Summary
Это видео содержит подробный протокол для изучения фармакологического профиля человека TRPA1 каналов с использованием FlexStation 3. Протокол охватывает детали клеточного подготовки, краситель загрузки и эксплуатации микропланшетов читателя, FlexStation 3.
Abstract
FlexStation Molecular Devices '3 представляет собой настольный многорежимный планшет ридер, способный автоматизированного измерения флуоресценции в мульти-луночных планшетах. Он идеально подходит для средней и высокой пропускной способностью экраны в академических условиях. Она имеет интегрированный модуль передачи жидкости оснащены многоканальным pipetter и машина читает одну колонку в то время, контролировать изменения флуоресценции различных флуоресцентных реагентов. Например, FlexStation 3 был использован для изучения функции Са 2 +-проницаемые ионные каналы и G-белком рецепторы, измеряя изменения внутриклеточного свободного Са 2 + уровня. Переходный рецепторный потенциал (ГТО) каналы большое семейство неселективных каналов катионов, которые играют важную роль во многих физиологических и патофизиологических функций. Большинство каналов ГТО являются кальций проницаемыми и вызывают приток кальция после активации. В этом видео, мы демонстрируем применение FlexStation 3 до исследования фармакологических профиля TRPA1 канал, молекулярный сенсор для многочисленных вредных раздражителей. НЕК293 временно или стабильно выражения человеческих TRPA1 каналов, вырос в 96-луночных планшетах, которые загружаются с Са 2 +-чувствительного флуоресцентного красителя, Fluo-4, и в реальном времени флуоресценции изменения в этих клетках измеряются до и во время применения TRPA1 агонист используя режим FLEX из FlexStation 3. Влияние предполагаемых TRPA1 антагонист был также рассмотрен. Данные передаются из программного обеспечения SoftMax Pro построить концентрация-ответ отношения TRPA1 активаторов и ингибиторов.
Protocol
1. Сотовые препаратов в 96-луночных
Для НЕК293 временно trasfected с человеческими TRPA1 кДНК
- HEK293 клетки выращивают в течение одного-двух дней в минимальной необходимой среде Дульбекко (DMEM), содержащих 4,5 мг / мл глюкозы (Thermo Scientific, SH3002201), с добавлением 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (Invitrogen, 16000-044), 50 единиц / мл пенициллина, 50 мкг / мл стрептомицина (Invitrogen, 15140-163). В день трансфекции, плотность клеток должна достигнуть 70-90%.
- Шерсть 96-луночных планшетах с помощью пипетки 50 мкл поли-L-орнитин (Sigma P3655, 20 мкг / мл в стерильной дистиллированной воды) в каждую лунку и инкубации при температуре 37 ° C в течение 15 мин. Промыть каждую лунку сразу с фосфатом Дульбеко буферного раствора (DPBS) без Mg 2 + и Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). Пластины могут быть оставлены в капот культуре клеток в течение нескольких часов.
- Для каждой скважины 96-луночного планшета, развести в 1,5 мл Eppendorf трубки 0,2 мкг кДНК в 25 мкл OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Масштабирование пропорционально в зависимости от количества скважин для трансфекции одним и тем же кДНК. Кроме того, разбавленный в отдельной 1,5-мл Eppendorf трубки 0,4 мкл Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) в 25 мкл OPTI-MEM для каждой скважины для трансфекции. Шкала это вверх в зависимости от общего количества скважин для трансфекции.
- Кратко вихрь разбавленный кДНК и Lipofectamine 2000 года, и пусть они сидят при комнатной температуре в течение примерно 5 мин.
- Передача равным объемом разбавленной Lipofectamine 2000 по трубке, которая содержит разбавленный кДНК, вихревые и дайте смеси сидеть при комнатной температуре в течение 15 мин до 2 часов. За это время, трансфер кДНК / Lipofectamine 2000 смеси при 49 мкл / лунку для поли-L-орнитин покрытием пластины.
- Trypsinize НЕК293 (шаг 1.1), число клеток плотности с помощью гемоцитометра или графиня автоматизированных счетчик клетки (Invitrogen, C10227), и передачи необходимого количества клеток (в целом около ~ 125,000-150,000 клеток / лунку) в 15-мл стерильного конической нижней центрифуге трубки. Центрифуга при 1000 RPM х в течение 5 мин. Ресуспендируют клетки при ~ 1,250,00-1,500,000 клеток / мл в культуральной среде DMEM, с добавлением 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, но без антибиотиков.
- Внесите 98 мкл суспензии клеток в каждую лунку, содержащую кДНК-Lipofectamine 2000 смеси с использованием pipetter многоканальным или диспенсер MicroFill микропланшетов (Bio-Tek). Пусть пластинка сидеть в капот, по крайней мере 30 минут прежде, чем поместить его на увлажненный культуре клеток инкубатора. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 для 20-44 часов.
Для НЕК293 стабильно выражения TRPA1
- Выполните шаг 1,2, чтобы покрыть 96-луночных планшетах.
- Индуцибельной HEK293-hTRPA1 клеточная линия была любезно предоставлена д-ром А. Patapoutian (Scripps Research Institute) и поддерживается в той же среде, как дикого типа НЕК293 (шаг 1.1), но с добавлением 5 мкг / мл blasticidin (Invitrogen, A1113902) и 50 мкг / мл гигромицину B (Invitrogen, 10687010). Когда плотность клеток достигает примерно 90%, trypsinize клеток, число клеток плотности и центрифуги необходимое количество клеток при 1000 RPM х в течение 5 мин. Ресуспендируют клетки с плотностью ~ 1 млн клеток / мл в той же среде культуры дополнена доксициклин (Fisher, BP26535, 0,25 мкг / мл).
- Внесите суспензии клеток с поли-L-орнитин покрытием пластин при 100 мкл / лунку использованием pipetter многоканальным или MicroFill (Bio-Tek). Пусть пластинка сидеть в капот, по крайней мере 30 минут прежде, чем поместить его на увлажненный культуре клеток инкубатора. Инкубировать при 37 ° C, 5% СО 2 в течение 16 - 24 час.
2. Решения
- Буферизованный солевой раствор Хэнка (HBSS) используется как внеклеточный раствор. Он содержит (в мм): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44
KH 2 PO 4, 1,3 2 CaCl, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 глюкозы, 10 HEPES, с рН до 7,4 использованием 1N NaOH). - Fluo-4 буфером содержит 2 мМ пробенецид в HBSS. Сделать 250 мМ фондовом пробенецид (Sigma, P8761) в 0,5 N NaOH. Развести в HBSS в соотношении 1:125. Отрегулировать рН до 7,4 с использованием 1 N HCl.
3. Сотовые нагрузки с Fluo-4 утра
- Растворите 1 мг Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) в 912 мкл безводного диметилсульфоксида, чтобы сделать запас раствора 1 мМ. Fluo-4 утра исходный раствор может храниться при температуре -20 ° С в течение не менее одного месяца.
- Смешать 10 мкл 1 мМ Fluo-4 утра по 10 мкл Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (вес / объем) раствор в ДМСО), а затем передать все содержание до 5 мл Fluo-4 буфером (шаг 2.2) дополнен с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (Sigma, A9418).
- Вымойте клеток, выращенных в 96-луночных планшетах (шаг 1,7 или 1,10) с HBSS при 80 мкл / лунку 2 раза, используя планшет шайбы (такие, как ELx405TM от Bio-Tek).
- Добавить Fluo-4 AM загрузки решение (шаг 3,2) при 50 мкл / лунку использовании многоканальных pipetter или MicroFill (Bio-Tek) и инкубировать пластины при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
- Вымойте клетки 3 раза Fluo-4 буфером (шаг 2.2.) С помощью шайбы ELx405TM микропланшетов. После последней стирки, оставьте 80 мкл Fluo-4 буфером в каждую лунку.
4. Подготовка соединения пластины
- Во время 1 час периода загрузки клетки, подготовка серии 3x разведения агонистов (или антагонисты) в 3 раза выше требуемой конечной концентрации в Fluo-4 буфером.
- Внесите 250-300 мкл разбавленных растворов соединения 96-луночного соединения пластины. Организовать, чтобы серийные разведения соединения и соответствующий положительный и отрицательный контроль в одном столбце соединения пластины, когда это возможно, потому FlexStation 3 гласит одного поля за один раз.
5. Пластина чтения в FlexStation 3
- Включите систему (FlexStation 3, компьютер и SoftMax Pro 5.2 программное обеспечение)
- Сохранить экспериментировать с новым именем. В настройки, выберите FLEX режиме и введите следующие значения:
Протокол № 1, агонист эффект 
Протокол № 2, антагонист эффект 
- Место новой коробки наконечника, соединение пластин и чтения пластин в соответствующие лотки в FlexStation 3, и нажмите "читать" кнопку. FlexStation 3 будет читать один столбец в то время, и добавить соединений при запрограммированные моменты времени, не прерывая чтение. Она занимает около 3 минут (5 минут на протокол № 2), чтобы закончить чтение одной колонке, а машина будет продолжать читать следующую колонку с соединением дополнения осуществляется как запрограммированы пользователем на этапе 5,2, пока все столбцы читать.
6. Анализ данных
- Экспериментальные данные могут обрабатываться непосредственно с помощью SoftMax Pro 5.2 программного обеспечения или скопировать и вставить в любую программу электронных таблиц, таких как Microsoft Excel. Концентрация-кривую реакции TRPA1 агонист флуфенамовая кислоты (СЖК) строится с помощью следующих наименьших квадратов установки рутины.
, Где Y является наблюдаемое ответ, Y макс нормированная максимальный ответ, С соответствующей концентрации препарата, ЭК 50 концентрации, которая вызвала полумаксимальной ответ, и я Н кажущийся коэффициент Хилла. Концентрация-торможение кривая предполагаемого TRPA1 антагонист соединение получается с помощью фиксированной концентрации свободных жирных кислот (100 мкМ), и постепенно увеличивая концентрацию соединения А. IC 50 Значение соединения рассчитывается по методу наименьших квадратов установки на следующие уравнения. 
, Где Y является наблюдаемое реагирования и Y макс нормирован максимальной чувствительностью, [Ant] является соответствующего соединения в концентрации, IC 50 является антагонистом концентрации, которая производит половину максимального ингибирования FFA-вызвала отклик, и я H является очевидным Хилл коэффициент.
, Где Y является наблюдаемое ответ, Y макс нормированная максимальный ответ, С соответствующей концентрации препарата, ЭК 50 концентрации, которая вызвала полумаксимальной ответ, и я Н кажущийся коэффициент Хилла. Концентрация-торможение кривая предполагаемого TRPA1 антагонист соединение получается с помощью фиксированной концентрации свободных жирных кислот (100 мкМ), и постепенно увеличивая концентрацию соединения А. IC 50 Значение соединения рассчитывается по методу наименьших квадратов установки на следующие уравнения. 
, Где Y является наблюдаемое реагирования и Y макс нормирован максимальной чувствительностью, [Ant] является соответствующего соединения в концентрации, IC 50 является антагонистом концентрации, которая производит половину максимального ингибирования FFA-вызвала отклик, и я H является очевидным Хилл коэффициент. 7. Представитель Результаты:
TRPA1 является Са 2 +-проницаемым катионного канала, активация которых приводит к притоку кальция, которые могут быть обнаружены Са 2 +-чувствительного красителя, Fluo-4 (1-2). HEK293-hTRPA1 стабильные клеточные линии были использованы для изучения реакции на концентрацию отношения TRPA1 агонистов и антагонистов. Клетки были загружены Fluo-4 утра, размещены в 80 мкл буфера, и читать с помощью FlexStation 3. После записи базовой флуоресценции в течение 30 с, 40 мкл серийных разведении TRPA1 агониста, FFA, каждый в 3 раза выше желаемой конечной концентрации, были добавлены к клеткам через многоканальную pipetter включен в качестве части модуля струйной из FlexStation 3. Флуоресценции изменения наблюдали в течение еще 180 s. Относительная Fluo-4 флуоресценции изменений для каждой скважины были высказаны ΔF = (F - F 0), где F и F 0, флуоресценции значений на момент интереса и начале чтения, соответственно. Представитель следы времени курсы флуоресценции изменяется в ответ на серию концентрации свободных жирных кислот, показаны на рис. 1. Обратите внимание, за последние четыре концентрации свободных жирных кислот, хотя максимальные уровни ответ схожи, кинетика активации явно быстрее выше, чем на нижних ФФА концентрациях. Поэтому, чтобы отличить эти различия, концентрация - ответ отношений была построена путем измерения начальной ставки (наклон) флуоресценции увеличения при добавлении различных концентраций свободных жирных кислот (рис. 2). Половина максимального эффектаив концентрации (ЭК 50) СЖК была определена в 55,4 мкМ (п = 3). Для проверки предполагаемого TRPA1 антагонист, соединение, мы провели подобный эксперимент с использованием протокола № 2 (Шаг 2). В этом случае серия разведений антагонистов были добавлены на 30 с (40 мкл 3x желаемой конечной концентрации) и FFA было добавлено 180 сек позже (60 мкл в 300 мкМ для конечной концентрации 100 мкМ). Соединения в зависимости от дозы снижение реакции TRPA1 клетки ФФА с половиной максимальной подавляющей концентрации (IC 50) в 4,3 мкМ (п = 3) (рис. 2).
Рисунок 1. Концентрация зависит от активизации человеческого TRPA1 по FFA. Следы являются FFA-вызвали увеличение флуоресценции во времени (только ответы в первые 60 были показаны, чтобы лучше проиллюстрировать быстрой кинетики FFA-вызвали ответов). Обратите внимание, что при более высоких концентрациях ФФА вызвало флуоресценции возрастает с намного быстрее, чем кинетическая при более низких концентрациях, хотя пик флуоресценции уровни были сходными.
Рисунок 2 Концентрация -. Реакция по FFA-индуцированной флуоресценции изменения и соединения вызванного торможением ФФА отклик в человеческих TRPA1 стабильно выражается в НЕК293. Δ, концентрация - ответ отношения ФФА было определено путем измерения начальной ставки (наклон) нормированной флуоресценции увеличения при добавлении различных концентраций СЖК. О, концентрация-эффект торможения FFA-кальций вызывал реакцию предполагаемого TRPA1 антагонист, соединения А.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Внутриклеточного Са 2 + играет важную роль во многих физиологических и патологических состояний, таких как нейромедиатор релиз (3), сердечной потенциала действия (4), сокращение мышечных клеток (5), сотовые передачи сигнала (6-7), и excitotoxic клеточной смерти ( 8). Измерение внутриклеточного Са 2 + уровня помогает выяснить функциональные изменения Са 2 +-проницаемые каналы в мембране плазмы или внутриклеточных органелл и вклад
Са 2 + в вышеуказанных процессах (9-13). Анализ также может быть использован для исследования функции G-белком рецепторы, многие из которых, после активации, привести к увеличению внутриклеточного свободного Са 2 + концентрациях, выпустив Са 2 + из внутриклеточных Са 2 + магазинах или активации других Са 2 + проницаемые ионные каналы (14-16). FlexStation 3 использует Са 2 + чувствительных красителей, которые приводят к увеличению интенсивности флуоресценции, или радиометрический изменения, с повышением внутриклеточной концентрации Са 2 +. Это видео статья демонстрирует применение FlexStation 3 в изучении Са 2 +-проницаемые каналы TRPA1 heterologously выражается в НЕК293. Хотя мы использовали только 96-луночных планшетах для демонстрации, пользователи могут легко выбирать из 96 - или 384-луночного формата пластины, переключаясь дозирования pipetters (8 - или 16-канала). Этот препарат обеспечивает быструю средних и высоких возможностей скрининга агонистов и / или антагонистов и применима ко многим другим Са 2 +-проницаемым ионных каналов. Тем не менее, следует отметить, что внутриклеточные анализа кальция косвенного измерения ионных деятельность канала. Подробная последующих исследований с использованием записей патч зажим для непосредственного измерения ионного тока, протекающего через клеточные мембраны по-прежнему необходимы, чтобы сделать соответствующие выводы.
Для получения достоверных данных о качестве, соблюдайте следующие меры предосторожности должны быть приняты:
- Для свободно присоединенными клетках, таких как НЕК293, покрытие пластин имеет важное значение. Однако, для сильно прилипшие клетки, таких как китайский Hamster яичников (СНО) клетки или клетки HELA, покрытие не требуется.
- Важно, чтобы равное количество клеток высевают в каждую лунку нескольких ячейках и плотность клеток в каждой лунке должна быть в пределах 90-100% слияния во время анализа.
- Аккуратно обойтись жидкости в клетки и не мешать клетки при загрузке и стиральные клеток.
- Пробенецид добавляется краситель, чтобы предотвратить утечки. Однако, так как пробенецид также имеет влияние на некоторых ионных каналов, следует проявлять осторожность при интерпретации данных, полученных из экспериментов, которые включают в пробенецид буфером.
- Для определения концентрации соединения в соединении пластины, рассмотрим коэффициент разбавления для каждой скважины в соответствии с буфером объемом в соответствующем хорошо образца пластины до и после соединения дополнительно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора. Джон Хэнкок, Рэй Гриль, Эндрю Моррис и Ольга Чумакова за их поддержку. FlexStation 3 система является частью UTHSC Cytodynamic фонда Imaging. Мы также благодарим д-ра. Ardem Patapoutian и Майкл Bandell из исследовательского института Скриппса и геномики Института Новартис Фонд исследований (GNF) для обеспечения HEK293-hTRPA1 стабильной клеточной линии. Исследование частично поддержана грантами NIH (GM081658 для MXZ) и Техасского медицинского центра болезней пищеварительного тракта центр (к HH) и Миссия Connect / TIRR Foundation (для домохозяйств).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
- Hu, H. Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs. Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).
- Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels. Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).
- Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons. Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).
- Mason, S. A., MacLeod, K. T. Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females. Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).
- Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline. Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).
- Alagarsamy, S., Johnson, K. M. Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS. Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).
- Su, L. T. TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain. J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).
- Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury. J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).
- George, J. Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons. J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).
- Price, K. L., Lummis, S. C. FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems. J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).
- Laude, A. J. Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors. Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).
- Marincsak, R. The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1. Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).
- Xie, X. Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol. 5, 191-203 (2007).
- Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).
- Boulay, G. Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein. J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).
- Nanda, K. Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter. Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).
