Summary
כדי להעריך פרדיגמות טיפולית חדשנית לטיפול glioma, מודלים פיזיולוגיים חיוניים הרלוונטיים. אנו מנצלים הליך מושתלת בורג מדריך להקמת מודלים xenograft תוך גולגולתי כי הוא מהיר יותר ובטוח יותר מאשר גישות stereotactic.
Abstract
השתלת תאים סרטניים של אדם לתוך המוח של עכברים immunosuppressed היא שיטה שהוקם לחקר סרטן המוח כולל גליובלסטומה (גליומה) ו מדולובלסטומה. הגישה stereotactic בשימוש נרחב רק מאפשר הזרקה של חיה אחת בכל פעם, הוא עבודה אינטנסיבית ודורשת ציוד מיוחד מאוד. בורג המדריך השיטה, שפותחה לראשונה על ידי לאל et al., 1 פותחה כדי למנוע הליכים stereotactic מסורבלת. כעת אנו מתארים בורג שונה מדריך גישה מהירה ובטוחה באופן יוצא דופן, הן אלו שיקולים אתיים קריטי. יש לציין, נוהל שלנו עכשיו משלבת משאבת עירוי המאפשר עד 10 חיות להיות מוזרק בד בבד עם תאים סרטניים.
כדי להדגים את התועלת של הליך זה, הקמנו האדם תאים glioma U87MG כמו xenografts תוך גולגולתי בעכברים אשר טופלו אז עם AMG102; נוגדן אנושי מלא להפנות HGF / גורם פיזור כעת בתהליך 2-5 הערכה קלינית. הזרקת מערכתית של AMG102 ממושך משמעותית את ההישרדות של כל העכברים עם xenografts U87MG תוך גולגולתי וגרם למספר מרפא להשלים.
מחקר זה מוכיח כי שיטת בורג מדריך היא גישה זולה, לשחזור במיוחד להקמת xenografts תוך גולגולתי. יתר על כן, הוא מספק מודל פיזיולוגיים רלוונטיים אימות אסטרטגיות טיפולית חדשנית לטיפול בסרטן המוח.
Protocol
1. שורות תאים
- U87MG glioma הם תאים בתרבית רקמה גדול תרבות צלוחיות עם DMEM-F12 בתוספת 5% נסיוב עוברי שור (FBS).
- תאים נקצרים על ידי שטיפה צלוחיות פעמיים עם בופר פוספט חם (PBS) וכן דוגרים אותם 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם 10 מ"ל של PBS המכילה טריפסין 0.25% ו 0.05% EDTA. לאחר התאים הרים, הם ממוקמים לתוך צינור 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של התקשורת בתרבות centrifuged (300 גרם X דקות 4).
- בעקבות לשטוף, תאים resuspended בריכוז של 10 x 10 6 / ml בתקשורת תרבות, שאיפשר הרכבה של 50,000 תאים / 5 μl.
- תאים הם שמרו על הקרח עד הזרקה תוך גולגולתי.
2. מדריך בורג נעילה תוך גולגולתי
הליך זה יכול להתבצע מספר ימים לפני הזרקה של תאים. הנהלים כל המתואר כאן בוצעו בתנאים סטריליים קפדניים.
- עכברים (BALB / c נו / נו נקבה, 5-6 שבועות, כ 18g) ממוספרים למטרות זיהוי, שקלו anesthetised עם זריקה (IP) intraperitoneal מתערובת של קטמין (100 מ"ג / ק"ג) ו xylazine (5 מ"ג / ק"ג).
- העור הוא ניגב את פתרון יוד חתך קטן (2-3 מ"מ) נעשית בצד הימני של קו האמצע ו קדמית לקו interaural. זה חושף את התפרים העטרה ועל sagittal הגולגולת. גבחת ממוקמת בצומת של שני התפרים.
- בורג המדריך נקודת כניסה ואז מסומן בנקודה 2.5 מ"מ לרוחב ו - 1 מ"מ הקדמי כדי גבחת. נקודה זו ממוקמת ישירות מעל גרעין caudate 1.
- 1 x 1 מ"מ חור עמוק הוא קדח ביד סטרילי נערך תרגיל טוויסט דרך הגולגולת אל דורא.
- בורג מדריך מעוקרים כי ירחיבו 1.6 מ"מ מתחת לפני השטח גולגולות לתוך הדורה הוא מוברג אז עם נהג בורג לתוך החור עד מיושר עם הגולגולת (איור 1A).
- Stylet סטרילי או דמה הבורג ממוקם מכן לתוך חור הבורג המרכזי של המדריך כדי לסגור את הפתח (איור 1B).
- הפצע נסגר עם דבק רקמות Vetbond (n-בוטיל cyanoacrylate) ואת העכברים מקבלים זריקה intraperitoneal של reversine (חיות קטנות) (0.1 מ"ל / ק"ג) ו carprofen (5 mg/kg/100 μl) על כאבים. עכברים מותר אז כדי להתאושש על מחצלת התחממות (36 ° C), אשר עשוי להימשך עד 20 דקות. עכברים מנוטרים בתדירות גבוהה נצפתה בתקופה זו התאוששות עד שהם בהכרה מלאה.
3. Engraftment הסלולר תוך גולגולתי
- מזרק סטרילי אזוקות המילטון מוכן ידי החלת טבעת פלסטיק קטנה עד קצה המחט ומאפשר רק 2 מ"מ של המחט להאריך מתחת לשקע את הבורג מדריך (איור 1B). נקודת הרכבה הסופי ולכן הוא 3.5 מ"מ מתחת לפני השטח את הגולגולת.
- ארבעה ימים לאחר הניתוח את הבורג מדריך, עכברים הם שוב הרדים לעיל (2.1) ו חתך קטן הוא עשה מעל הבורג מדריך להסרת stylet.
- מזרק אזוקות המילטון הוא מלא אז עם 5 μl של תאים מעורבים גם לקחת אמצעי זהירות כדי לא ליצור או לערוך כל בועות האוויר.
- מזרק הוא מאובטח המשאבה זלוף ואת המחט מוחדרת לתוך בורג את המדריך (תרשים 1C). התאים הם חדורים אז בשיעור של 30 μl לשעה.
- המנגנון האוטומטי (איור 1D) אפשרה לנו להזריק עד 10 חיות בכל פעם בקצב זרימה מתמדת. תאים יכולים גם להיות מוזרק באופן ידני באמצעות מזרק אזוקות המילטון או לחילופין המזרק ניתן אזיקים על ידי טיפ 200 פיפטה μl כי כבר גזוז של 3 מ"מ על מנת לאפשר את קצה מחט להרחיב מעבר לדפוק את המדריך של 2 מ"מ. הזריקה חייבת אז להתבצע בקצב קבוע קבוע.
- כאשר עירוי תושלם, המזרק הוא הוציא בזהירות את stylet מוחלף לתוך בורג את המדריך. הפצע מודבק סגור העכברים ניתנות תרופות התאוששות כמו קודם (2.7) ואיפשר להתאושש על מחצלת ההתחממות.
4. טיפולית אתגר
- ארבעה ימים לאחר חיסון התא U87MG, עכברים הם שקלו וחילקו באקראי לתוך מלאה קבוצות הטיפול.
- בקבוצת הביקורת ניתן התוך צפקי (IP) הזרקה של PBS (100 μl), ואילו בקבוצת הטיפול ניתנת זריקה IP של AMG102 (100 מיקרוגרם ב 100 μl של PBS).
- זריקות חוזרות מדי יום שני במשך 14 ימים, סך של 6 זריקות (איור 2).
- לאחר הזריקה האחרונה, עכברים מנוטרים יומי שקל כל יום שני.
- כאשר העכברים החלו להציג משמעותי בתפקוד הנוירולוגי (הפרעה באיזון, שיתוק), התייבשות, או ירידה במשקל של יותר מ 10% או גוסס, הם היו euthanised אנושי. אנושי אלה נקודת הסיום ימים נרשמו אז על עקומת Kaplan-Meier ההישרדות.
5. הערכת יעילות טיפולית
6. נציג התוצאות:
חיות בקרת החלה להראות סימנים של הפרעה נוירולוגית וירידה במשקל 23 ימים לאחר חיסון ראשוני של תאים. זו התעכבה באופן משמעותי בקבוצה שטופלה AMG102 עד 35 ימים. ואכן ביום 35, 77% (n = 09/07) של קבוצת הביקורת היו מורדמים. עקומת Kaplan-Meier הישרדות מדגים בבירור את הגידול המשמעותי הישרדות התגובה לטיפול AMG102 (איור 3). ביום 70, 88% של עכברים שליטה היו מורדמים (n = 09/08) לעומת 37% (n = 3 / 8) של קבוצת AMG102 טיפול. ניתוח היסטולוגית של המוח אישר כי כל בעלי חיים 9 בקבוצת הביקורת פיתחו גידולים לעומת 3 בלבד של 8 AMG102 העכברים שטופלו (איור 4).
איור 1: תמונה (A) מראה בורג מדריך תוך גולגולתי ממוקם באזור ממוקם ישירות מעל גרעין caudate. אזוקות המילטון מזרק (טעון מראש עם תאים) ממוקמת ואז בתוך בורג מדריך כך 2 מ"מ של מחט חורג מדריך לבין התאים מוזרקים 3.5 מ"מ בתוך גרעין caudate. המזרק הוסר מאוחר יותר הוחלף על ידי stylet (B). מכשיר העירוי האוטומטי (ג) ניתן להזריק עד 10 בעלי חיים בכל פעם. המוצג כאן חמש זריקות סימולטני (ד ').
איור 2: סכמטי של פרוטוקול המחקר. הוזרקו תאים ביום 0 עם הטיפול החל ביום 4. חיות בקרת קיבלה זריקה של PBS (100 μl) IP ואילו קבוצת הטיפול קיבלה זריקה של AMG102 (100 μg/100 μl) IP. זריקות אלו ניתנו כל היום השני במשך 10 ימים. סך של 6 זריקות ניתנו. בעלי חיים היו במעקב במשך 70 ימים ואז סימנים של הפרעות נוירולוגיות פיזית.
איור 3: Kaplan-Meier עקומת ההישרדות השוואה מלאה AMG102 העכברים שטופלו. הישרדות משמעותי הושג לאחר טיפול עם AMG102 (p = 0.005).
איור 4: Microphotographs סעיפים המוח העטרה הוכחת התפתחות הגידול של חיות מלאה (א) ולא התפתחות המוח הגידול של בעלי חיים שטופלו AMG102 (B). בר סולם הוא 1 מ"מ.
Discussion
המדריך תוך גולגולתי בורג השיטה המוצגת כאן מאפשרת הקמת לשחזור מהיר של xenografts תוך גולגולתי וכן בידי טכנאי מיומן בעל חיים, הליך זה מתבצע בקלות רבה ללא צורך בהתקן stereotactic. השיטה שלנו משלבת את השימוש של בורג מדריך, כדי לאתר במדויק את האזור של המוח המתאים ביותר בהתפתחות הגידול vivo, ואת משאבת עירוי אוטומטי המאפשר חיסון בו זמנית של עד 10 בעלי חיים בכל פעם. בורג מדריך הליך הגדלת לוקח פחות מ 5 דקות לבצע. עירוי של תאים אוטומטיות ב 30 μl / שעה לוקח רק 10 דקות עבור נפח של 5 μl. זה מבטיח מינון מדויק בקצב קבוע מפחיתה את הסיכון של גירוש תא לאזור נוסף גולגולתי עקב לחץ תוך גולגולתי מוגבר. יש לנו גם ביצע הליך זה עם 10 כרכים μl ולא נצפו כל צמיחה נוספת גולגולתי גידול עקב ריפלוקס הסלולר. כמו משאבת אינפוזיה אוטומטיות מאפשר גם מספר חיות לקבל חיסונים בו זמנית אנו יכולים להזריק עד 60 חיות לשעה לעומת הליך stereotactic אשר מוגבל כ 15 חיות לשעה.
השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא המיקום של בורג מדריך בגולגולת כמו מעמדה קובעת את המיקום הסופי של עיקר הגידול. אם בורג מדריך מרכזי מדי, התאים יהיה מוזרק באזור בין שתי האונות במוח ואילו אם מדריך מושם על הרבה קדימה, התאים לא יהיה שהוזרקו למוח בכלל. לכן חיוני כדי להיות מדויקת ככל האפשר באיתור 2.5 מדריך מ"מ לרוחב ו - 1 מ"מ הקדמי של גבחת 1. במחקר זה השתמשנו בורג מדריך פלדה, למרות ברגים מדריך פלסטיק זמינים גם עבור אלו שדורשים מחקרים הדמיה מוחית כגון MRI או PET 6. אפילו אם משאבת אינפוזיה אוטומטיות היא עלות אוסרני עבור קבוצות מסוימות, התאים עדיין יכול להיות מוזרק ידנית במהירות רבה יותר מאשר גישות stereotactic. באופן כללי, שיטה זו מהירה, מדויקת לשעתקו יכול לשמש כדי ללמוד, glioma מדולובלסטומה ו גזע גידולים במוח 7. פרוצדורה זו שבוצעה על מעל 500 עכברים בין שתי מעבדות עם מקרי מוות עקב תגובות בלתי צפויות הרדמה (<1%). עכברים שהיו מוברג עם בורג את המדריך חדורים לאחר מכן עם תאים לא למות או לסבול סיבוכים נוירולוגיים כתוצאה של ההליך. בעלי חיים שרדו בעבר 100 ימים ללא סיבוכים כלשהם. למרות שאנו מעדיפים להשתמש בעכבר שיער, עכבר חיסונית פגיעה בשיער כמו SCID יהיה בדיוק כמו המתאימה בתנאי שיער הגולגולת שהוסר לפני הניתוח כדי לשמור על האתר נקי כדי למנוע שיער להפריע בורג מדריך.
ישנם כיום מספר הרפוי הרומן שמפתחת לטיפול glioma 8-10. לאחרונה הראינו כי תת עורית U87MG xenografts glioma יכול להיות מעוכבים על ידי טיפול AMG102 3; נוגדן אנושי להפנות HGF כעת בתהליך הערכה קלינית glioma 5. השתמשנו בשיטת לתאר כאן כדי להקים גידולים תוך גולגולתי U87MG במוחם של עכברים בעירום. המחקר שלנו מראה בבירור את התועלת של השיטה ומדגים כי AMG102 משמעותית מעכב את צמיחת xenografts U87MG orthotopic. אנו נמשיך להשתמש במודל זה כדי לקבוע מה ותרופות אחרות ניתן להשתמש בשילוב עם AMG102 להשיג עיכוב יעיל יותר של הגידול.
Disclosures
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של חברת Amgen
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות Verlene הנרי הולמס לינדזי לסיוע בפיתוח המודל הזה. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי ג'יימס ס 'מקדונל קרן (# 220020173).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| FCS | Bovogen | SFBS | |
| Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Balb/c nu/nu mice | ARC Perth | ||
| Screw Holder | Plastics One | SD-1 | |
| Drill Holder | Plastics One | DH-1 | |
| Drill Bit | Plastics One | D#60 | |
| Screw guide (metal) | Plastics One | C212SG | |
| Screw Dummy (stylus) | Plastics One | C212SD | |
| Hamilton Syringe (10 μl 26g cemented needle) | Grace Division Discovery Science | 80075 | |
| PHD 22/2000 infusion pump | Harvard Apparatus | 70-2003 | Optional |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Thermo pad | Harvard Apparatus | 340390 |
References
- Lal, S. An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals. J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).
- Jun, H. T. AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts. Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).
- Pillay, V. The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases. Neoplasia. 11, 448-458 (2009).
- Buchanan, I. M. Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102. J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).
- Wen, P. Y. A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma. Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).
- Caretti, V. Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model. Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).
- Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization. Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).
- Johns, T. G. The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization. Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).
- Scott, A. M. A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).
- Niyazi, M. Therapeutic options for recurrent malignant glioma. Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).
