Summary
Protocol
- Préparer canal microfluidique avec des anti-CD4 + de surface biotinlayted.
- Injecter 10 ml de l'échantillon sanguin à 5 ml / min dans le canal microfluidique avec pompe seringue.
- Rincer le sang à 20 ml / min pendant 20 min avec du PBS.
- Injecter une solution diluée d'FACS lyse (dilué à 10% de la solution stock avec PBS) à 5ul/min pendant 15 min.
- Incuber pendant 15 min.
- Injecter CD3 + solution d'anticorps primaire (dilué à 10% de solution stock avec du PBS) à 5 ml / min pendant 20 min.
- Incuber pendant 2 heures.
- Rincer le canal avec du PBS à 5 ml / min pendant 15 min.
- Injecter 20% AF488 CD4 +, 0,2% d'une solution stock de DAPI, et 10% CD3 + anticorps secondaires à 5 ml / min pendant 20 min dans le même temps.
- Incuber pendant 20 min.
- Rincer le canal avec du PBS à 5 ml / min pendant 15 min.
- Comptez cellules sous microscope à fluorescence:
- Blanc (optique) - Noir et blanc: la cellule et de la poussière
- UV (DAPI) - Bleu: seule cellule
- Bleu (CD4 +) - Vert: des lymphocytes T et des monocytes
- Green (CD3 +) - Rouge: les lymphocytes T ne
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Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |