Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

Summary

אתילן גליקול מבוססי שיטה vitrification עבור עוברי עכבר מתואר. זהו יתרון לשיטות אחרות בפשטותו ורעילות נמוכה עובריים, ולכן יכול להיות ישים באופן נרחב זנים רבים של עכברים, כולל עכברים טבועה ו גנים שונה.

Abstract

Cryopreservation של עוברי עכברים בסיס טכנולוגי התומך מדעים ביו, כי זנים רבים של עכברים הופקו על ידי שינויים גנטיים המספר גדל בעקביות שנה אחר שנה. הפיתוח הטכני שלה התחיל עם שיטות הקפאה איטית בשנות ה -1970 ^1, לאחר מכן על ידי שיטות vitrification שפותחה בסוף שנות ה 1980 ^2. באופן כללי, הטכניקה האחרונה היא יתרון זריזות שלו, הפשטות, ושרידות גבוהה של עוברים התאושש. עם זאת, cryoprotectants הכלול הם רעילים ועלולים להשפיע על התפתחות העובר הבאים. לכן, השיטה לא יושמה על זנים מסוימים של עכברים, גם כאשר הפתרונות הם מקורר 4 ° C כדי למתן את האפקט הרעיל במהלך הטיפול העובר. לכל BioResource RIKEN המרכז, יותר מ 5000 זנים עכבר עם רקע גנטי שונה פנוטיפים מתוחזקים ^3, ולכן יש לנו אופטימיזציה te vitrificationchnique שבה אנחנו יכולים cryopreserve עוברים מן זנים שונים של עכברים, עם היתרונות של הישרדות גבוה העובר לאחר vitrifying ו מפשיר (או המסה, ליתר דיוק) בטמפרטורת הסביבה ^4.

כאן, אנו מציגים שיטה vitrification עבור עוברי עכבר אשר שימש בהצלחה במרכז שלנו. הפתרון cryopreservation מכיל אתילן גליקול במקום DMSO למזער את רעילות עוברים ^5. הוא מכיל גם Ficoll ו סוכרוז למניעת devitrification והתאמה האוסמוטי, בהתאמה. עוברים ניתן לטפל בטמפרטורת החדר והועברו לתוך חנקן נוזלי תוך 5 דקות. בגלל השיטה המקורית היתה אופטימיזציה עבור קשיות כמו מכולות, יש לנו את הפרוטוקול שונה מעט עבור cryotubes, אשר נגיש יותר בקלות במעבדות עמידים יותר בפני נזקים פיזיים. כמו כן, אנו מתארים את הליך הפשרת עוברים מזוגגת בפירוט כי זה קריטי STEp עבור התאוששות יעיל של עכברים חיים. מתודולוגיות אלה יהיה מועיל חוקרים וטכנאים הזקוקים לשימור זנים העכבר לשימוש מאוחר יותר בצורה בטוחה וחסכונית.

Protocol

התוכנית הכוללת של הניסוי מוצג באיור. 1.

1. מגיב הכנה

1. הפוך את המדיום הבסיס (כאן המכונה PB1) בתוך בקבוק זכוכית 100 מ"ל לפי התרשים הבא להלן:

   	MW	mM	mg/100ml
   NaCl	58.4	136.98	800.0
   KCl	74.6	2.68	20.0
   KH 2 PO 4	136.1	1.47	20.0
   Na 2 HPO 4 0.12 H 2 O	358.14	8.04	288.1
   MgCl 2, 6 שעות 2 O	203.3	0.49	10.0
   180.2	5.56	100.0
   Na pyruvate	110	0.33	3.6
   CaCl 2, 2H 2 O	147	0.9	13.2
   פניצילין G			6.0 (בערך)

2. הפוך את Ficoll-סוכרוז (FS) פתרון:
   1. מוסיפים את כימיקלים הבא 14 מ"ל של תמיסת PB1 בתוך שפופרת 50 מ"ל.

      Ficoll 70	6.0 גרם
      סוכרוז	3.424 גרם
      BSA	42.0 מ"ג

   2. מערבבים Ficoll 70 ו סוכרוז בתמיסה PB1 ולנער היטב עד שהיא נמסה לחלוטין.
   3. לאחר בדיקת פירוק מוחלט לעיל, להוסיף BSA על פני הפתרון ולשמור אותו4oC עד BSA הוא נמס לגמרי (> 4 שעות או למשך הלילה).
3. הפוך את פתרון איזון (EFS20) והפתרון vitrification (EFS40) בתוך שפופרת 50 מ"ל:
   • EFS20: 20% (v / v) אתילן גליקול, 24% (w / v) Ficoll, ו 0.4 mol / L סוכרוז ב PB1 עם BSA
   • EFS40: 40% (v / v) אתילן גליקול, 18% (w / v) Ficoll, ו 0.3 mol / L ^* סוכרוז ב PB1 עם BSA
     ^* לקבלת עוברים מהלחץ BALB / c או ICR, להגדיל את הריכוז של סוכרוז כדי סוכרוז mol / L 0.9 משום שהם רגישים יותר cryodamage ^6.

   	EFS20 פתרון	EFS40 פתרון
   אתילן גליקול	1 מ"ל	2 מ"ל
   FS פתרון	4 מ"ל	3 מ"ל

4. לעקר את הפתרון על ידי סינון באמצעות filte 0.45 מיקרומטרr. הפוך את aliquots ב 5 צינורות פוליסטירן מ"ל ולאחסן ב 4 ° C. הם יכולים לשמש במשך כ 6 חודשים.
5. הכנת פתרון הפשרה העובר המכיל 0.75 סוכרוז M (TS1)
   1. ממיסים 7.7 גרם סוכרוז ב PB1 (מוכן בשלב 1.1) ולהביא את הנפח הכולל עד 30 מ"ל. מערבבים על ידי ניעור עדין עד סוכרוז הוא נמס לגמרי.
   2. הוסף 90 מ"ג של ארגון ה-BSA על פני השטח את הפתרון ולהשאיר אותו לעמוד עד שהיא נמסה לחלוטין.
   3. לעקר את הפתרון על ידי סינון.
   4. Aliquot ולאחסן ב 4 ° C. הם יכולים לשמש במשך כחודש 1.
   
   הערה: TS1 יכול גם להיות מוכנים מ M2 זמינים מסחרית.
   
   6. ממיסים 7.7 גרם סוכרוז ב M2 ולהביא את הנפח הכולל עד 30 מ"ל.
   7. מערבבים על ידי ניעור עדין עד סוכרוז הוא נמס לגמרי.
   8. לעקר את הפתרון על ידי סינון.
   9. Aliquot ולאחסן בבית 4oC. הם יכולים לשמש במשך כחודש 1.
6. (TS2 הפשרה פתרוןהמכיל 0.25 סוכרוז M):
   1. מדולל 10 מ"ל TS1 עם נפח של 20 מ"ל PB1 או M2, לפי העניין.
   2. Aliquot ולאחסן ב 4 ° C. הם יכולים לשמש במשך כחודש 1.

2. Vitrification של 2-תא עוברי עכברים

1. הכן 2 תאים עכבר עוברי על ידי הזדווגות טבעית או קונבנציונלית טכניקות הפריה חוץ גופית.
2. Aliquot 50 EFS40 μl לתוך cryotube. להלן, לבצע את שאר ההליך vitrification בטמפרטורת החדר.
3. 50 Aliquot μl של EFS20 על החלק התחתון של 35 מ"מ או 60 מ"מ צלחת פטרי פלסטיק.
4. העברת עד 30 עוברים אל EFS20 באמצעות זכוכית נימי עם כמות מינימלית בלבד של המדיום לתרבות. הפעלת טיימר 2 דקות.
   הערה: עוברים מקום בחלק התחתון של הירידה. זה גורם להתייבשות יעיל של עוברים. בדוק את המורפולוגיה של העוברים על ידי stereomicroscope. עוברים מיובש להראות מורפולוגיה מצומק, כפי שמוצג באיור. 2A.אם הם לא מספיק מיובש, לחכות עוד 1 או 2 דקות.
5. בשלב דקות על 1.5, להרים את העוברים מירידה EFS20 עם סכום מינימלי בלבד של הפתרון. העברת אותם EFS40 ב cryotube שהוכנו 2.1 צעד. הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, להתאים את התזמון של מרים עוברים כך שכל העוברים ניתן להעביר לתוך EFS40 ב 2 דקות בערך.
6. חכו דקות 1.
7. שים את cryotube ישירות לתוך חנקן נוזלי (LN _2).

3. הפשרה מזוגגת 2 תא עוברי עכברים

1. לפני הפשרה, להכין צלחת עם 10 טיפות של μl בינוני העובר תרבות עוברי התאושש (ראה שלב 3.13). מכסים את צלחת עם שמן ומניחים CO ₂ באינקובטור עד לשימוש. הערה: למרות כל אמצעי התקשורת לתרבות העובר שגרתי ניתן להשתמש בניסוי זה, אנו ממליצים התקשורת עם osmolarity גבוה כגון בינוני M16.
2. חם TS1 ל 37 ° C.
3. לשים מסכה על הפנים cryogloves. פתח את ₂ LN tank ולאחזר cryotube המכילות עוברים.
4. לפתוח במהירות את החלק העליון של הצינור וזורקים LN _2. חכו 30 שניות כדי למנוע TS1 מן המקפיא בבית לשלב הבא.
5. השתמש פיפטה 1000ul להוסיף 850 μl של TS1 (37 ° C) לתוך הצינור ומערבבים את הפתרון על ידי pipettings עדין (כעשר פעמים ב 25 שניות) עד הפתרון הוא מומס שווה.
6. מעבירים את כל נפח של הצינור אל צלחת פטרי פלסטיק 60 מ"מ (או זכוכית שעון) (איור 3A). הערה: עוברים יש לטפל בטמפרטורת החדר (22-25 ° C) עד שהן ממוקמות ₂ CO 3.14 חממה בכל שלב.
7. התחל טיימר 3 דקות.
8. ב 2 דקות בערך ב TS1, לנער בעדינות את המנה עד בינוני המכיל עוברים משתרע על פני השטח של צלחת (איור 3B). הערה: זה יעזור העוברים לרדת למטה משום שהם צפים קרוב לפני השטח, כאשר הועבר TS1.
9. להציב שלושה 50 טיפות של μl TS2 על הדואר צלחת (איור 3 ג).
10. אחרי 3 דקות בתוך TS1, לבדוק את המורפולוגיה של העוברים על ידי stereomicroscope, הם צריכים להיות מכווץ מעט. ראה את המורפולוגיה של העוברים קודם לכן (איור 2B) ומאוחר יותר (איור 2C) ב TS1. הערה: אם עוברים הם עדיין נפוחות, לשמור אותם במשך יותר TS1 1 עד 3 דקות.
11. הרם את העוברים ולהעבירם ירידה הראשון של TS2 (איור 3D). התחל טיימר 3 דקות
12. לאחר 3 דקות, העברת עוברים לירידה השני ולאחר מכן ירידה השלישי (איור 3E).
13. העברת עוברים למדיום תרבות מוכנים בשלב 3.1. עוברים הם בצורת באיור. 2D.
14. מניחים צלחת בתוך CO ₂ באינקובטור. כ -10 דקות מאוחר יותר, העברת עוברים לירידה הבא של המדיום תרבות לשטוף את סוכרוז כי בוצעה על מ TS2.
15. המשך התרבות חממה CO2 עד החזרת העוברים.
    הערה: העברת embryos על oviducts של נקבות הנמען ביום הפשרה. תרבות לונג במבחנה עלולה להפחית את הכדאיות של עוברים בכמה זנים של עכברים.

4. נציג תוצאות:

במבחנה - ובפיתוח-vivo של עוברים לאחר ההפשרה מוצג לוחות 1 ו -2. היתרונות של פרוטוקול זה הן שרידות גבוהה של עוברים לאחר ההפשרה ואת הישימות שלו רחב זנים שונים של עכברים.

זן	מספר כולל של צינורות	מספר עוברי מזוגגת	ששוחזרו (מס '(%))	נורמלי מורפולוגית (מס '(%))	פיתוח ל blastocysts (מס '(%))
C57BL/6J	20	400	397 (99)	394 (99)	342 (87)
BALB / CA	15	300	296 (99)	282 (95)	238 (84)
ICR	24	480	474 (99)	443 (93)	398 (90)

טבלה 1. בפיתוח חוץ גופית של מזוגגת-מופשר עוברים זנים עכבר משותף

מצב של עוברים	מספר הנמען נקבות	מספר עוברי העבירה	השרשה אתרים (מס '(%))	חיים צאצאים (מס '(%))
טרי	12	180	141 (78.3)	110 (61.1)
מזוגגת	16	242	202 (83.5)	125 (51.7)

טבלה 2. בפיתוח-vivo של מזוגגת-מופשר עוברי עכברים C57BL/6J.

איור 1. התכנית הכוללת של הניסוי כולל איזון, vitrification, ואת הפשרת עוברים.

באיור 2. המורפולוגיה של העוברים בכל שלב ההפשרה.

באיור 3. הפשרה בהליך של עוברים. כל ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר. (א), הוסף 850 μl של TS1 (37 ° C) לתוך cryotube ולהעביר את כל נפח של הפתרון cryotube על צלחת פלסטיק. בשלב זה, עוברים את המראה הנפוח, כפי שמוצג באיור. 2B. (ב), מורחים את הפתרון על פני השטח של צלחת ידי ניעור עדין. (ג), מקום three 50 טיפות של μl TS2 על צלחת הפלסטיק. (ד), מעבירים את העוברים לירידה הראשון של TS2. לאחר 3 דקות, עוברים את המראה shurunken כפי שמוצג באיור. 2C. (ה), להעבירם סדרתיly לתוך TS2 הנותרים טיפות ואז המדיום לתרבות.

Discussion

מאז הדו"ח הראשון של vitrification העובר עכבר ידי Rall ו פאהי ב -1985 ^2, שיפורים טכניים שונים נעשו כדי להגדיל את השרידות של עוברים לאחר ההפשרה. אחד השינויים המוצלחים ביותר הושג על ידי שימוש אתילן גליקול כמו cryoprotectant בגלל רעילות נמוכה שלה גבוהה קרום חדירות. יתרונות אלה מאפשרים לנו להתמודד עם העוברים הקפאה בטמפרטורת החדר ^4; vitrification שיטות אחרות דורשות העובר מסירת בטמפרטורות קריר הם לא תמיד ישים כמה זנים של עכברים כולל BALB / c ^6. אתילן גליקול first vitrification מבוססי פותחה על ידי קסאי et al. בשנת 1990 ^5,7. בגלל השיטה המקורית היתה אופטימיזציה עבור קשיות כמו מכולות, יש לנו את הפרוטוקול שונה מעט עבור cryotubes, אשר נגיש יותר בקלות במעבדות עמידים יותר בפני נזקים פיזיים. לכן, השיטה vitrification המתוארת כאן עשויה להיות האפליקציהlicable למעבדות רבות תוך שימוש בעכברים כמודל מחקר. השיטה זהה יכול לשמש גם עבור עוברי עכברים בבית morula ושלבי הבלסטוציסט ⁸ ו - ⁹ עוברים חולדה. עם זאת, מצאנו לאחרונה כי איכות cryotubes עשויים להשפיע על שיעורי ההישרדות של עוברים לאחר הקפאה, הפשרה. לכן, חשוב לבחון את פני השטח הפנימי של cryotubes עבור החלקות שלה לפני עוברי vitrifying (לדוגמא: לראות את לוח ריאגנטים ספציפיים וציוד).

שיטות Vitrification יש יתרונות רבים על פני שיטות קונבנציונליות הקפאה איטית, אבל הם מטבעם יש חיסרון ביחס לצורך תחבורה. כאשר עוברים מזוגגת צריך להישמר ב -120 מעלות צלזיוס מתחת לשמור על יכולת הקיום שלהם, משלחים יבשים משמשים בדרך כלל עבור תחבורה בטוחה שלהם. משלוחים יבש הם מגושמת וכבדה, ואת שלהם הלוך ושוב הוא יקר, במיוחד עבור תחבורה בינלאומי. עכשיו אנחנו כרגע מפתחים שיטה vitrification חדשאשר עוברים מזוגגת ניתן לאחסן בטמפרטורת קרח יבש (כ -80 ° C) לפחות 7 ימים ^10. שיטה זו צריכה להיות vitrification של הדור הבא.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin	Merck & Co., Inc.	12657
Ethylene glycol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	058-00986
Ficoll 70	GE Healthcare	17-0310-10
Glucose	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	041-00595
NaCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	191-01665
KCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	163-03545
KH2PO4	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-04245
Na2HPO4·12H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	500-04195
MgCl2 ·6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	135-00165
CaCl2 ·2H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	031-00435
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P-4687
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-8574
Sucrose	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	196-00015
M16 medium	Sigma-Aldrich	M7292
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Cryotube	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-4501	“Cryogenic Vial”