Summary
En ethylen glycol-baserede forglasning metode til mus embryoner er beskrevet. Det er en fordel for andre metoder i sin enkelhed og lave embryonale toksicitet, og kan derfor være bredt anvendelige til mange stammer af mus, herunder indavlede og gen-modificerede mus.
Abstract
Kryopræservering af mus embryoner er et teknologisk grundlag, der understøtter biomedicinske videnskaber, fordi mange stammer af mus er produceret af genetiske modifikationer og antallet er konstant stigende år for år. For den tekniske udvikling startede med langsom frysemetoders i 1970'erne 1, og derefter efterfulgt af forglasning metoder udviklet i slutningen af 1980'erne 2. Generelt er Sidstnævnte teknik er en fordel i sin hurtighed, enkelhed, og høj overlevelsesevne af nyttiggjort embryoner. Men den indeholdt cryoprotectants er meget giftige og kan påvirke den efterfølgende embryo udvikling. Derfor er teknikken ikke fandt anvendelse på visse stammer af mus, selv når løsninger er nedkølet til 4 ° C for at mindske den toksiske effekt i løbet af embryo håndtering. På Riken BioResource Center, er mere end 5000 mus stammer med forskellig genetisk baggrund og fænotyper vedligeholdt 3, og derfor har vi optimeret en forglasning technique som vi kan Cryopreservering embryoner fra mange forskellige stammer af mus, med fordelene ved høje embryo overlevelse efter vitrifying og optøning (eller flydende, mere præcist) ved den omgivende temperatur 4.
Her præsenterer vi et forglasning metode til mus embryoner, der har været anvendt med succes i vores center. Den kryopræservering opløsning indeholder ethylenglycol i stedet for DMSO at minimere toksicitet over for embryoner 5. Den indeholder også Ficoll og saccharose til forebyggelse af devitrification og osmotisk justering, hhv. Embryoner kan håndteres ved stuetemperatur og overføres til flydende nitrogen inden for 5 min. Fordi den oprindelige metode er blevet optimeret til plast sugerør som beholdere, har vi ændret lidt protokollen for cryotubes, som er mere let tilgængelige i laboratorier og mere modstandsdygtige over for fysiske skader. Vi har også beskrive proceduren efter optøning forglasset embryoner i detaljer, fordi det er en kritisk step for effektiv inddrivelse af levende mus. Disse metoder ville være en hjælp til forskere og teknikere, der har brug for bevarelse af musen stammer til senere brug på en sikker og omkostningseffektiv måde.
Protocol
Den samlede ordning af forsøget er vist i Fig. 1.
1. Klargøring af reagens
- Gør basen medium (her kaldet PB1) i en 100 ml glasflaske i henhold til følgende skema nedenfor:
MW mM mg/100ml NaCl 58,4 136,98 800,0 KCl 74,6 2,68 20,0 KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0 Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O 358,14 8,04 288,1 MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0 180,2 5,56 100,0 Na pyruvat 110 0,33 3,6 CaCl 2, 2H 2 O 147 0,9 13,2 Penicillin G 6,0 (ca) - Gør Ficoll-saccharose (FS) løsning:
- Tilføj følgende kemikalier til 14 ml PB1 opløsning i en 50 ml rør.
Ficoll 70 6,0 g Saccharose 3,424 g BSA 42,0 mg - Bland Ficoll 70 og saccharose i PB1 løsning, og ryst godt, indtil helt opløst.
- Efter at have kontrolleret fuldstændig opløsning ovenfor, tilføje BSA på overfladen af løsningen og holde det på4oC indtil BSA er helt opløst (> 4 timer eller natten over).
- Tilføj følgende kemikalier til 14 ml PB1 opløsning i en 50 ml rør.
- Gør ekvilibreringsopløsning (EFS20) og vitrifikation opløsning (EFS40) i et 50 ml rør:
- EFS20: 20% (v / v) ethylenglycol, 24% (w / v) Ficoll, og 0,4 mol / L saccharose i PB1 med BSA
- EFS40: 40% (v / v) ethylenglycol, 18% (w / v) Ficoll, og 0,3 mol / L * saccharoseindhold i PB1 med BSA
* For embryoner fra BALB / c eller ICR stamme, øge koncentrationen af saccharose til 0,9 mol / L saccharose fordi de er mere følsomme over for cryodamage 6.
EFS20 løsning EFS40 løsning Ethylenglycol 1 ml 2 ml FS-løsning 4 ml 3 ml - Sterilisere løsning ved filtrering med et 0,45 μm filtreret vandr. Gør aliquoter i 5 ml polystyren rør og opbevares ved 4 ° C. De kan bruges i cirka 6 måneder.
- Tilberedning af embryo optøning opløsning, der indeholder 0,75 m saccharose (TS1)
- Opløs 7,7 g saccharose i PB1 (udarbejdet i trin 1,1) og bringer den samlede mængde på 30 ml. Bland ved forsigtig omrystning, indtil sakkarose er helt opløst.
- Tilsæt 90 mg BSA på overfladen løsningen og lad det stå indtil det er helt opløst.
- Sterilisere løsning ved filtrering.
- Alikvot og opbevares ved 4 ° C. De kan bruges i ca 1 måned.
Bemærk: TS1 kan også være parat fra kommercielt tilgængelige M2.- Opløs 7,7 g saccharose i M2 og bringe det samlede volumen til 30 ml.
- Bland ved forsigtig omrystning, indtil sakkarose er helt opløst.
- Sterilisere løsning ved filtrering.
- Alikvot og opbevares ved 4oC. De kan bruges i ca 1 måned.
- TS2 (optøning løsningmed 0,25 M saccharose):
- Fortynd 10 ml TS1 med 20 ml volumen PB1 eller M2, som er relevant.
- Alikvot og opbevares ved 4 ° C. De kan bruges i ca 1 måned.
2. Forglasning af 2-celle mus Embryoner
- Forbered 2-celle mus embryoner ved naturlig parring eller konventionelle in vitro-befrugtning teknikker.
- Alikvot 50 μl EFS40 i en cryotube. Herefter skal du udføre resten af forglasning procedure ved stuetemperatur.
- Alikvot 50 μl af EFS20 på bunden af en 35 mm eller 60 mm plastik petriskål.
- Overfør op til 30 embryoner til EFS20 med et glas kapillar med kun det minimum af dyrkningsmediet. Start en timer i 2 min.
Bemærk: Placer embryoner på bunden af dråben. Dette gør effektiv dehydrering af embryoner. Kontroller morfologi af embryoner ved et stereomikroskop. Tørrede embryoner viser en indskrumpet morfologi, som vist i Fig. 2A.Hvis de ikke er dehydreret nok vente mere 1 eller 2 min. - På omkring 1,5 min, afhente embryoner fra EFS20 drop med kun den mindst mulige mængde af løsningen. Overføre dem til EFS40 i cryotube forberedt i trin 2.1. Bemærk: For de bedste resultater, timingen af picking up embryoner, således at alle embryoner kan overføres til EFS40 på omkring 2 min justere.
- Vent i 1 min.
- Sæt cryotube direkte i flydende nitrogen (LN 2).
3. Optøning Forglasset 2-celle mus Embryoner
- Før optøning, forberede et fad med 10 μl dråber embryo dyrkningsmedium for nyttiggjort embryoner (se trin 3.13). Dæk fadet med olie og sted i en CO 2 inkubator indtil brug. Bemærk: Selv om alle medier for rutinemæssig embryo kultur kan bruges i dette eksperiment, anbefaler vi, medier med højere osmolaritet såsom M16 medium.
- Varm TS1 til 37 ° C.
- Tag en ansigtsmaske og cryogloves. Åbn LN 2 TANK og hente en cryotube indeholder embryoner.
- Hurtigt åbne den øverste del af røret og kasseres LN 2. Vent i 30 sekunder for at forhindre TS1 fra at fryse på det næste trin.
- Brug en 1000ul pipette for at tilføje 850 μl af TS1 (37 ° C) i glasset og bland den løsning ved forsigtig pipettings (omkring ti gange i 25 sekunder), indtil opløsningen jævnt er opløst.
- Overfør hele mængden af røret til en plastik 60 mm petriskål (eller et urglas) (Fig. 3A). Bemærk: Embryoner skal håndteres ved stuetemperatur (22-25 ° C), indtil de er placeret i et CO 2 inkubator ved Step 3.14.
- Start en timer i 3 min.
- På omkring 2 min i TS1, ryst forsigtigt fadet indtil det medium, der indeholder embryoner er spredt over overfladen af skålen (Fig. 3B). Bemærk: Dette vil hjælpe de befrugtede æg ned til bunden, fordi de er flydende nær overfladen, når den overføres til TS1.
- Sæt tre 50 μl dråber TS2 på the parabol (Fig. 3C).
- Efter 3 min i TS1, skal du kontrollere morfologien af embryoner af et stereomikroskop, og de bør være lidt indskrumpet. Se morfologi af embryoner i tidligere (Fig. 2B) og senere (Fig. 2C) i TS1. Bemærk: Hvis embryonerne stadig er hævede, holde dem i TS1 for mere 1 til 3 min.
- Afhentning af embryoner og overføre dem til den første dråbe af TS2 (Fig. 3D). Start en timer i 3 min
- Efter 3 min, overførsel embryoner til anden drop og derefter til den tredje drop (Fig. 3E).
- Overfør embryoner til dyrkningsmediet udarbejdet på Trin 3.1. Embryonerne er i den form som vist i Fig. 2D.
- Placer fadet i en CO 2 inkubator. Omkring 10 minutter senere, overførsel embryoner til næste dråbe af kultur medium til at vaske ud af saccharose, der er blevet overført fra TS2.
- Fortsæt kultur i en CO2 inkubator, indtil ægoplægningen.
Bemærk: Overførsel Embryos til Æggelederne af modtageren hunner på dagen efter optøning. Lang kultur in vitro kan nedsætte levedygtigheden af embryoner i nogle stammer af mus.
4. Repræsentative resultater:
In vitro - og in vivo-udvikling af embryoner efter optøning er præsenteret i tabel 1 og 2. Fordelene ved denne protokol, er de høje overlevelsesevne embryoner efter optøning og dens brede anvendelighed til forskellige stammer af mus.
| Strain | Samlet Antal rør | Antal forglasset embryoner | Gendannede (nr. (%)) | Morfologisk normale (nr. (%)) | Udvikling til blastocyster (nr. (%)) |
| C57BL/6J | 20 | 400 | 397 (99) | 394 (99) | 342 (87) |
| BALB / CA | 15 | 300 | 296 (99) | 282 (95) | 238 (84) |
| ICR | 24 | 480 | 474 (99) | 443 (93) | 398 (90) |
Tabel 1. In vitro-udvikling af forglasset-optøede æg til fælles mus stammer
| Betingelse af embryoner | Antal modtager kvinder | Antal embryoner overføres | Implantationssteder (nr. (%)) | Levende afkom (nr. (%)) |
| Frisk | 12 | 180 | 141 (78.3) | 110 (61.1) |
| Forglasset | 16 | 242 | 202 (83.5) | 125 (51.7) |
Tabel 2. In vivo-udvikling af forglasset-optøede æg i C57BL/6J mus.
Figur 1. Den samlede ordning for forsøget, herunder ligevægt, forglasning, og optøning af embryoner.
Figur 2. Morfologi embryoner på hvert trin efter optøning.
Figur 3. Optøning procedure af embryoner. Alle procedurer udføres ved stuetemperatur. (A), Tilsæt 850 μl af TS1 (37 ° C) i en cryotube og overføre hele mængden af løsningen i cryotube på en plastik skål. På dette tidspunkt ser embryoner hævede som vist i Fig. 2B. (B), Spred løsning hen over overfladen af skålen ved forsigtig rystning. (C), Place tre 50 μl dråber TS2 på plastik fad. (D), Overfør embryoner til den første dråbe af TS2. Efter 3 min, ser embryoner shurunken som vist i Fig. 2C. (E), Overfør dem serielly til de resterende TS2 dråber og derefter til dyrkningsmediet.
Discussion
Siden den første rapport af mus embryo forglasning ved Rall og Fahy i 1985 2, har flere tekniske forbedringer er foretaget for at øge overlevelsesevne embryoner efter optøning. En af de mest succesfulde ændringer blev opnået ved brug af ethylenglycol som en kryoprotektant på grund af dets lave toksicitet og høj membran-permeabilitet. Sådanne fordele kunne håndtere nedfrysning embryoner ved stuetemperatur 4; andre forglasning metoder kræver embryo aflevering ved køligere temperaturer og er ikke altid gælder for nogle stammer af mus herunder BALB / C 6. Den første ethylen glycol-baserede forglasning blev udviklet af Kasai et al. i 1990 5,7. Fordi den oprindelige metode er blevet optimeret til plast sugerør som beholdere, har vi ændret lidt protokollen for cryotubes, som er mere let tilgængelige i laboratorier og mere modstandsdygtige over for fysiske skader. Derfor kan forglasning metoden beskrevet her være calicable at mange laboratorier med mus som forskning modeller. Samme metode kan også bruges til mus embryoner på morula og blastocyst stadier 8 og rotte embryoner 9. Men vi har for nylig fundet, at kvaliteten af cryotubes kan påvirke overlevelse af fostre efter frysning-optøning. Derfor er det vigtigt at undersøge indersiden af cryotubes for sin glathed før vitrifying embryoner (f.eks, se på Tabel over specifikke reagenser og udstyr).
Forglasning metoder har mange fordele frem for traditionelle langsomme frysemetoders, men de i sagens natur har en ulempe i forhold til transport formål. Som forglasset embryoner skal opbevares ved under -120 ° C for at bevare deres levedygtighed, er tørre afskibere generelt bruges til deres sikker transport. Tør afskibere er tunge og pladskrævende, og deres tur er dyrt, især for international transport. Vi er nu ved at udvikle en ny forglasning metodesom forglasset embryoner kan opbevares ved tør-is temperatur (ca. -80 ° C) i mindst 7 dage 10. Denne metode bør være forglasning af den næste generation.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev gennemført i samarbejde med National BioResource Project, Ministeriet for Undervisning, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Merck & Co., Inc. | 12657 | |
| Ethylene glycol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 058-00986 | |
| Ficoll 70 | GE Healthcare | 17-0310-10 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| NaCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 191-01665 | |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 163-03545 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| Na2HPO4·12H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 500-04195 | |
| MgCl2 ·6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-00165 | |
| CaCl2 ·2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 031-00435 | |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P-4687 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-8574 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-00015 | |
| M16 medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cryotube | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-4501 | “Cryogenic Vial” |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
- Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
- Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
- Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
- Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
- Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).
