Summary
Uma etileno glicol baseado em método de vitrificação para embriões de camundongos é descrito. É vantajoso para outros métodos, em sua simplicidade e toxicidade embrionária baixo e, portanto, pode ser amplamente aplicável a muitas cepas de camundongos, incluindo camundongos isogênicos e gene modificado.
Abstract
Criopreservação de embriões de camundongos é uma base tecnológica que suporta ciências biomédicas, porque muitas cepas de camundongos foram produzidos por modificações genéticas eo número está aumentando de forma consistente ano após ano. O seu desenvolvimento técnico começou com lentidão métodos de congelação na década de 1970 1, seguido por métodos de vitrificação desenvolvido no final dos anos 1980 2. Geralmente, a última técnica é vantajosa em sua rapidez, simplicidade e alta capacidade de sobrevivência de embriões recuperados. No entanto, o crioprotetores contidas são altamente tóxicos e podem afetar o desenvolvimento embrionário subseqüente. Portanto, a técnica não era aplicável a certas cepas de camundongos, mesmo quando as soluções são refrigerados a 4 ° C para mitigar o efeito tóxico durante a manipulação de embriões. No Bioresource RIKEN Center, mais de 5000 linhagens de camundongos com diferentes backgrounds genéticos e fenótipos são mantidos 3, e, portanto, ter otimizado a te vitrificaçãonão haver descrição prévia com a qual podemos criopreservar embriões de várias espécies diferentes de camundongos, com os benefícios de sobrevivência embrionária após a vitrificação alta e descongelamento (ou liquefação, mais precisamente), à temperatura ambiente 4.
Aqui, apresentamos um método de vitrificação para embriões de camundongos que tem sido utilizado com sucesso no nosso centro. A solução de criopreservação contém etileno glicol, em vez de DMSO para minimizar a toxicidade de embriões 5. Ele também contém Ficoll e sacarose para a prevenção de desvitrificação e ajuste osmótico, respectivamente. Embriões podem ser manipulados em temperatura ambiente e transferida em nitrogênio líquido dentro de 5 min. Porque o método original foi otimizada para canudos de plástico como recipientes, nós temos um pouco modificou o protocolo para criotubos, que são mais facilmente acessíveis em laboratórios e mais resistentes a danos físicos. Descrevemos também o processo de descongelamento de embriões vitrificados em detalhes porque é um ste críticap para a recuperação eficiente de camundongos vivos. Estas metodologias seria útil para pesquisadores e técnicos que necessitam de preservação das linhagens de camundongos para uso posterior em uma maneira segura e rentável.
Protocol
O esquema geral do experimento é mostrado na figura. 1.
1. Preparação do Reagente
- Tornar o meio de base (aqui no conhecido como PB1), em uma garrafa de vidro de 100 ml de acordo com o gráfico abaixo:
MW mM mg/100ml NaCl 58,4 136,98 800,0 KCl 74,6 2,68 20,0 KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0 Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O 358,14 8,04 288,1 MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0 180,2 5,56 100,0 Na piruvato 110 0,33 3,6 CaCl 2, 2H 2 O 147 0,9 13,2 Penicilina G 6.0 (aprox) - Fazer o Ficoll-solução de sacarose (FS):
- Adicionar os seguintes produtos químicos a 14 ml de solução PB1 em um tubo de 50 ml.
Ficoll 70 6,0 g Sacarose 3,424 g BSA 42,0 mg - Mix Ficoll 70 e sacarose em PB1 solução e agitar bem até dissolver completamente.
- Depois de verificar a completa dissolução acima, adicione BSA na superfície da solução e mantê-la4oC até BSA esteja completamente dissolvido (> 4 horas ou durante a noite).
- Adicionar os seguintes produtos químicos a 14 ml de solução PB1 em um tubo de 50 ml.
- Fazer a solução de equilíbrio (EFS20) ea solução de vitrificação (EFS40) em um tubo de 50 ml:
- EFS20: 20% (v / v) etilenoglicol, 24% (w / v) Ficoll, sacarose e 0,4 mol / L em PB1 com BSA
- EFS40: 40% (v / v) etilenoglicol, 18% (w / v) Ficoll, e 0,3 mol / L de sacarose * em PB1 com BSA
* Para embriões da linhagem BALB / c ou ICR, aumentar a concentração de sacarose a 0,9 sacarose mol / L, pois são mais sensíveis a cryodamage 6.
EFS20 solução EFS40 solução Etilenoglicol 1 ml 2 ml Solução de FS 4 ml 3 ml - Esterilizar a solução por filtração usando um filte 0,45 mMr. Faça alíquotas em 5 tubos de poliestireno ml e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados por cerca de 6 meses.
- Preparação da solução embrião descongelamento contendo sacarose 0,75 M (TS1)
- Dissolver 7,7 g de sacarose na PB1 (preparada no passo 1.1) e trazer o volume total de 30 ml. Misturar por agitação suave até sacarose esteja completamente dissolvido.
- Adicionar 90 mg de BSA sobre a superfície da solução e deixá-lo ficar até que esteja completamente dissolvido.
- Esterilizar a solução por filtração.
- Alíquotas e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados por cerca de 1 mês.
Nota: TS1 também podem ser preparados a partir de M2 disponível comercialmente.- Dissolver 7,7 g de sacarose em M2 e trazer o volume total de 30 ml.
- Misturar por agitação suave até sacarose esteja completamente dissolvido.
- Esterilizar a solução por filtração.
- Alíquotas e armazenar a 4oC. Eles podem ser usados por cerca de 1 mês.
- Solução TS2 (descongelamentocontendo sacarose 0,25 M):
- Diluir 10 ml TS1 com 20 ml de PB1 ou M2, conforme o caso.
- Alíquotas e armazenar a 4 ° C. Eles podem ser usados por cerca de 1 mês.
2. Vitrificação de embriões de 2 células de rato
- Prepare duas células de embriões de rato por monta natural ou convencional em técnicas de fertilização in vitro.
- Alíquota de 50 mL em um EFS40 cryotube. Seguir, executar o resto do processo de vitrificação na temperatura ambiente.
- Alíquota de 50 mL de EFS20 no fundo de um de 35 mm ou 60 mm placa de Petri de plástico.
- Transferir até 30 embriões para EFS20 usando um capilar de vidro com apenas a quantidade mínima de meio de cultura. Iniciar um temporizador para 2 min.
Nota: os embriões Coloque no fundo da gota. Isso faz com que a desidratação eficiente de embriões. Verificar a morfologia dos embriões por um estereomicroscópio. Embriões desidratados mostram uma morfologia encolhido, como mostrado na figura. 2A.Se eles não são desidratadas o suficiente, espere por mais 1 ou 2 min. - Em torno de 1,5 min, pegar os embriões a partir da queda EFS20 com apenas a quantidade mínima de solução. Transferi-los para EFS40 na cryotube preparada em 2.1 passo. Nota: Para obter melhores resultados, ajustar o tempo de pegar os embriões, para que todos os embriões podem ser transferidos para EFS40 em torno de 2 min.
- Espere por 1 min.
- Coloque o cryotube diretamente em nitrogênio líquido (LN 2).
3. Descongelar embriões vitrificados duas células-Mouse
- Antes de descongelar, preparar um prato com 10 gotas mL de meio de cultura de embriões de embriões recuperados (veja o passo 3.13). Cubra o prato com azeite e coloque em uma incubadora de CO 2 até o uso. Nota: Apesar de todos os meios de cultura de embriões de rotina podem ser utilizadas neste experimento, recomendamos mídia com maior osmolaridade, como meio de M16.
- TS1 quente a 37 ° C.
- Coloque em uma máscara facial e cryogloves. Abra a LN 2 tank e recuperar um cryotube contendo embriões.
- Abrir rapidamente o topo do tubo e descartar LN 2. Aguarde 30 segundos para evitar o congelamento a partir de TS1 o próximo passo.
- Use uma pipeta 1000ul para adicionar 850 mL de TS1 (37 ° C) dentro do tubo e misture a solução pipettings suave (cerca de dez vezes em 25 segundos) até que a solução está uniformemente dissolvido.
- Transferência de todo o volume do tubo a uma 60 milímetros de plástico placa de Petri (ou vidro de relógio) (Fig. 3A). Nota: Os embriões devem ser manipulados em temperatura ambiente (22-25 ° C) até que eles são colocados em uma incubadora de CO 2 na Etapa 3.14.
- Iniciar um temporizador para 3 min.
- Em torno de 2 min no TS1, agite levemente o prato até o meio contendo embriões é espalhado sobre a superfície do prato (Fig. 3B). Nota: Isto ajudará os embriões descem até o fundo, porque eles estão flutuando perto da superfície quando transferido para TS1.
- Coloque três gotas de 50 mL de TS2 em diae prato (Fig. 3C).
- Depois de 3 min em TS1, verificar a morfologia de embriões por um estereomicroscópio, que devem ser ligeiramente encolhido. Veja a morfologia de embriões em anteriores (Fig. 2B) e posterior (Fig. 2C) no TS1. Nota: Se os embriões ainda estão inchadas, mantê-los em TS1 por mais 1-3 min.
- Pegar os embriões e transferi-los para a primeira gota de TS2 (Fig. 3D). Iniciar um temporizador para 3 min
- Depois de 3 min, transferência de embriões para a segunda gota e depois para a terceira queda (Fig. 3E).
- Transferência dos embriões para o meio de cultura preparado no Passo 3.1. Os embriões são na forma mostrada na figura. 2D.
- Coloque em um prato de CO 2 incubadora. Cerca de 10 min mais tarde, a transferência de embriões para a próxima gota de meio de cultura para lavar sacarose que foi transitado do TS2.
- Continue cultura em uma incubadora de CO2 até a transferência de embrião.
Nota: Embry TransferênciaOS para o oviduto de receptoras no dia da descongelação. Cultura in vitro tempo pode diminuir a viabilidade de embriões em algumas linhagens de camundongos.
4. Resultados representativos:
In vitro - e in vivo de embriões desenvolvimento após o descongelamento é apresentado nas Tabelas 1 e 2. As vantagens deste protocolo são a alta capacidade de sobrevivência dos embriões após o descongelamento e sua ampla aplicabilidade para diferentes linhagens de camundongos.
| Tensão | No. total de tubos | N º de embriões vitrificados | Recuperado (No. (%)) | Morfologicamente normais (N º (%)) | Desenvolvimento de blastocistos (n º (%)) |
| C57BL/6J | 20 | 400 | 397 (99) | 394 (99) | 342 (87) |
| BALB / ca | 15 | 300 | 296 (99) | 282 (95) | 238 (84) |
| ICR | 24 | 480 | 474 (99) | 443 (93) | 398 (90) |
Tabela 1. In vitro-desenvolvimento de embriões vitrificados e descongelados em linhagens de camundongos comuns
| Condição de embriões | N º de beneficiários do sexo feminino | N º de embriões transferidos | Locais de implantação (No. (%)) | Vivem descendentes (No. (%)) |
| Fresco | 12 | 180 | 141 (78.3) | 110 (61.1) |
| Vitrificados | 16 | 242 | 202 (83.5) | 125 (51.7) |
Tabela 2. In vivo desenvolvimento de embriões vitrificados e descongelados em camundongos C57BL/6J.
Figura 1. O esquema geral do experimento, incluindo equilíbrio, vitrificação e descongelamento de embriões.
Figura 2. A morfologia de embriões em cada etapa do descongelamento.
Figura 3. Thawing procedimento de embriões. Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente. (A), Adicionar 850 mL de TS1 (37 ° C) em um cryotube e transferência de todo o volume da solução no cryotube em um prato de plástico. Neste momento, os embriões olhar inchado como mostrado na figura. 2B. (B), espalhe a solução sobre a superfície do prato, agitando suavemente. (C), coloque três gotas de 50 mL de TS2 no prato de plástico. (D), Transferência de embriões para a primeira gota de TS2. Depois de 3 min, os embriões olhar shurunken como mostrado na figura. 2C. (E), transferi-los de sériely no TS2 restantes gotas e depois para o meio de cultura.
Discussion
Desde o primeiro relato de vitrificação embrião de rato por Rall e Fahy, em 1985, duas, várias melhorias técnicas têm sido feitos para aumentar a capacidade de sobrevivência dos embriões após o descongelamento. Uma das modificações mais bem sucedida foi conseguida através da utilização de etileno glicol como crioprotetor por causa de sua baixa toxicidade e alta permeabilidade da membrana. Tais vantagens permitem-nos lidar com embriões congelamento à temperatura ambiente 4; métodos de vitrificação outras requerem embrião entregando a temperaturas mais frias e nem sempre são aplicáveis a algumas linhagens de camundongos incluindo BALB / c 6. O etileno glicol vitrificação primeiro baseado foi desenvolvido por Kasai et al. em 1990 5,7. Porque o método original foi otimizada para canudos de plástico como recipientes, nós temos um pouco modificou o protocolo para criotubos, que são mais facilmente acessíveis em laboratórios e mais resistentes a danos físicos. Portanto, o método de vitrificação aqui descrito pode ser applicable para muitos laboratórios usando ratos como modelos de pesquisa. O mesmo método também pode ser usado para embriões de camundongos na mórula e blastocisto estágios 8 e 9 embriões de ratos. No entanto, temos encontrado recentemente que a qualidade dos criotubos podem afetar as taxas de sobrevivência dos embriões após o congelamento-descongelamento. Assim, é essencial para examinar a superfície interna do criotubos por sua suavidade antes de embriões vitrificação (por exemplo, ver a Tabela de reagentes e equipamentos específicos).
Métodos de vitrificação têm muitas vantagens sobre métodos convencionais de congelamento lento, mas que inerentemente têm uma desvantagem em relação a finalidade de transporte. Como embriões vitrificados deve ser mantida a inferiores a -120 ° C para manter a sua viabilidade, carregadores secos são geralmente utilizados para o seu transporte seguro. Carregadores secos são pesados e volumosos, e sua ida e volta é caro, especialmente para o transporte internacional. Estamos agora a desenvolver um método de vitrificação novoque os embriões vitrificados podem ser armazenados em temperatura de gelo seco (cerca de -80 ° C) durante pelo menos sete dias 10. Este método deve ser a vitrificação da próxima geração.
Disclosures
Não temos nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi realizado em cooperação com o Projeto Bioresource Nacional, o Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, do Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Merck & Co., Inc. | 12657 | |
| Ethylene glycol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 058-00986 | |
| Ficoll 70 | GE Healthcare | 17-0310-10 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| NaCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 191-01665 | |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 163-03545 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| Na2HPO4·12H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 500-04195 | |
| MgCl2 ·6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-00165 | |
| CaCl2 ·2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 031-00435 | |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P-4687 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-8574 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-00015 | |
| M16 medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cryotube | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-4501 | “Cryogenic Vial” |
References
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