الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران التي التزجيج جلايكول الإثيلين ، واستنادا

Summary

وصفت والاثيلين جلايكول المستندة إلى أسلوب التزجيج لأجنة الفئران. فإنه من المفيد إلى أساليب أخرى في بساطتها والسمية الجنينية منخفضة ، وبالتالي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع في العديد من سلالات من الفئران ، بما في ذلك الفئران الفطرية والجينات المعدلة.

Abstract

الحفظ بالتبريد من أجنة الفئران هي أساس التكنولوجية التي تدعم علوم الطب الحيوي ، لأنه قد تم إنتاج العديد من سلالات الفئران التي كتبها التعديلات الجينية وعدد يتزايد باستمرار عاما بعد عام. بدأ تطوره التقني مع أساليب التجميد البطيء في ¹ 1970s ، وأعقب ذلك من خلال طرائق التزجيج وضعت في أواخر 1980s ^2. عموما ، والأسلوب الأخير هو مفيد لها في السرعة والبساطة ، والبقاء على قيد الحياة عالية من الأجنة المسترجعة. ومع ذلك ، فإن cryoprotectants الواردة سامة للغاية ويمكن أن تؤثر على تطور الجنين اللاحقة. ولذلك ، فإن الأسلوب لا ينطبق على سلالات معينة من الفئران ، وحتى عندما يتم تبريد الحلول إلى 4 درجات مئوية للتخفيف من آثار سامة خلال التعامل مع الجنين. في مركز BioResource بتبريد ، تمسك الماوس سلالات أكثر من 5000 مع خلفيات وراثية مختلفة ، والظواهر ³ ، وبالتالي لدينا الأمثل a التزجيج الشركة المصرية للاتصالاتchnique التي يمكننا cryopreserve أجنة من سلالات مختلفة من الفئران ، مع بقاء الجنين فوائد مرتفعة بعد التزجيج والذوبان (أو تسييل ، وأكثر تحديدا) في درجة حرارة الغرفة ^4.

هنا ، نقدم أسلوب التزجيج للأجنة الفئران التي تم استخدامها بنجاح في مركزنا. الحل الحفظ بالتبريد يحتوي على غليكول الاثيلين بدلا من DMSO لتقليل السمية للأجنة ^5. كما أنه يحتوي على Ficoll والسكروز للوقاية من devitrification والتكيف التناضحي ، على التوالي. ويمكن معالجة الأجنة في درجة حرارة الغرفة ونقل الى النيتروجين السائل في غضون 5 دقائق. لأنه الأسلوب الأمثل لقش البلاستيك الأصلي والحاويات ، ونحن قد عدلت قليلا عن البروتوكول cryotubes ، والتي يمكن الوصول إليها بسهولة أكثر في المختبرات وأكثر مقاومة للأضرار المادية. وصفنا الداخلي أيضا ذوبان الأجنة المزجج بالتفصيل لأنها حاسمة الظريفع لاستعادة كفاءة من الفئران الحية. وهذه المنهجيات تكون مفيدة للباحثين والفنيين الذين يحتاجون إلى الحفاظ على السلالات الماوس لاستخدامها لاحقا بطريقة آمنة وفعالة من حيث التكلفة.

Protocol

يتم عرض الخطة الشاملة للتجربة في الشكل. 1.

1. تحضير كاشف

1. جعل المتوسطة قاعدة (المعروف هنا في PB1) في قنينة زجاج 100 مل وفقا للجدول التالي أدناه :

   	ميغاواط	ملي	mg/100ml
   كلوريد الصوديوم	58.4	136.98	800.0
   بوكل	74.6	2.68	20.0
   KH 2 PO 4	136.1	1.47	20.0
   غ هبو 2 4 0.12 H 2 O	358.14	8.04	288.1
   MgCl 2 ، 6H 2 O	203.3	0.49	10.0
   180.2	5.56	100.0
   غ البيروفات	110	0.33	3.6
   CaCl 2 ، 2H 2 O	147	0.9	13.2
   البنسلين G			6.0 (تقريبا)

2. جعل Ficoll - السكروز (FS) الحل :
   1. إضافة المواد الكيميائية التالية إلى 14 مل من محلول PB1 في أنبوب 50 مل.

      Ficoll 70	6.0 ز
      السكروز	3،424 ز
      BSA	42.0 ملغ

   2. مزيج Ficoll 70 و السكروز في حل PB1 ويهز جيدا حتى يذوب.
   3. بعد التحقق من استكمال حل أعلاه ، إضافة جيش صرب البوسنة على السطح من الحل والحفاظ عليه فييذوب تماما حتى 4oC BSA (> 4 ساعات أو بين عشية وضحاها).
3. يجعل الحل القائم على موازنة (EFS20) والحل التزجيج (EFS40) في أنبوب 50 مل :
   • EFS20 : ​​20 ٪ (V / V) جلايكول الإثيلين ، و 24 ٪ (W / V) Ficoll ، و 0.4 مول / لتر في PB1 السكروز مع جيش صرب البوسنة
   • EFS40 : 40 ٪ (V / V) جلايكول الإثيلين ، و 18 ٪ (W / V) Ficoll ، و 0.3 السكروز ^* مول / لتر في PB1 مع جيش صرب البوسنة
     ^* بالنسبة للأجنة من سلالة BALB / ج أو مجلس النواب ، وزيادة تركيز السكروز إلى السكروز مول / لتر 0.9 لأنهم أكثر حساسية لcryodamage ^6.

   	EFS20 الحل	EFS40 الحل
   الاثيلين غليكول	1 مل	2 مل
   FS الحل	4 مل	3 مل

4. تعقيم الحل عن طريق الترشيح باستخدام filte 0.45 ميكرونر. جعل aliquots في 5 مل أنابيب البوليسترين وتخزينها في 4 درجات مئوية. يمكن استخدامها لمدة 6 أشهر.
5. إعداد حل الجنين تحتوي على ذوبان السكروز 0.75 M (TS1)
   1. حل 7.7 غرام من السكروز في PB1 (أعدت في الخطوة 1.1) وجلب الحجم الإجمالي إلى 30 مل. مزيج لطيف من قبل يهز حتى يذوب تماما السكروز.
   2. إضافة 90 ملغ من جيش صرب البوسنة على سطح الحل وترك الأمر حتى حل الموقف تماما.
   3. تعقيم الحل عن طريق الترشيح.
   4. قسامة وتخزينها في 4 درجة مئوية. ويمكن استخدامها لحوالي 1 الشهر.
   
   ملاحظة : يمكن أيضا أن تكون مستعدة من TS1 M2 متاحة تجاريا.
   
   6. حل 7.7 غرام من السكروز في M2 وجلب الحجم الإجمالي إلى 30 مل.
   7. مزيج لطيف من قبل يهز حتى يذوب تماما السكروز.
   8. تعقيم الحل عن طريق الترشيح.
   9. قسامة وتخزينها في 4oC. ويمكن استخدامها لحوالي 1 الشهر.
6. TS2 (حل ذوبانتحتوي على السكروز 0.25 م) :
   1. تمييع 10 مل TS1 مع حجم 20 مل من PB1 أو M2 ، حسب الاقتضاء.
   2. قسامة وتخزينها في 4 درجة مئوية. ويمكن استخدامها لحوالي 1 الشهر.

2. التزجيج من أجنة الفئران 2 - الخلية

1. 2 إعداد الخلايا من الأجنة الماوس التزاوج الطبيعية أو التقليدية في تقنيات التلقيح الصناعي.
2. قسامة EFS40 50 ميكروليتر إلى cryotube. الآخرة ، تنفيذ بقية الإجراء التزجيج في درجة حرارة الغرفة.
3. قسامة 50 ميكرولتر من EFS20 على الجزء السفلي من 35 ملم أو 60 ملم طبق بيتري البلاستيك.
4. نقل ما يصل إلى 30 إلى الأجنة EFS20 باستخدام الزجاج الشعرية مع المبلغ فقط الحد الأدنى من الثقافة المتوسطة. بدء الموقت لمدة 2 دقيقة.
   ملاحظة : ضع الأجنة في الجزء السفلي من الهبوط. وهذا يجعل الجفاف كفاءة الأجنة. التحقق من مورفولوجية الأجنة قبل stereomicroscope. الأجنة المجففة تظهر التشكل منكمشة ، كما هو موضح في الشكل. 2A.إذا لم تكن كافية المجففة ، والانتظار لمزيد من 1 أو 2 دقيقة.
5. حوالي 1.5 دقيقة ، والتقاط الأجنة من الهبوط EFS20 مع المبلغ فقط الحد الأدنى من الحل. نقلها إلى EFS40 في cryotube أعد 2.1 الخطوة. ملاحظة : للحصول على أفضل النتائج ، ضبط توقيت التقاط الأجنة بحيث يمكن نقل كل الأجنة في EFS40 حوالي 2 دقيقة.
6. انتظر 1 دقيقة.
7. وضع cryotube مباشرة في النيتروجين السائل (LN _2).

3. ذوبان المزججة أجنة الفئران 2 - الخلية

1. قبل ذوبان الجليد ، وإعداد الطبق مع 10 قطرات ميكرولتر من مستنبت الجنين للأجنة المستردة (راجع الخطوة 3.13). تغطية صحن مع الزيت وضعها في حاضنة ₂ CO حتى الاستخدام. ملاحظة : على الرغم من يمكن استخدام أي وسيلة إعلامية للثقافة الجنين روتينية في هذه التجربة ، فإننا نوصي وسائل الاعلام مع ارتفاع متوسط ​​الأسمولية مثل M16.
2. TS1 الدافئة إلى 37 درجة مئوية.
3. وضع على الوجه والقناع cryogloves. فتح ₂ ر LNكرانك واسترداد cryotube تحتوي على أجنة.
4. فتح بسرعة أعلى من الأنبوب وتجاهل LN _2. الانتظار لمدة 30 ثانية لمنع TS1 من التجمد في الخطوة التالية.
5. استخدام ماصة 1000ul لإضافة 850 ميكرولتر من TS1 (37 درجة مئوية) في أنبوب ومزيج الحل بواسطة pipettings اللطيف (حوالي عشر مرات في 25 ثواني) حتى يتم حل بالتساوي الحل.
6. حجم نقل كامل للأنبوب من البلاستيك على طبق بيتري 60 ملم (أو الزجاج مشاهدة) (الشكل 3A). ملاحظة : يجب التعامل مع الأجنة في درجة حرارة الغرفة (22-25 درجة مئوية) حتى يتم وضعها في حاضنة ثاني أكسيد الكربون في الخطوة ₂ 3.14.
7. بدء الموقت لمدة 3 دقائق.
8. عند حوالي 2 دقيقة في TS1 ، يهز بلطف الطبق حتى يتم نشر المتوسطة التي تحتوي على أجنة على سطح الطبق (الشكل 3B). ملاحظة : هذا سوف يساعد على الأجنة النزول إلى أسفل لأنها تطفو قرب السطح عندما نقل إلى TS1.
9. وضعت ثلاثة ميكرولتر من 50 نقطة على عشرة TS2ه طبق (الشكل 3C).
10. بعد 3 دقائق في TS1 ، والتحقق من التشكل للأجنة قبل stereomicroscope ، وينبغي أن تقلصت قليلا. راجع مورفولوجية الأجنة في وقت سابق (الشكل 2B) وبعد (الشكل 2C) في TS1. ملاحظة : إذا كنت لا تزال منتفخة الأجنة ، والاحتفاظ بها في TS1 لمزيد من 1-3 دقيقة.
11. التقاط الأجنة ونقلها إلى أول قطرة من TS2 (الشكل 3D). بدء الموقت لمدة 3 دقائق
12. بعد 3 دقائق ، ونقل الأجنة إلى الانخفاض الثاني ، ثم إلى الانخفاض الثالث (الشكل 3E).
13. نقل الأجنة إلى مستنبت أعدت في الخطوة 3.1. الأجنة في الشكل المبين في الشكل. 2D.
14. طبق مكان في حاضنة ₂ CO. حوالي 10 دقيقة في وقت لاحق ، ونقل الأجنة إلى الانخفاض القادم من مستنبت لغسل السكروز التي تم ترحيلها من TS2.
15. تواصل الثقافة في حاضنة CO2 حتى نقل الأجنة.
    ملاحظة : نقل جنينالسراج للناقلة البيضات من الإناث المتلقية يوم الذوبان. قد ثقافة طويلة في المختبر تقليل قابلية للأجنة في بعض سلالات من الفئران.

4. ممثل النتائج :

في المختبر -- والتنمية في الجسم الحي للأجنة بعد عرض ذوبان الجليد في الجدولين 1 و 2. مزايا هذا البروتوكول هي البقاء على قيد الحياة عالية من الأجنة بعد ذوبان الجليد وتطبيقه واسع النطاق لسلالات مختلفة من الفئران.

سلالة	إجمالي عدد الأنابيب	عدد الأجنة المزجج	المستردة (رقم (٪))	شكليا العادية (رقم (٪))	التنمية لblastocysts (رقم (٪))
C57BL/6J	20	400	397 (99)	394 (99)	342 (87)
BALB / CA	15	300	296 (99)	282 (95)	238 (84)
مجلس النواب	24	480	474 (99)	443 (93)	398 (90)

الجدول 1. وفي تطور المختبر من المزجج ، المذوبة الأجنة في سلالات الفأر المشتركة

حالة الأجنة	عدد الإناث المتلقية	نقل عدد الأجنة	مواقع الغرس (رقم (٪))	يعيش ذرية (رقم (٪))
جديد	12	180	141 (78.3)	110 (61.1)
المزجج	16	242	202 (83.5)	125 (51.7)

الجدول 2 ، وفي تنمية الجسم الحي من المزجج ، المذوبة الأجنة في الفئران C57BL/6J.

الشكل 1، والخطة الشاملة للتجربة بما في ذلك موازنة ، التزجيج ، وذوبان للاجنة.

الشكل 2 ، ومورفولوجية الأجنة في كل خطوة من الذوبان.

الشكل 3. ذوبان الداخلي للاجنة. يتم تنفيذ جميع الإجراءات في درجة حرارة الغرفة. (أ) ، أضف 850 ميكروليتر من TS1 (37 درجة مئوية) في cryotube ونقل وحدة التخزين بالكامل من الحل في cryotube على طبق من البلاستيك. في هذا الوقت ، تبدو منتفخة الأجنة كما هو مبين في الشكل. 2B. (B) ، ونشر حل على سطح الطبق عن طريق هز لطيف. (C) ، ضع ثلاثة ميكرولتر من 50 نقطة TS2 على طبق من البلاستيك. (D) ، نقل الأجنة إلى الانخفاض الأول من TS2. بعد 3 دقائق ، والأجنة تبدو shurunken كما هو موضح في الشكل. 2C. (E) ، نقل منهم التسلسليلاي في TS2 المتبقية قطرات ثم إلى متوسطة الثقافة.

Discussion

منذ صدور التقرير الأول من التزجيج الجنين الماوس بواسطة RALL وفاهي ² في عام 1985 ، أدخلت تحسينات تقنية عديدة لزيادة البقاء على قيد الحياة من أجنة بعد الذوبان. وقد حققت واحدة من أنجح التعديلات عن طريق استخدام جلايكول الإثيلين باعتبارها cryoprotectant بسبب سميتها المنخفضة والعالية النفاذية غشاء. هذه المزايا تتيح لنا للتعامل مع تجميد الاجنة في درجة حرارة الغرفة ⁽⁴⁾ ؛ التزجيج أساليب أخرى تتطلب تسليم الجنين في درجات الحرارة وبرودة ليست دائما تنطبق على بعض سلالات من الفئران بما BALB / ج ^6. تم تطوير الاثيلين غليكول first التزجيج المستندة إلى كاساي وآخرون. في عام 1990 ^5،7. لأنه الأسلوب الأمثل لقش البلاستيك الأصلي والحاويات ، ونحن قد عدلت قليلا عن البروتوكول cryotubes ، والتي يمكن الوصول إليها بسهولة أكثر في المختبرات وأكثر مقاومة للأضرار المادية. لذا ، قد يكون أسلوب التزجيج الموصوفة هنا يكون التطبيقlicable إلى العديد من المختبرات باستخدام الفئران كنماذج البحوث. ويمكن أيضا أن تكون نفس الطريقة المستخدمة لأجنة فئران في مراحل morula والكيسة أجنة الفئران ⁸ و ^9. ومع ذلك ، فقد وجدنا مؤخرا أن نوعية cryotubes قد تؤثر على معدلات البقاء على قيد الحياة من أجنة بعد ذوبان التجميد. وهكذا ، فإنه لا بد من دراسة سطح داخل cryotubes لسلاسة في الأجنة قبل التزجيج (على سبيل المثال ، انظر الجدول في الكواشف محددة والمعدات).

أساليب التزجيج لها مزايا عديدة أكثر من الطرق التقليدية التجميد البطيء ، ولكن لديهم أصلا في وضع غير موات بالنسبة لغرض النقل. كما ينبغي أن تبقى في الأجنة المزجج أدناه -120 درجة مئوية للحفاظ على بقائها ، وهي تستخدم عادة لنقل الشحن الجاف بشكل آمن. الشاحنين جافة ثقيلة وضخمة ، ولها ذهابا وإيابا أمر مكلف ، وخصوصا في النقل الدولي. نحن الآن حاليا بتطوير أسلوب التزجيج جديدةوالتي يمكن أن تكون مخزنة في الأجنة المزجج الجليد الجاف في درجة الحرارة (نحو -80 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 7 أيام ^10. هذا الأسلوب يجب أن يكون التزجيج للجيل القادم.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin	Merck & Co., Inc.	12657
Ethylene glycol	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	058-00986
Ficoll 70	GE Healthcare	17-0310-10
Glucose	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	041-00595
NaCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	191-01665
KCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	163-03545
KH2PO4	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	169-04245
Na2HPO4·12H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	500-04195
MgCl2 ·6H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	135-00165
CaCl2 ·2H2O	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	031-00435
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P-4687
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-8574
Sucrose	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	196-00015
M16 medium	Sigma-Aldrich	M7292
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167
Cryotube	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	MS-4501	“Cryogenic Vial”