Summary
En etylenglykol-baserad förglasning metod för musembryon beskrivs. Det är fördelaktigt att andra metoder i sin enkelhet och låga embryonala toxicitet, och därför kan brett tillämpbar för många stammar av möss, inklusive inavlade och genmodifierade möss.
Abstract
Frysförvaring av musembryon är en teknisk grund som stöder Biomedicinsk vetenskap, eftersom många stammar av möss har producerats av genetisk modifiering och antalet är konstant ökar för varje år. Den tekniska utvecklingen började med långsam frysning metoder under 1970-talet 1, därefter följt av förglasning metoder utvecklades i slutet av 1980-talet 2. Generellt sett är det senare tekniken fördelaktigt i sin snabbhet, enkelhet och hög överlevnadsförmåga av återvunnen embryon. Men de innehöll cryoprotectants är mycket giftiga och kan påverka efterföljande embryo utveckling. Därför var tekniken inte är tillämplig på vissa stammar av möss, även om lösningarna kyls ned till 4 ° C för att minska den toxiska effekten under embryo hantering. Vid RIKEN Bioresource Center, är mer än 5000 musstammar med olika genetisk bakgrund och fenotyper underhålls 3, och därför har vi optimerat en förglasning technique som vi kan cryopreserve embryon från många olika stammar av möss, med fördelarna av hög embryots överlevnad efter vitrifying och upptining (eller kondensering, närmare bestämt) vid omgivningstemperatur 4.
Här presenterar vi ett förglasning metod för mus embryon som har använts med framgång vid vårt center. Den frysförvaring lösningen innehåller etylenglykol istället för DMSO att minimera toxiciteten till embryon 5. Den innehåller också Ficoll och sackaros för att förebygga devitrification och osmotiska justering, respektive. Embryon kan hanteras i rumstemperatur och överföras till flytande kväve inom 5 minuter. Eftersom den ursprungliga metoden var optimerad för plast-strån som behållare, har vi ändrat något protokoll för cryotubes, som är mer lättillgängliga i laboratorier och mer motståndskraftiga mot fysiska skador. Vi beskriver också förfarandet för upptining förglasat embryon i detalj eftersom det är en kritisk step för effektiv återvinning av levande möss. Dessa metoder skulle vara till hjälp för forskare och tekniker som behöver bevaras musstammar för senare användning på ett säkert och kostnadseffektivt sätt.
Protocol
Det övergripande system av experimentet visas i figur. 1.
1. Reagensberedning
- Gör basen mediet (här i kallad PB1) i en 100 ml glasflaska enligt följande tabell nedan:
MW mM mg/100ml NaCl 58,4 136,98 800,0 KCl 74,6 2,68 20,0 KH 2 PO 4 136,1 1,47 20,0 Na 2 HPO 4 0,12 H 2 O 358,14 8,04 288,1 MgCl 2, 6H 2 O 203,3 0,49 10,0 180,2 5,56 100,0 Na pyruvat 110 0,33 3,6 CaCl 2, 2H 2 O 147 0,9 13,2 Penicillin G 6,0 (ca) - Gör Ficoll-sackaros (FS) lösning:
- Lägg till följande kemikalier för 14 ml PB1 lösning i en 50 ml tub.
Ficoll 70 6,0 g Sackaros 3,424 g BSA 42,0 mg - Blanda Ficoll 70 och sackaros i PB1 lösning och skaka väl tills allt löst sig.
- Efter kontroll fullständig upplösning ovan, lägg BSA på ytan av lösningen och hålla den4 grader Celsius fram till BSA är helt löst (> 4 timmar eller över natten).
- Lägg till följande kemikalier för 14 ml PB1 lösning i en 50 ml tub.
- Gör jämviktslösning (EFS20) och förglasning lösning (EFS40) i en 50 ml tub:
- EFS20: 20% (v / v) etylenglykol, 24% (v / v) Ficoll och 0,4 mol / L sackaros i PB1 med BSA
- EFS40: 40% (v / v) etylenglykol, 18% (v / v) Ficoll och 0,3 mol / L * sackaros i PB1 med BSA
* För embryon från BALB / c eller ICR stam, ökar koncentrationen av sackaros till 0,9 mol / L sackaros eftersom de är mer känsliga för cryodamage 6.
EFS20 lösning EFS40 lösning Etylenglykol 1 ml 2 ml FS-lösning 4 ml 3 ml - Sterilisera lösningen genom filtrering med hjälp av ett 0,45 ìm filter. Gör portioner i 5 ml polystyren rör och förvaras vid 4 ° C. De kan användas för ca 6 månader.
- Beredning av embryo upptining lösning som innehåller 0,75 M sackaros (TS1)
- Lös 7,7 g sackaros i PB1 (utarbetad i steg 1,1) och att den totala mängden till 30 ml. Blanda genom försiktig skakning tills sackaros är helt upplöst.
- Lägg till 90 mg av BSA på ytan lösningen och låt den stå tills den är helt upplöst.
- Sterilisera lösningen genom filtrering.
- Alikvotera och förvara vid 4 ° C. De kan användas i ca 1 månad.
Obs: TS1 kan också framställas av kommersiellt tillgängliga M2.- Lös 7,7 g sackaros i kategorierna M2 och att den totala mängden till 30 ml.
- Blanda genom försiktig skakning tills sackaros är helt upplöst.
- Sterilisera lösningen genom filtrering.
- Alikvotera och förvara vid 4 grader Celsius. De kan användas i ca 1 månad.
- TS2 (upptining lösninginnehåller 0,25 M sackaros):
- Späd 10 ml TS1 med 20 ml volym PB1 eller M2, som är lämpligt.
- Alikvotera och förvara vid 4 ° C. De kan användas i ca 1 månad.
2. Förglasning av 2-cells musembryon
- Förbered 2-cells embryon musen genom naturlig parning eller konventionella metoder för provrörsbefruktning.
- Alikvotera 50 l EFS40 i en cryotube. Nedan utför resten av förglasning förfarandet vid rumstemperatur.
- Alikvotera 50 ìl av EFS20 på botten av en 35 mm eller 60 mm plast petriskål.
- Överför upp till 30 embryon EFS20 med ett glas kapillär med bara den minsta mängd av substrat. Starta en timer i 2 min.
OBS: Placera embryon på botten av nedgången. Detta gör att en effektiv uttorkning av embryon. Kontrollera morfologi av embryon genom ett stereomikroskop. Uttorkad embryon visar en krympt morfologi, enligt bild. 2A.Om de inte är uttorkad nog vänta på mer 1 eller 2 min. - Vid ungefär 1,5 min, plocka upp embryon från EFS20 droppe med endast ett minimum av lösningen. Överföra dem till EFS40 i cryotube bereddes i steg 2,1. Obs: För bästa resultat, justera tidpunkten för att plocka upp embryon så att alla embryon kan överföras till EFS40 runt 2 min.
- Vänta i 1 min.
- Sätt cryotube direkt i flytande kväve (LN 2).
3. Upptining Förglasat 2-cells musembryon
- Före upptining, förbereda ett fat med 10 l droppar embryo odlingsmedium för återvunna embryon (se steg 3,13). Täck skålen med olja och lägg i en CO 2-inkubator fram till användningen. OBS: Även om alla typer av media för rutinmässig embryo kulturen kan användas i detta experiment, rekommenderar vi media med högre osmolaritet som M16 medium.
- Varm TS1 till 37 ° C.
- Sätt på en ansiktsmask och cryogloves. Öppna LN 2 tank och hämta en cryotube innehåller embryon.
- Snabbt öppna upp röret och kasta LN 2. Vänta 30 sekunder för att förhindra TS1 från frost i nästa steg.
- Använd en 1000ul pipett för att lägga till 850 ìl TS1 (37 ° C) till röret och blanda lösningen genom att försiktigt pipettings (cirka tio gånger i 25 sekunder) tills lösningen är jämnt upplöst.
- Överför hela volymen i röret till en plast 60 mm petriskål (eller ett urglas) (Fig. 3A). OBS: Embryon skall hanteras i rumstemperatur (22-25 ° C) tills de placeras i en CO 2 inkubator vid steg 3,14.
- Starta en timer för 3 min.
- Vid ca 2 min i TS1, försiktigt skaka skålen tills det medium som innehåller embryon är spridda över ytan av skålen (Fig. 3B). OBS: Detta kommer att hjälpa embryon gå ner till botten eftersom de flyter nära ytan när den överförs till TS1.
- Sätt tre 50 l droppar TS2 på the maträtt (Fig. 3C).
- Efter 3 min i TS1, kontrollera morfologi av embryon genom ett stereomikroskop, och de bör vara något krympta. Se morfologi av embryon i tidigare (Fig. 2B) och senare (Fig. 2C) i TS1. Obs: Om embryona fortfarande svullna, hålla dem i TS1 för fler 1 till 3 min.
- Plocka upp embryon och överföra dem till den första droppe TS2 (Fig. 3D). Starta en timer för 3 min
- Efter 3 min, överföra embryon till den andra släppa och sedan till den tredje droppe (Fig. 3E).
- Överför embryon till odlingsmediet beredd på steg 3,1. Embryona i form visas i figur. 2D.
- Placera skålen i en CO 2-inkubator. Ca 10 min senare, överföra embryon till nästa droppe odlingsmedium att tvätta ur sackaros som har förts över från TS2.
- Fortsätt kultur i en CO2-inkubator tills embryotransfer.
OBS: Överför Embryos till äggledarna av mottagare honor på dagen för tining. Långa kultur in vitro kan minska lönsamheten av embryon i vissa stammar av möss.
4. Representativa resultat:
In vitro - och in vivo-utveckling av embryon efter upptining presenteras i Tabell 1 och 2. Fördelarna med detta protokoll är hög överlevnadsförmåga av embryon efter upptining och dess breda tillämpbarhet för olika stammar av möss.
| Sila | Antal rör | Antal förglasat embryon | Återvinnas (nr (%)) | Morfologiskt normala (nr (%)) | Utveckling till blastocyster (nr (%)) |
| C57BL/6J | 20 | 400 | 397 (99) | 394 (99) | 342 (87) |
| BALB / CA | 15 | 300 | 296 (99) | 282 (95) | 238 (84) |
| ICR | 24 | 480 | 474 (99) | 443 (93) | 398 (90) |
Tabell 1. In vitro-utveckling av förglasat-tinade embryon gemensamt musstammar
| Tillstånd av embryon | Antal mottagare kvinnor | Antal embryon | Implantationsställen (nr (%)) | Live avkomma (nr (%)) |
| Färsk | 12 | 180 | 141 (78.3) | 110 (61.1) |
| Förglasat | 16 | 242 | 202 (83.5) | 125 (51.7) |
Tabell 2. In vivo-utveckling av förglasat-tinade embryon i C57BL/6J möss.
Figur 1. Den övergripande planen för försöket med jämvikt, förglasning, och upptining av embryon.
Figur 2. Morfologi av embryon vid varje steg efter upptining.
Figur 3. Upptining förfarande av embryon. Alla förfaranden utförs i rumstemperatur. (A), Tillsätt 850 ìl TS1 (37 ° C) i en cryotube och överför hela volymen av lösningen i cryotube på en plast skål. Vid denna tid, titta embryona svullen enligt bild. 2B. (B), Sprid lösningen över ytan av skålen genom försiktig skakning. (C), placera tre 50 l droppar TS2 på plasten skålen. (D), Överför embryon till det första droppe TS2. Efter 3 min, embryona ser shurunken enligt bild. 2C. (E), flytta dem seriellly i resterande TS2 droppar och sedan till kulturen medium.
Discussion
Sedan den första rapporten av mus embryo förglasning av Rall och Fahy 1985 2, har flera tekniska förbättringar gjorts för att öka överlevnadsförmågan av embryon efter upptining. En av de mest framgångsrika förändringar uppnåddes genom användning av etylenglykol som frysskyddsmedel grund av sin låga giftighet och hög membran-permeabilitet. Sådana fördelar kan vi hantera frysa embryon vid rumstemperatur 4, andra förglasning metoder kräver embryot dela på svalare temperaturer och är inte alltid tillämpliga på vissa stammar av möss, inklusive BALB / c 6. Den första etylenglykol-baserade förglasning har utvecklats av Kasai et al. 1990 5,7. Eftersom den ursprungliga metoden var optimerad för plast-strån som behållare, har vi ändrat något protokoll för cryotubes, som är mer lättillgängliga i laboratorier och mer motståndskraftiga mot fysiska skador. Därför kan förglasning metoden som beskrivs här kan applicable för många laboratorier som använder möss som forskning modeller. Samma metod kan också användas för mus embryon vid morula och blastocyst steg 8 och embryon råtta 9. Vi har dock funnit nyligen att kvaliteten på cryotubes kan påverka överlevnaden av embryon efter frysning-upptining. Därför är det viktigt att undersöka insidan av cryotubes för sin jämnhet innan vitrifying embryon (t.ex., se till Tabell över specifika reagenser och utrustning).
Förglasning metoder har många fördelar jämfört med konventionella långsam frysning metoder, men de i sig har en nackdel i förhållande till transporter syfte. Som förglasat embryon bör hållas lägre än -120 ° C för att bibehålla sin livskraft, är torra avlastare som allmänt används för säker transport. Torr avlastare är tunga och skrymmande, och deras rundresa är dyrt, särskilt för internationella transporter. Vi är nu utvecklar för närvarande en ny förglasning metodsom förglasat embryon kan förvaras vid torr-is temperatur (ca -80 ° C) under minst 7 dagar 10. Denna metod bör vara förglasning av nästa generation.
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna studie genomfördes i samarbete med National Bioresource Project, ministeriet för utbildning, kultur, sport, vetenskap och teknik, Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Merck & Co., Inc. | 12657 | |
| Ethylene glycol | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 058-00986 | |
| Ficoll 70 | GE Healthcare | 17-0310-10 | |
| Glucose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 041-00595 | |
| NaCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 191-01665 | |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 163-03545 | |
| KH2PO4 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 169-04245 | |
| Na2HPO4·12H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 500-04195 | |
| MgCl2 ·6H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 135-00165 | |
| CaCl2 ·2H2O | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 031-00435 | |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P-4687 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P-8574 | |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 196-00015 | |
| M16 medium | Sigma-Aldrich | M7292 | |
| M2 medium | Sigma-Aldrich | M7167 | |
| Cryotube | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | MS-4501 | “Cryogenic Vial” |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196° and -269°C. Science. 187, 411-414 (1972).
- Rall, W. F., Fahy, G. M. Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196°C by vitrification. Nature. 313, 573-575 (1985).
- Yoshiki, A. The mouse resources at the RIKEN BioResource center. Exp. Anim. 58, 85-96 (2009).
- Mochida, K., Ogura, A. Cryopreservation of embryos in laboratory species. J. Mamm. Ova. Res. 27, 87-92 (2010).
- Kasai, M. A simple method for mouse embryos cryopreservation in a low toxicity vitrification solution, without appreciable loss of viability. J. Reprod. Fert. 89, 91-97 (1990).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing methods. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Kasai, M., Mukaida, T. Cryopreservation of animal and human embryos by vitrification. Reprod. Biomed. Online. 9, 164-170 (2004).
- Miyake, T. Vitrification of mouse oocytes and embryos at various stages of development in an ethylene glycol-based solution by a simple method. Theriogenology. 40, 121-134 (1993).
- Han, M. S., Niwa, K., Kasai, M. Vitrification of rat embryos at various developmental stages. Theriogenology. 59, 1851-1863 (2003).
- Jin, B. Equilibrium vitrification of mouse embryos. Biol. Reprod. 82, 444-450 (2010).
