Summary
Este video ofrece un protocolo detallado para estudiar el perfil farmacológico de humanos TRPA1 canales a través de FlexStation 3. El protocolo cubre los detalles de la preparación de la célula, la carga de tinte y el funcionamiento del lector de microplacas, FlexStation 3.
Abstract
El FlexStation Molecular Devices "3 es una mesa de trabajo multi-modo de lector de microplacas capaz de medir la fluorescencia automatizado de múltiples placas. Es ideal para medianas y de alto rendimiento de las pantallas en el ámbito académico. Tiene un módulo de transferencia de fluidos integrado equipado con una pipeta de canales múltiples y la máquina lee una columna a la hora de controlar los cambios de fluorescencia de una variedad de reactivos fluorescentes. Por ejemplo, FlexStation 3 se ha utilizado para estudiar la función de Ca 2 +-permeables los canales de iones y proteínas G-receptores acoplados mediante la medición de los cambios intracelulares de Ca 2 + libre los niveles. Transitoria receptor potencial (TRP) los canales son una gran familia de canales de cationes no selectivos que juegan un papel importante en muchas funciones fisiológicas y fisiopatológicas. La mayoría de los canales TRP son el calcio permeable e inducir la entrada de calcio a la activación. En este video, se demuestra la aplicación de FlexStation 3 para estudiar el perfil farmacológico de los canales TRPA1, un sensor molecular de numerosos estímulos nocivos. HEK293 transitoria o estable expresando humanos TRPA1 canales, que se cultiva en placas de 96 pozos, se cargan con una Ca 2 + sensibles tinte fluorescente, Fluo-4, y en tiempo real los cambios de fluorescencia en estas células se midió antes y durante la aplicación de un agonista de la TRPA1 utilizando el modo de flexión de la FlexStation 3. El efecto de un antagonista de los supuestos TRPA1 también fue examinado. Los datos se transfieren desde el software Pro SoftMax para construir relaciones de concentración-respuesta de TRPA1 activadores e inhibidores.
Protocol
1. Preparaciones de células en placas de 96 pozos
Para las células HEK293 transitoria trasfected con cDNA TRPA1 humanos
- HEK293 células se cultivan para uno o dos días en medio esencial mínimo de Dulbecco (DMEM) que contiene 4,5 mg / ml de glucosa (Thermo Scientific, SH3002201), suplementado con 10% inactivado por calor suero fetal bovino (Invitrogen, 16000-044), 50 unidades / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina (Invitrogen, 15140-163). En el día de la transfección, la densidad celular debe llegar a un 70-90%.
- Escudo placas de 96 pozos con la pipeta 50 l poli-L-ornitina (Sigma P3655, 20 mg / ml en agua destilada estéril) a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante al menos 15 min. Enjuague bien cada vez con fosfato de Dulbecco solución salina tamponada (DPBS) sin Mg 2 + y Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). La placa se puede dejar en la campana de cultivo celular por unas horas.
- Por cada pocillo de una placa de 96 pozos, se diluye en un tubo Eppendorf de 1,5 ml 0,2 mg cDNA en 25 l OPTI-MEM (Invitrogen, 31985-070). Ampliar proporcionalmente en función del número de pozos que se transfectadas por el mismo cDNA. También diluir en un aparte de 1,5 ml tubo Eppendorf 0,4 l Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668-019) en 25 l OPTI-MEM para cada pozo que se transfectadas. Esta escala de acuerdo a la cantidad total de pozos que se transfectadas.
- Agitar brevemente el 2000 cDNA diluido y Lipofectamine y dejar que ellos se sientan en la temperatura ambiente durante unos 5 minutos.
- La transferencia de un volumen igual de la Lipofectamine diluida 2000 al tubo que contiene el cDNA diluido vórtice, y deja reposar la mezcla a temperatura ambiente durante horas 15 minutos a 2. Durante este tiempo, la transferencia del cDNA / Lipofectamine 2000 mezcla a 49 l / pocillo de la placa recubierta con poli-L-ornitina.
- Trypsinize las células HEK293 (Paso 1.1), cuenta la densidad de células utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado Condesa (Invitrogen, C10227), y la transferencia de una cantidad deseada de células (generalmente alrededor de ~ 125,000-150,000 células / pocillo) a una estéril de 15 ml cónico fondo del tubo de centrífuga. Centrifugar a 1000 rpm x 5 min. Resuspender las células en ~ 1,250,00-1,500,000 células / ml en el medio de cultivo DMEM, suplementado con inactivado por calor, 10% de suero bovino fetal, pero sin antibióticos.
- Dispensar 98 l de suspensión celular a cada pocillo que contiene el cDNA-Lipofectamine 2000 utilizando una pipeta de mezcla multicanal o el dispensador de microplacas microrrelleno (Bio-Tek). Deje que la placa de sentarse en el capó, por lo menos 30 minutos antes de colocarlo a la humidificado incubadora de cultivo celular. Se incuba a 37 ° C CO, 5% 2 de 20 a 44 hrs.
Para HEK293 células que expresan establemente TRPA1
- Siga el paso 1.2 para cubrir placas de 96 pozos.
- La línea inducible HEK293-hTRPA1 celular fue generosamente proporcionado por el Dr. A. Patapoutian (The Scripps Research Institute) y se mantiene en el mismo medio que el de tipo salvaje células HEK293 (Paso 1.1), pero suplementado con 5 mg / ml blasticidin (Invitrogen, A1113902) y 50 ug / ml de higromicina B (Invitrogen, 10687010). Cuando la densidad celular alcanza alrededor del 90%, trypsinize células, cuenta la densidad de células y centrifugar la cantidad deseada de las células a 1000 rpm x 5 min. Resuspender las células a una densidad de ~ 1.000.000 de células / ml en el mismo medio de cultivo complementado con doxiciclina (Fisher, BP26535, 0,25 g / ml).
- Prescindir de la suspensión celular a poli-L-ornitina placas recubiertas de 100 l / pocillo utilizando una pipeta de canales múltiples o la microrrelleno (Bio-Tek). Deje que la placa de sentarse en el capó, por lo menos 30 minutos antes de colocarlo a la humidificado incubadora de cultivo celular. Se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 16 a 24 horas.
2. Soluciones
- Tampón de Hank solución de sal (HBSS) se utiliza como la solución extracelular. Que contiene (en mM): 137 NaCl, 5,4 KCl, 0,25 Na 2 HPO 4, 0,44
KH 2 PO 4, 1,3 CaCl 2, 1,0 MgSO 4, 1,0 MgCl 2, 10 glucosa, 10 HEPES, con pH ajustado a 7,4 con NaOH 1 N). - Fluo-4 tampón de ensayo contiene 2 mM probenecid en HBSS. Hacer 250 mM de valores probenecid (Sigma, P8761) en 0,5 N NaOH. Diluir a HBSS en una proporción de 1:125. Reajustar el pH a 7.4 con 1 N HCl.
3. Célula de carga con Fluo-4 AM
- Disolver 1 mg Fluo-4 AM (Invitrogen, F14202) en DMSO anhidro 912 l para hacer una solución madre de 1 mM. El Fluo-4 AM solución de reserva se pueden almacenar a -20 ° C durante al menos un mes.
- Se mezclan 10 l 1 mM Fluo-4 AM con 10 l Pluronic F-127 (Invitrogen, P3000MP, el 20% (w / v) en DMSO) y luego transferir todo el contenido a 5 ml de tampón de ensayo de Fluo-4 (Paso 2.2) complementado con la especie bovina 0,1% de albúmina sérica (Sigma, A9418).
- Lavar las células cultivadas en placas de 96 pozos (Paso 1.7 o 1.10) con HBSS a 80 l / y 2 veces con un lavador de microplacas (como ELx405TM de Bio-Tek).
- Agregue el Fluo-4 AM carga solución (Paso 3.2) a 50 l / pocillo utilizando una pipeta de canales múltiples o la microrrelleno (Bio-Tek) y se incuba la placa a 37 ° C durante 1 hora.
- Lavar las células 3 veces con el tampón de ensayo Fluo-4 (Paso 2.2.) Usando el lavador de microplacas ELx405TM. Después del último lavado, deje 80 l del tampón de Fluo-4 del ensayo en cada pocillo.
4. Preparación de la placa de compuesto
- Durante el período de 1 hora de carga celular, preparar una serie de diluciones de los agonistas de 3x (o antagonistas) de 3 veces de la concentración final deseada en el buffer de Fluo-4 ensayo.
- Pipeta de 250 a 300 l de las soluciones de compuesto diluido en un plato compuesto de 96 pozos. Haga arreglos para que las diluciones seriadas de un compuesto y los correspondientes controles positivos y negativos en la misma columna de la placa compuesto siempre que sea posible, porque FlexStation 3 dice una sola columna a la vez.
5. Placa de la lectura en FlexStation 3
- Encienda el sistema (FlexStation 3, la computadora y el software SoftMax Pro 5.2)
- Guardar el experimento con un nuevo nombre de archivo. En el set-up, elegir el modo de FLEX y escriba los siguientes valores:
Protocolo n º 1, el efecto agonista 
Protocolo n º 2, el efecto antagonista 
- Coloque una caja nueva punta, compuesto de placa y la placa de la lectura de las bandejas adecuadas FlexStation 3 y haga clic en botón "Leer". El FlexStation 3 leerá una columna a la vez y añadir compuestos en los puntos de tiempo preprogramado sin interrumpir la lectura. Se tarda unos 3 minutos (5 minutos para el Protocolo n º 2) para terminar de leer una columna y la máquina continuará a leer la siguiente columna con adiciones compuesto cabo según lo programado por el usuario en el paso 5.2 hasta que todas las columnas se leen.
6. Análisis de los datos
- Los datos experimentales pueden ser procesados directamente a través de la SoftMax Pro 5.2 software o copiar y pegar en cualquier programa de hoja de cálculo, como Microsoft Excel. Concentración de la curva de respuesta de un agonista del ácido flufenámico TRPA1 (FFA) se construye con los siguientes mínimos cuadrados rutina de instalación.
, Donde Y es la respuesta observada, Y max es la respuesta máxima normalizada, C es la concentración del fármaco correspondiente, la CE 50 es la concentración que provocó una respuesta mitad de la máxima, y H n es el coeficiente de Hill aparente. La concentración de inhibición de la curva de un compuesto antagonista de los supuestos TRPA1 A se obtiene mediante el uso de una concentración fija de FFA (100 M), y progresivamente el aumento de la concentración del compuesto A. IC 50 valor del compuesto A se calcula por mínimos cuadrados ajuste a las siguientes ecuación. 
, Donde Y es la respuesta observada y Y max se normaliza la respuesta de pico, [Ant] es el correspondiente compuesto una concentración, el IC50 es la concentración de antagonista que produce la mitad de la máxima inhibición de la FFA, potenciales evocados, y n H es la colina de aparente coeficiente.
, Donde Y es la respuesta observada, Y max es la respuesta máxima normalizada, C es la concentración del fármaco correspondiente, la CE 50 es la concentración que provocó una respuesta mitad de la máxima, y H n es el coeficiente de Hill aparente. La concentración de inhibición de la curva de un compuesto antagonista de los supuestos TRPA1 A se obtiene mediante el uso de una concentración fija de FFA (100 M), y progresivamente el aumento de la concentración del compuesto A. IC 50 valor del compuesto A se calcula por mínimos cuadrados ajuste a las siguientes ecuación. 
, Donde Y es la respuesta observada y Y max se normaliza la respuesta de pico, [Ant] es el correspondiente compuesto una concentración, el IC50 es la concentración de antagonista que produce la mitad de la máxima inhibición de la FFA, potenciales evocados, y n H es la colina de aparente coeficiente. 7. Los resultados representativos:
TRPA1 es un Ca 2 +-permeable canal catiónico, la activación de lo que lleva a la entrada de calcio que puede ser detectada por el Ca 2 + sensibles al medio de contraste, Fluo-4 (1-2). Una línea celular HEK293-hTRPA1 estable se utilizó para estudiar la relación concentración-respuesta de TRPA1 agonistas y antagonistas. Las células fueron cargadas con Fluo-4 AM, ubicada en 80 l del tampón de ensayo, y leer con FlexStation 3. Después de grabar la fluorescencia basal durante 30 s, 40 l de una dilución en serie de los agonistas de TRPA1, FFA, cada uno a 3 veces de la concentración final deseada, se añadieron a las células a través de una pipeta de varios canales incluye como parte del módulo de fluidos de FlexStation 3. Los cambios de fluorescencia fueron controlados por un adicional de 180 s. Los cambios relativos Fluo-4 de fluorescencia para cada pozo se expresaron como Df = (F - F 0), donde 0 F y F son los valores de fluorescencia en el momento de interés y el comienzo de la lectura, respectivamente. Rastros representante de los cursos a tiempo a los cambios de fluorescencia en respuesta a una serie de concentraciones de ácidos grasos libres se muestra en la figura. 1. Nota para los últimos cuatro concentraciones de ácidos grasos libres, aunque los niveles de respuesta máxima son similares, la cinética de activación es claramente más rápido en el más alto que en las concentraciones más bajas de ácidos grasos libres. Por lo tanto, para distinguir estas diferencias, la concentración - relación dosis-respuesta fue construido por la medición de la tasa inicial (pendiente) del incremento de fluorescencia tras la adición de diferentes concentraciones de ácidos grasos libres (Fig. 2). El efecto máximo medioconcentración ive (CE 50) de la FFA se determinó que 55,4 M (n = 3). Para probar la supuesta TRPA1 antagonista, el compuesto A, se realizó un experimento similar utilizando el protocolo n º 2 (Paso 2). En este caso, una serie de diluciones del antagonista se añadieron a los 30 s (40 l de 3x deseada concentración final) y los ácidos grasos libres se añadió más tarde 180 s (60 l menos 300 M para una concentración final de 100 mM). Compuesto A dependiente de la dosis reduce la respuesta de las células de TRPA1 FFA con una media máxima concentración inhibitoria (IC50) de 4,3 M (n = 3) (Fig. 2).
Figura 1. Concentración-dependiente de la activación de TRPA1 humanos por parte de la FFA. Las huellas son aumentar la FFA evocados de la fluorescencia en el tiempo (las respuestas sólo en los primeros 60 s se muestran para ilustrar mejor la rápida cinética de las respuestas evocadas por FFA). Tenga en cuenta que a mayores concentraciones de FFA evocado incremento de fluorescencia con una. Cinética mucho más rápido que en concentraciones más bajas, a pesar de que los niveles de fluorescencia máxima fueron similares
Figura 2 Concentración -. Relaciones de respuesta de FFA el cambio inducido por fluorescencia y el compuesto A-inducida por la inhibición de la respuesta de la FFA en humanos TRPA1 expresado de forma estable en células HEK293. Δ, la concentración - relación dosis-respuesta de la FFA se determinó mediante la medición de la tasa inicial (pendiente) del incremento de fluorescencia normalizada con la adición de diferentes concentraciones de ácidos grasos libres. O, de concentración-respuesta de la inhibición de la FFA-respuesta evocada del calcio por una supuesta TRPA1 antagonista, compuesto A.
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Discussion
Intracelular de Ca 2 + juega un papel importante en muchas condiciones fisiológicas y patológicas, como la liberación de neurotransmisores (3), potencial de acción cardíaco (4), la contracción de las células musculares (5), la transducción de señal de celular (6-7), y la muerte celular excitotóxica ( 8). La medición de Ca 2 + intracelular niveles de ayuda a dilucidar los cambios funcionales de Ca 2 +-permeables los canales en la membrana plasmática o organelos intracelulares y la contribución de
Ca 2 + a los procesos anteriores (9-13). El ensayo también puede utilizarse para investigar la función de los receptores acoplados a proteína G, muchos de los cuales, tras la activación, llevar a un aumento intracelular de Ca 2 + libre concentraciones por la liberación de Ca 2 + intracelular de Ca 2 + o activar otras Ca 2 + permeables los canales iónicos (14-16). FlexStation 3 hace uso de Ca 2 + sensibles a tintes, que dan lugar a una mayor intensidad de fluorescencia, o cambios radiométrica, con el aumento intracelular de Ca 2 + de concentración. En este artículo se demuestra la aplicación de vídeo de FlexStation 3 en el estudio de Ca 2 +-permeable TRPA1 canales heteróloga se expresa en las células HEK293. A pesar de que han utilizado placas de 96 pozos para la demostración, los usuarios pueden elegir entre 96 - o 384-y formato de placa por el cambio de la dispensación de pipetas (8 - o 16 canales). Este ensayo proporciona un medio rápido de alta capacidad de cribado de los agonistas y / o antagonistas y es aplicable a muchos otros canales de iones Ca 2 +-permeable. Sin embargo, cabe señalar que del ensayo de calcio intracelular es una medida indirecta de las actividades de los canales iónicos. Seguimiento detallado de los estudios que utilizan grabaciones de patch clamp para medir directamente la corriente iónica que fluye a través de la membrana celular son aún necesarios para sacar las conclusiones pertinentes.
Para obtener una calidad de datos fiables, las precauciones deben tomar las siguientes:
- Para las células de baja adherencia, como las células HEK293, revestimiento de las placas es esencial. Sin embargo, para las células fuertemente adheridas, tales como ovario de hámster chino (CHO) o células HeLa, el revestimiento no es necesario.
- Es importante que la misma cantidad de células se siembran en cada pocillo de la placa multi-pozo y la densidad celular en cada pocillo debe ser entre 90-100% de confluencia en el momento del ensayo.
- Administra el líquido suavemente a las células y no molestar a las células durante la carga y el lavado de las células.
- Probenecid se añade para evitar fugas de tinte. Sin embargo, como probenecid también tiene efecto en algunos canales de iones, se debe tener cuidado al interpretar los datos obtenidos en experimentos que incluyen probenecid en el tampón de ensayo.
- Para determinar la concentración de estos compuestos en el plato compuesto, tenga en cuenta el factor de dilución para cada bien de acuerdo con el volumen de buffer en el pozo correspondiente de la placa de muestra antes y después de la adición compuesto.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a los Dres. John Hancock, Ray Grill, Andrew Morris y Olga Chumakova por su apoyo. El FlexStation 3 sistema es parte del Fondo de imágenes Cytodynamic UTHSC. También queremos agradecer a los Dres. Ardem Patapoutian y Michael Bandell del Instituto de Investigación Scripps y del Instituto de Genómica de la Fundación de Investigación Novartis (GNF) para proporcionar la línea celular HEK293-hTRPA1 estable. La investigación fue apoyada en parte por subvenciones del NIH (GM081658 a MXZ) y Centro Médico de Texas Centro de Enfermedades Digestivas (a HH) y la Misión de conexión / TIRR Fundación (a HH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FlexStation 3 | Molecular Devices | FLEX3 | |
| 96-Well, FlexStation Pipet Tips | Molecular Devices | 9000-0912 | |
| 96-Well Plates | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 96-Well Clear Flat Bottom plates | Costar | 3595 | |
| DMEM | Invitrogen | 12430-104 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14202 | |
| PluronicF-127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P36551 | |
| probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 |
References
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