, som er små, mørke, og ikke lys reflekterende. I vores tidligere publikation, afslørede 2 real-time RT-PCR og dobbelt immunofluorescent farvning af individuelt håndplukkede kolonier udtryk for insulin, C-peptid og glukagon. Disse resultater viser evne til enkelt Ngn3-EGFP + cellerne til at differentiere til celler, der indeholder mindst to holm hormoner samtidig, ligner primitive første bølge af lignende endokrine celler.
Kolonien assay for spredt enkelte celler gør det muligt at studere de forfædre, der har kapacitet til at indlede spredning og differentiering in vitro (figur 5). Det er således et forsøg, der kan måle den reelle funktion af de enkelte stamceller. De forfædre, der har capabiheden for at blive insulin-udtrykkende kolonier kaldes insulin-udtrykkende kolonidannende enheder (ICFUs) (Figur 5). Konsekvent til tanken om, at Ngn3 markerer endokrine stamceller i udviklingslandene bugspytkirtlen, 5 Ngn3-EGFP +, men ikke Ngn3-EGFP -. Celler fra MES celle-afledt populationer er beriget for ICFUs 2 Dog hyppigheden af disse forfædre er stadig lav, cirka 0,1% til 0,6% af det samlede Ngn3-EGFP + befolkning isoleret fra dag 16 kultur er ICFUs 2 Uanset, en klar forskel i kolonidannende effektivitet forventes, med Ngn3-EGFP + celler den højeste, efterfulgt af. presorted celler, og derefter Ngn3-EGFP - celler.
Figur 1. Tidslinje af in vitro-murine ES-celler differentiering til bugspytkirtlen-lignende celler. For conditioned medier (CM) generation, murine ES CELls dyrkes i suspension med 15% FCS for de første seks dage med faldende doser af monothioglycerol (6,0 x 10 -3 M for de første to dage og 6,0 x 10 -4 M for de følgende fire dage) til at generere EBS. Dag-6 EB'er (80-100 per brønd) er derefter overført til fastgørelse 6-godt retter indeholder 15% knockout serum udskiftning. 5% FCS kan tilføjes mellem dage 6-10 af kulturen at fremskynde udlæg i EBS. Nikotinamid, er exendin-4, og menneskelige rekombinante activin βB derefter tilføjet af medierne om kultur dag 13 (se afsnit 1.1). Medier er indsamlet på kultur dag 16, og på dette tidspunkt er blevet betinget medier. Dag 16 celler bliver derefter sorteret og belagte ind halvfaste medier til koloni analysen.
Figur 2. Repræsentant photomicrograph af store dag-6 embryoid organer stammer fra murine embryonale stamceller. Ideel dag-6 EB'er er mindst 150 ìm i diametereter og har formørket centre (pile). Angivelse af tidlige pancreas progenitor markører (f.eks PDX-1 og Sox9) er forbedret i disse EBS (data ikke vist). 3
Figur 3. Sortering porte for MES celle-afledte dag-16 Ngn3-EGFP udtrykker celler. (A) Forward og side scatter porte, vejledende af celle størrelse og granularitet henholdsvis fjerne ikke-celleaffald. (B) DAPI bruges til at identificere døde celler, der vil blive plettet positiv, når spændt på 405-413 nm og emission detekteres med en 450/40 filter. (C) Impulsbredde, bredden af den elektroniske Forward Scatter puls, afslører dubletter, som bør fjernes, inden de føres videre gennem fluorescens aktiveret celle sorter. (D) Indløbs af EGFP (kanal FL1) versus autofluorescens hjælp døgnet-16 celler fra et kontrolrum forældrenes cellelinie såsom TL1 (venstre panel) lyser sande fluorescens og dermed Ngn3-EGFP <sup> + cellepopulation (højre panel). (E) Rød pil viser manuel højre shift af EGFP + gate lige før sortering for at øge adskillelse af falsk positive celler. Begivenheder i både (D) og (E) er gated baseret på regioner (R1 - R3) vist i (AC).
Figur 4. Repræsentant mikrofotografier af insulin-udtrykkende kolonier i halvfast kultur. Kolonier er tilfældigt fordelt og fremstår som små mørke, ikke lys reflekterende klynger. Individuelle kolonier senere kan analyseres for gen-og protein udtryk ved RT-PCR og immunhistokemi analyser, henholdsvis (ikke vist, se video).
Figur 5. En koloni analyse, der giver funktionelle og kvantitative vurderinger af enkelte stamceller. Tælling af den resulterende kolonier bruges til at beregne frequency af stamceller blandt det samlede belagte celler. Sammensætningen af celler i hver koloni er betegnende for den slægt potentiale indlede stamfader. Ved hjælp af denne analyse fandt vi, at Ngn3-EGFP + celler fra murine embryonale stamceller blev beriget for insulin-udtrykkende kolonidannende enheder (ICFUs), stamceller, der har evnen til at differentiere til insulin-udtrykkende kolonier. 2
Tabel 1. Halvfast Kultur Media Components og kendelse af Addition.
Discussion
Koloni analyser, der tillader kvantitative og funktionelle vurderinger af de enkelte pancreas stamceller har været begrænset indtil videre, hvilket i høj grad vanskeliggjort fremskridt i undersøgelserne af pancreas stamceller og stamceller biologi. Essensen af en koloni analysen er, at den måler den iboende evne til stamceller, snarere end blot deres fænotype, hvilket giver funktionalitet og slægt potentialer af stamceller, der skal overholdes. Det er også et kvantitativt værktøj, der kan bestemme antallet af stamceller i en given befolkning. I hæmatopoietisk stamcelle område har koloni analyser spillet en vigtig rolle i identifikation, samt at dechifrere de vækstfaktor krav, interaktioner, og mekanismer for slægt engagement af disse celler. 6 I området af pancreas stamceller biologi, pancreas orgel 7 , 8 eller bulk kulturer 9-13 er blevet udarbejdet, dog, at sådanne analyser ikke løse biologiske Questions på enkelt celle niveau. Uden enkelt celle analyser, kan eksistensen af multi-potentiale pancreas stamceller / stamceller ikke bevises entydigt. 14
Her viser vi, at insulin-udtrykkende kolonidannende stamceller kan analyseres ved hjælp af en tre-dimensionel, Matrigel-holdige, halvfast kultur system. Selv om en suspension kultur-system 15,16 er blevet udviklet, som tillader en enkelt voksen bugspytkirtlen progenitorer til at formere sig og differentiere sig til "pancreatospheres", vores koloni-analysen giver ekstra fordele. Først, vores halvfast dyrkningsmedier system tillader plettering på op til 25.000 sorteret celler pr 500 μL dyrkningsmedier hver 24-godt, samtidig med at den resulterende koloni dannelse i det lineære område. 2 I modsætning hertil suspension pancreatosphere analysen kræver brug af en enkelt celle deposition metode fra cellen sorteringsanlæg til at tillade enkelt celle analyser, og dermed en større volumen af dyrkningsmedier og inkubator pladser påkrævet. Derfor er vores koloni analysen er forholdsvis let og omkostningseffektivt at gennemføre når et stort antal forskellige celler skal sammenlignes samtidig for stamcelle-aktiviteter. For det andet, vores halvfast medier giver mulighed for ensartet fordeling af ekstracellulær matrix komponenter og vækstfaktorer, hvilket giver mulighed for både spredning og differentiering at forekomme i den samme kilde. I modsætning hertil er det mere vanskeligt at give et sådant miljø, især matrix, til celler i suspension kultur. Vi er klar over, at vi med vores metode, kan det ikke endeligt bevist, at hver koloni stammer fra en enkelt celle, som to stamceller kan være tilfældigt placeret i nærheden af hinanden og danne en koloni. Dog kan dette problem løses ved sekundær analyse hjælp enkelt celle manipulation. Direkte hånd-picking af sorterede enkelte celler vil kunne endeligt demonstrere enkelt celle oprindelse hver koloni.
Sammenfattende insulin-udtrykkende kolonidannende aktivitet af progenitors i semi-faste medier beskrevet heri giver enestående muligheder for mekanistiske studier af bugspytkirtlen forfædre på enkelt celle niveau. For eksempel har vi i en forudgående rapport fandt, at tilsætning af Matrigel, en rå blanding af ekstracellulære matrix proteiner, ind i kulturen medier er nødvendig for dannelsen af insulin-udtrykkende kolonier fra Ngn3-EGFP + celler, 2 tyder på den ekstracellulære matrix er vigtigt for dem, stamceller. Ved hjælp af denne koloni assay, bliver det nu muligt yderligere at dissekere og definere specifikke matrix krav til en sådan aktivitet. Ud over at studere progenitorer afledt af muse embryonale stamceller, er vi i øjeblikket undersøger, om dette in vitro-systemet understøtter også dannelsen af andre karakteristiske kolonier afledt af bugspytkirtel og lever af perinatal og voksne mus, såvel som fra menneske cadaveric bugspytkirtlen væv blottet af holme.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Klaus Kaestner for den gave murine Ngn3-EGFP embryonale stamceller linje, fru Lucy Brown og Analytisk cytometri Core for at få hjælp i celle sortering. Dette arbejde blev finansieret delvist af NIH tilskud R21DK069997 og R01DK081587 tildeles HTK og fra California Institute for regenerativ medicin (CIRM) uddannelse tilskud til MW og LS
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1X DMEM/ F-12 (1:1) | Mediatech, Inc. | 15-090-CV | |
| Fetal Calf Serum | Tissue Culture Biologicals | 201 | Refer to Section 1.1 |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| 1X Dulbecco’s PBS | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | 7.5 % |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Reduced Growth Factor |
| Methylcellulose | Sinetsu Chemical | 1,500 centipoise (high-viscosity) | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| Human Recombinant Activin βB | R&D Systems | 659-AB-025 | |
| Exendin-4 | Sigma-Aldrich | E7144 | |
| Human Recombinant VEGF-A | R&D Systems | 293-VE-010 | |
| 24-well plates | Costar | 3473 | Ultra-low Attachment |
| 60mm Petri Dish with Grid | Nalge Nunc international | 169558 |
References
- Ku, H. T. Committing embryonic stem cells to early endocrine pancreas in vitro. Stem cells. 22, 1205-1217 (2004).
- Ku, H. T. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Chen, C. Characterization of an in vitro differentiation assay for pancreatic-like cell development from murine embryonic stem cells: detailed gene expression analysis. Assay. Drug. Dev. Technol. 9, 403-419 (2011).
- Lee, C. S., Perreault, N., Brestelli, J. E., Kaestner, K. H. Neurogenin 3 is essential for the proper specification of gastric enteroendocrine cells and the maintenance of gastric epithelial cell identity. Genes. 16, 1488-1497 (2002).
- Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Gittes, G. K., Galante, P. E., Hanahan, D., Rutter, W. J., Debase, H. T. Lineage-specific morphogenesis in the developing pancreas: role of mesenchymal factors. Development. 122, 439-447 (1996).
- Miralles, F., Battelino, T., Czernichow, P., Scharfmann, R. TGF-beta plays a key role in morphogenesis of the pancreatic islets of Langerhans by controlling the activity of the matrix metalloproteinase MMP-2. J. Cell. Biol. 143, 827-836 (1998).
- Bonner-Weir, S. In vitro cultivation of human islets from expanded ductal tissue. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 7999-8004 (2000).
- Gao, R. Characterization of endocrine progenitor cells and critical factors for their differentiation in human adult pancreatic cell culture. Diabetes. 52, 2007-2015 (2003).
- Gao, R., Ustinov, J., Korsgren, O., Otonkoski, T. In vitro neogenesis of human islets reflects the plasticity of differentiated human pancreatic cells. Diabetologia. 48, 2296-2304 (2005).
- Suarez-Pinzon, W. L., Lakey, J. R., Brand, S. J., Rabinovitch, A. Combination therapy with epidermal growth factor and gastrin induces neogenesis of human islet beta-cells from pancreatic duct cells and an increase in functional beta-cell mass. J. Clin. Endocrinol. Metab. 90, 3401-3409 (2005).
- Hao, E. Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas. Nature Medicine. 12, 310-316 (2006).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Seaberg, R. M. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nature Biotechnology. 22, 1115-1124 (2004).
- Rovira, M. Isolation and characterization of centroacinar/terminal ductal progenitor cells in adult mouse pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 75-80 (2010).
