Summary
Este vídeo fornece um protocolo detalhado para o estudo do perfil farmacológico dos direitos humanos TRPA1 canais usando FlexStation 3. O protocolo abrange detalhes de preparação das células, carregando corante e operação do leitor de microplacas, FlexStation 3.
Abstract
FlexStation Dispositivos Molecular '3 é uma bancada modo multi-leitor de microplacas capaz de medição de fluorescência automatizado em multi-lamelas. É ideal para empresas de médio a alto rendimento telas em ambientes acadêmicos. Ele tem um módulo de transferência integrada de fluido equipado com uma pipeta multi-canal ea máquina lê uma coluna de cada vez para monitorar as mudanças de fluorescência de uma variedade de reagentes fluorescentes. Por exemplo, FlexStation 3 tem sido usado para estudar a função de Ca 2 +-permeável canais iônicos e G receptores acoplados à proteína, medindo as mudanças de livre intracelular Ca 2 + níveis. Transiente potencial receptor (TRP) canais são uma grande família de canais de comunicação não-seletivos que desempenham papéis importantes em muitas funções fisiológicas e fisiopatológicas. A maioria dos canais de cálcio TRP são permeáveis e induzir o influxo de cálcio na ativação. Neste vídeo, demonstramos a aplicação de FlexStation 3 a estudar o perfil farmacológico do canal TRPA1, um sensor molecular para inúmeros estímulos nocivos. HEK293 células transitoriamente ou expressando estavelmente humana TRPA1 canais, cultivadas em placas de 96 poços, são carregados com um Ca 2 + sensíveis ao corante fluorescente, Fluo-4, e em tempo real as mudanças de fluorescência nessas células são medidos antes e durante a aplicação de um agonista TRPA1 usando o modo FLEX do FlexStation 3. O efeito de um antagonista TRPA1 putativa também foi examinada. Dados são transferidos do software Pro SoftMax para construir relações concentração-resposta de TRPA1 ativadores e inibidores.
Protocol
1. Preparações de células em placas de 96 poços
Para HEK293 células transitoriamente trasfected com TRPA1 humana cDNA
- HEK293 células são cultivadas para 1-2 dias em meio mínimo essencial de Dulbecco (DMEM), contendo 4,5 glicose mg / ml (Thermo Scientific, SH3002201), suplementado com inativado pelo calor de 10% de soro fetal bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unidades / ml de penicilina e estreptomicina 50 mg / ml (Invitrogen, 15140-163). No dia da transfecção, a densidade celular deve chegar a 70-90%.
- Casaco de placas de 96 poços pipetando 50 ul poli-L-ornitina (Sigma P3655, 20 mcg / ml em água destilada estéril) a cada poço e incubar a 37 ° C por pelo menos 15 min. Enxágüe bem cada vez com fosfato Dulbecco Buffered Saline (DPBS) sem Mg 2 + e Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). A placa pode ser deixado na capa de cultura de células por algumas horas.
- Para cada poço de uma placa de 96 poços, diluir em um tubo Eppendorf de 1,5 ml 0,2 mg em 25 mL de cDNA OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Escala até proporcionalmente de acordo com o número de poços a serem transfectadas pelo cDNA mesmo. Também diluir em um de 1,5 ml Eppendorf separados Lipofectamine tubo de 0,4 mL de 2000 (Invitrogen, 11668-019) em 25 mL OPTI-MEM para cada poço a ser transfectadas. Escala esta de acordo com o número total de poços a serem transfectadas.
- Brevemente vórtice de 2000 cDNA diluído e Lipofectamine e deixá-los sentar-se à temperatura ambiente por cerca de 5 min.
- Transferência de um volume igual do Lipofectamine diluída 2000 para o tubo que contém as diluída vortex, cDNA e deixe a mistura descansar em temperatura ambiente por 15 min a 2 horas. Durante este tempo, transfira o cDNA / 2000 Lipofectamine mistura de 49 mL / poço da placa poli-L-ornitina revestido.
- Trypsinize o HEK293 células (Passo 1.1), contagem de densidade celular utilizando um hemocitômetro ou Condessa contador de células automatizado (Invitrogen, C10227), e transferência de uma quantidade desejada de células (geralmente cerca de ~ 125,000-150,000 células / poço) para uma solução estéril de 15 ml cônico-bottom tubo de centrifugação. Centrifugar a 1000 RPM x por 5 min. Ressuspender as células em ~ 1,250,00-1,500,000 células / ml no meio de cultura DMEM, suplementado com 10% inativado pelo calor soro fetal bovino, mas sem antibióticos.
- Dispense 98 mL suspensão celular a cada poço que contém o cDNA-Lipofectamine 2000 mistura usando uma pipeta multicanal ou o Dispenser Microplate micropartículas (Bio-Tek). Deixe a placa de sentar-se na capa de pelo menos 30 minutos antes de colocá-lo à cultura de células umidificado incubadora. Incubar a 37 ° CO C, 5% 2 para 20-44 hrs.
Para HEK293 células expressando estavelmente TRPA1
- Siga o passo 1,2 para revestir placas de 96 poços.
- A linha induzível HEK293-hTRPA1 celular foi generosamente fornecida pelo Dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) e mantidos no mesmo meio como o tipo selvagem HEK293 células (Passo 1.1), mas suplementado com 5 mg / ml blasticidin (Invitrogen, A1113902) e 50 mg / ml higromicina B (Invitrogen, 10687010). Quando a densidade de células atinge cerca de 90%, trypsinize células, contagem e densidade das células, e centrifugar a quantidade desejada de células em 1000 x RPM por 5 min. Ressuspender as células em uma densidade de aproximadamente 1.000.000 células / ml no mesmo meio de cultura suplementado com doxiciclina (Fisher, BP26535, 0,25 mg / ml).
- Dispensar a suspensão de células poli-L-ornitina placas revestidas em 100 l / poço usando uma pipeta multicanal ou a micropartículas (Bio-Tek). Deixe a placa de sentar-se na capa de pelo menos 30 minutos antes de colocá-lo à cultura de células umidificado incubadora. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 para 16-24 hr.
2. Soluções
- Solução de Hank sal tamponado (HBSS) é usado como a solução extracelular. Ele contém (em mM): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44
KH 2 PO 4, 1,3 CaCl 2, MgSO 4 1,0, 1,0 MgCl 2, 10 de glicose, 10 HEPES, com pH ajustado para 7,4 com NaOH 1N). - Fluo-4 tampão de ensaio contém 2 mM probenecide, em HBSS. Fazer 250 mM de ações probenecida (Sigma, P8761) em 0,5 N NaOH. Diluir a HBSS na proporção de 1:125. Reajuste pH a 7,4 usando HCl 1 N.
3. Carregar celular com Fluo-04:00
- Dissolver 1 mg Fluo-04:00 (Invitrogen, F14202) em 912 mL DMSO anidro para fazer uma solução estoque de 1 mM. A Fluo-4:00 solução estoque pode ser armazenado a -20 ° C durante pelo menos um mês.
- Mix 10 mM 1 ml Fluo-04:00 com 10 mL PLURONIC F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) em solução de DMSO) e depois transferir todo o conteúdo de 5 ml tampão de ensaio Fluo-4 (Passo 2.2) suplementado com 0,1% albumina bovina (Sigma, A9418).
- Lave as células cultivadas em placas de 96 poços (Passo 1.7 ou 1.10) com HBSS a 80 mL / poço duas vezes usando um lavador de microplacas (como ELx405TM de Bio-Tek).
- Adicione o Fluo-4 AM carregamento solução (Passo 3.2) a 50 mL / poço usando uma pipeta multicanal ou a micropartículas (Bio-Tek) e incube a placa a 37 ° C por 1 hora.
- Lave as células 3 vezes com o tampão de ensaio Fluo-4 (Passo 2.2.) Utilizando o lavador de microplacas ELx405TM. Após a última lavagem, deixar 80 l do tampão Fluo-4 do ensaio em cada poço.
4. Preparação do prato composto
- Durante o período de uma célula de carga hr, preparar uma série de diluições 3x de agonistas (ou antagonistas) de 3x da concentração final desejada no buffer Fluo-4 ensaio.
- Pipeta 250-300 mL das soluções diluídas composto de um prato composto de 96 poços. Providenciar para que as diluições de série de um composto e os controles positivos e negativos correspondentes na mesma coluna da placa composto sempre que for possível porque FlexStation 3 lê uma única coluna de cada vez.
5. Leitura da placa em três FlexStation
- Ligue o sistema (FlexStation 3, computador, eo software SoftMax Pro 5.2)
- Salvar o experimento com um novo nome de arquivo. No set-up, escolher o modo de FLEX e digite os seguintes valores:
Protocolo n º 1, efeito agonista 
Protocolo n º 2, efeito antagonista 
- Coloque uma caixa nova ponta, prato composto ea placa de leitura para as bandejas apropriadas em FlexStation 3 e clique em "ler" botão. O FlexStation 3 vai ler uma coluna de cada vez e adicione compostos nos pontos de tempo pré-programado, sem interromper a leitura. Demora cerca de 3 min (5 min para o Protocolo n º 2) para terminar de ler uma coluna ea máquina irá continuar a ler a próxima coluna composto com adições realizadas como programado pelo usuário no passo 5.2 até que todas as colunas são lidas.
6. Análise de dados
- Dados experimentais podem ser processados diretamente usando a SoftMax Pro 5.2 software ou copiado e colado em qualquer programa de planilha eletrônica, como Microsoft Excel. Curva de concentração-resposta de um ácido flufenâmico TRPA1 agonista (FFA) é construído usando a rotina de montagem seguintes mínimos quadrados.
, Onde Y é a resposta observada, Y max é a resposta normalizada máxima, C é a concentração do medicamento correspondente, EC 50 é a concentração que provocou uma resposta meia-máxima, e n H é o coeficiente de Monte aparente. Concentração de inibição da curva para um composto antagonista do suposto TRPA1 A é obtida utilizando uma concentração fixa de FFA (100 mM), e, progressivamente, aumentando a concentração do composto A. IC 50 valor do composto A é calculado pelo ajuste dos mínimos quadrados para o seguinte equação. 
, Onde Y é a resposta observada e Y max é normalizado pico de resposta, [Ant] é o composto correspondente A concentração, o IC 50 é a concentração antagonista que produz metade máxima inibição da FFA evocadas resposta, e n H é o monte aparente coeficiente.
, Onde Y é a resposta observada, Y max é a resposta normalizada máxima, C é a concentração do medicamento correspondente, EC 50 é a concentração que provocou uma resposta meia-máxima, e n H é o coeficiente de Monte aparente. Concentração de inibição da curva para um composto antagonista do suposto TRPA1 A é obtida utilizando uma concentração fixa de FFA (100 mM), e, progressivamente, aumentando a concentração do composto A. IC 50 valor do composto A é calculado pelo ajuste dos mínimos quadrados para o seguinte equação. 
, Onde Y é a resposta observada e Y max é normalizado pico de resposta, [Ant] é o composto correspondente A concentração, o IC 50 é a concentração antagonista que produz metade máxima inibição da FFA evocadas resposta, e n H é o monte aparente coeficiente. 7. Resultados representativos:
TRPA1 é um canal de Ca 2 + cátion-permeável, a activação do que leva a influxo de cálcio que pode ser detectado pelo Ca 2 + sensíveis ao corante, Fluo-4 (1-2). A linhagem de células-HEK293 hTRPA1 estável foi usado para estudar as relações concentração-resposta de TRPA1 agonistas e antagonistas. Células foram carregadas com Fluo-04:00, colocados em 80 mL do tampão de ensaio, e ler usando FlexStation 3. Depois de gravar a fluorescência de base por 30 s, 40 mL de uma diluição em série do agonista TRPA1, FFA, cada um em 3x de a concentração desejada final, foram adicionados às células através de uma pipeta multi-canal incluído como parte do módulo de fluidos de FlexStation 3. As mudanças de fluorescência foram monitorados por mais 180 s. As mudanças em relação Fluo-4 fluorescência para cada poço foram expressos como ΔF = (F - F 0), onde 0 F e F são valores de fluorescência no momento de interesse eo início da leitura, respectivamente. Traços representante dos cursos tempo para mudanças de fluorescência em resposta a uma série de concentrações de FFA são mostrados na fig. 1. Nota para os últimos quatro concentrações de AGL, embora os níveis de resposta máxima são semelhantes, a cinética de ativação é claramente mais rápido no ponto mais alto do que na menor concentração de AGL. Portanto, para distinguir estas diferenças, a concentração - relação de resposta foi construída através da medição da taxas iniciais (inclinação) do aumento de fluorescência com a adição de concentrações variadas de FFA (Fig. 2). O efeito máximo meiaive concentração (EC 50) de AGL foi determinada como sendo 55,4 mM (n = 3). Para testar o antagonista TRPA1 putativo, composto A, que realizou um experimento similar, usando o protocolo de número 2 (Passo 2). Neste caso, uma série de diluições do antagonista foram adicionados em 30 s (40 mL de 3x desejado concentrações finais) eo FFA foi adicionado 180 s mais tarde (60 mL em 300 M para uma concentração final de 100 mM). Composto A dose-dependente reduziu a resposta da TRPA1 células para FFA com uma concentração máxima meia inibitória (IC 50) de 4,3 mM (n = 3) (Fig. 2).
Figura 1. Activação dependente da concentração de TRPA1 humanos por FFA. Traços são aumentar FFA evocadas de fluorescência ao longo do tempo (respostas só nos primeiros 60 s são mostradas para ilustrar melhor a cinética rápida das respostas evocadas FFA). Por favor note que em concentrações mais elevadas FFA evocado aumento de fluorescência com um. Muito mais rápido do que cinética em concentrações mais baixas, embora os níveis de pico de fluorescência foram semelhantes
Figura 2 Concentração -. Relacionamentos resposta para FFA mudanças induzidas pelo fluorescência e composto A-induzida inibição da resposta em FFA TRPA1 humano de forma estável, expresso em HEK293 células. Δ, a concentração - relação de resposta de AGL foi determinada pela medição da taxa inicial (inclinação) do aumento de fluorescência normalizada com a adição de diferentes concentrações de AGL. O, concentração-resposta relação de inibição da FFA-resposta evocada por um antagonista do cálcio TRPA1 putativo, composto A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ca 2 + intracelular desempenha um papel importante em muitas condições fisiológicas e patológicas, como a liberação de neurotransmissores (3), potencial de ação cardíaco (4), a contração da célula muscular (5), transdução de sinal celular (6-7), e morte celular excitotoxic ( 8). Medição de Ca 2 + intracelular níveis ajuda a elucidar as alterações funcionais de Ca 2 +-permeável canais na membrana plasmática ou organelas intracelulares ea contribuição de
Ca + 2 para os processos acima (9-13). O ensaio também pode ser usado para investigar a função da proteína G-receptores acoplados, muitas das quais, após a ativação, levam a um aumento intracelular livre Ca 2 + concentrações, liberando Ca 2 + intracelular de Ca 2 + lojas ou ativar outros Ca 2 + permeável canais de íon (14-16). FlexStation 3 faz uso de Ca 2 + corantes sensíveis, que dão origem a um aumento da intensidade de fluorescência, ou mudanças raciométrica, com o aumento da concentração de Ca 2 + intracelular. Este artigo vídeo demonstra a aplicação de FlexStation 3 no estudo de Ca 2 +-permeável TRPA1 canais heterologously expressa em HEK293 células. Embora tenhamos utilizado placas de 96 poços para a demonstração, os usuários podem escolher facilmente a partir de 96 - ou 384 poços formato de placa, alternando o pipetters dispensação (8 - ou 16 canais). Este teste fornece um meio rápido para alta capacidade de throughput screening de agonistas e / ou antagonistas e é aplicável a muitos outros canais de Ca 2 +-permeável de íons. No entanto, deve-se notar que ensaio de cálcio intracelular é uma medida indireta de atividades canal iônico. Detalhados estudos de seguimento utilizando gravações patch clamp para medir diretamente a corrente iônica flui através da membrana celular ainda são necessários para tirar conclusões apropriadas.
Para obter uma qualidade de dados confiáveis, as seguintes precauções devem ser tomadas:
- Para as células frouxamente aderente, como HEK293 células, protegendo as placas é essencial. No entanto, para células fortemente aderente, como Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células HeLa, revestimento não é necessária.
- É importante que a mesma quantidade de células são semeadas em cada poço da placa de multi-bem e da densidade de células em cada poço deve estar entre 90-100% confluência no momento do ensaio.
- Suavemente dispensar líquido para as células e evitar perturbar as células durante o carregamento e lavagem das células.
- Probenecida é adicionada para evitar infiltração de corante. No entanto, como probenecida também tem efeito sobre alguns canais de íons, o cuidado deve ser tomado ao interpretar os dados obtidos a partir de experimentos que incluem probenecida no buffer de ensaio.
- Para determinar as concentrações de compostos no prato composto, considere o factor de diluição para cada bem de acordo com o volume de tampão no poço correspondente da placa de amostra antes e após a adição composto.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos a drs. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris e Olga Chumakova pelo seu apoio. O FlexStation 3 sistema faz parte do Mecanismo de imagem UTHSC Cytodynamic. Agradecemos também os drs. Ardem Patapoutian e Michael Bandell do Scripps Research Institute e Instituto de Genômica da Novartis Research Foundation (GNF) para fornecer a linha de células-HEK293 hTRPA1 estável. A pesquisa é financiada em parte por concessões do NIH (GM081658 para MXZ) e Texas Medical Center Digestive Diseases Center (para HH) e Missão Connect / TIRR Foundation (para HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).
- Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons. Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).
- Mason, S. A., MacLeod, K. T. Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females. Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).
- Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline. Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).
- Alagarsamy, S., Johnson, K. M. Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS. Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).
- Su, L. T. TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain. J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).
- Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury. J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).
- George, J. Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons. J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).
- Price, K. L., Lummis, S. C. FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems. J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).
- Laude, A. J. Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors. Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).
- Marincsak, R. The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1. Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).
- Xie, X. Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol. 5, 191-203 (2007).
- Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).
- Boulay, G. Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein. J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).
- Nanda, K. Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter. Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).
