Summary
Protocol
- Bereiten mikrofluidischen Kanal mit anti-CD4 + biotinlayted Oberfläche.
- Injektion von 10 ml Probe Blut bei 5 ml / min in den mikrofluidischen Kanal mit Spritzenpumpe.
- Spülen Sie das Blut bei 20 ml / min für 20 min mit PBS.
- Inject verdünnt FACS Lyse-Lösung (verdünnt auf 10% von Stammlösung mit PBS) bei 5ul/min für 15 min.
- Inkubation: 15 min.
- Inject primären CD3 +-Antikörper-Lösung (verdünnt auf 10% von Stammlösung mit PBS) bei 5 ml / min für 20 min.
- Inkubieren für 2 Stunden.
- Spülen Sie Kanal mit PBS auf 5 ml / min für 15 min.
- Inject 20% AF488 CD4 +-Antikörper, 0,2% DAPI-Stammlösung und 10% sekundäre CD3 + Antikörper bei 5 ml / min für 20 min zur gleichen Zeit.
- Inkubieren für 20 min.
- Spülen Sie den Kanal mit PBS auf 5 ml / min für 15 min.
- Zählen von Zellen unter Fluoreszenzmikroskop:
- White (optisch) - Schwarz und Weiß: Zell-und Staub
- UV (DAPI) - Blue: Zelle nur
- Blue (CD4 +) - Grün: T-Lymphozyten und Monozyten
- Green (CD3 +) - Rot: T-Lymphozyten nur
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |