Summary
Для оценки новых терапевтических парадигм для лечения глиомы, физиологические соответствующих моделей имеют важное значение. Мы используем имплантируемых процедуры винт руководства для создания моделей внутричерепного ксенотрансплантата, который является более быстрым и безопасным, чем стереотаксической подходы.
Abstract
Пересадка человеческих опухолевых клеток в мозге мышей иммунитетом является признанным методом для изучения рака мозга в том числе глиобластомы (глиомы) и медуллобластомой. Широко используется стереотаксическая подход позволяет только для введения одного животного за один раз, является трудоемким и требует высокой специализированного оборудования. Метод руководства винт, первоначально разработанный Лал и соавт., 1 был разработан для устранения обременительные процедуры стереотаксической. Опишем изменение подхода руководства винт, который является быстрым и исключительно безопасным; обе из которых имеют важное значение этических соображений. Примечательно, что наша процедура теперь включает инфузионный насос, который позволяет до 10 животных, чтобы быть одновременно вводили опухолевые клетки.
Чтобы продемонстрировать полезность этой процедуры, мы создали человеческие клетки глиомы U87MG как внутричерепное ксенотрансплантаты у мышей, которые были затем обрабатывают AMG102, полностью человеческие антитела, направленные на HGF / разброс фактора в настоящее время проходит клинические 2-5 оценки. Системное введение AMG102 значительно увеличивал выживаемость всех мышей с внутричерепной ксенотрансплантаты U87MG и в результате число полных лечит.
Это исследование показывает, что метод руководства винт недорогой, высокой воспроизводимостью подход к созданию внутричерепного ксенотрансплантаты. Кроме того, он предоставляет соответствующую физиологическую модель для проверки новых терапевтических стратегий для лечения рака мозга.
Protocol
1. Клеточные линии
- U87MG глиомы клетки культивируют в больших тканевых культур колбы с DMEM-F12 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).
- Клетки собирали стиральной колбы дважды с теплым фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубации их при 37 ° С в течение 5 минут с 10 мл PBS, содержащем 0,25 трипсина% и 0,05% ЭДТА. Как только клетки поднимаются, они помещаются в 50 мл пробирку, содержащую 10 мл питательной среды и центрифугировали (300 X г в течение 4 мин).
- После мытья, клетки ресуспендировали в концентрации 10 х 10 6 / мл в культуре средств массовой информации, что позволило прививки 50 000 клеток / мкл 5.
- Клетки хранятся на льду до внутричерепных инъекций.
2. Руководство винта внутричерепное болтов
Эта процедура может быть проведена за несколько дней до введения клеток. Все процедуры, описанные здесь были проведены под строгим стерильных условиях.
- Мыши (BALB / с ню / ню женщины; 5-6 недель, и примерно 18 г) пронумерованы в целях идентификации, взвешивают и anesthetised с внутрибрюшинно (IP) инъекция смеси кетамина (100 мг / кг) и ксилазина (5 мг / кг).
- Кожа протирать с раствором йода и маленький разрез (2-3 мм) производится по правой стороне от средней линии и впереди interaural линии. Это подвергает корональной и сагиттальной швов черепа. Брегмы расположена на стыке этих двух швов.
- Вступления руководство винт точка затем отмечено в точке 2,5 мм боковые и 1 мм впереди брегмы. Эта точка находится прямо над хвостатого ядра 1.
- 1 х 1 мм в глубину отверстия сверлят с стерильных ручной поворот просверлить череп оболочки.
- Стерилизовать винт руководство, которое будет распространяться 1,6 мм ниже поверхности черепа в оболочку, затем ринулся в отверстие с помощью отвертки, пока на одном уровне с черепом (рис. 1А).
- Стерильные стилет или винт манекен затем помещается в центральное отверстие направляющей винт, чтобы закрыть отверстие (рис. 1В).
- Рана закрыта с Vetbond клей ткани (н-бутил цианоакрилат) и мышей приведены внутрибрюшинного введения reversine (мелкие животные) (0,1 мл / кг) и carprofen (5 mg/kg/100 мкл) для обезболивания. Мыши затем позволили восстановить на потепление мат (36 ° C), которая может занять до 20 минут. Мыши часто контролируется и наблюдается в течение этого времени на восстановление, пока они не в полном сознании.
3. Внутричерепное сотовой приживления
- Стерильный шприц манжетами Хэмилтон готовится с применением небольшого кольца до кончика иглы, допуская только 2 мм иглой расширить ниже розетки руководство винт (рис. 1В). Конечная точка прививки, следовательно, 3,5 мм ниже поверхности черепа.
- Через четыре дня после операции винт руководства, мышей снова под наркозом, что и выше (2,1) и небольшой разрез делается над руководство винт для удаления стилет.
- Манжетами шприц Гамильтон затем заполняется 5 мкл и смешанных ячеек принимать меры предосторожности, чтобы не создавать или составлять любые воздушные пузыри.
- Шприц крепится к перфузии насос и игла вводится в винт руководство (рис. 1в). Затем клетки переплетаются в размере 30 мкл в час.
- Автоматизированные аппараты (рис. 1D) позволило нам внедрить до 10 животных одновременно с постоянной скоростью потока. Клетки могут также быть введены вручную с помощью шприца Hamilton манжетами или же шприц можно манжетами по 200 мкл кончика пипетки, которые были сокращены на 3 мм, чтобы кончик иглы выходить за рамки руководства винт на 2 мм. Инъекция должна быть выполнена на постоянном устойчивыми темпами.
- Когда настой будет завершена, шприц, тщательно удалены и заменены стилет в руководстве винт. Рана клееного закрыты и мышей приведены восстановления лекарства как и раньше (2.7) и позволил восстановить на потепление мат.
4. Терапевтические проблемы
- Через четыре дня после прививки U87MG клетки, мышей взвешивали и случайным образом разделены на контроль и лечение групп.
- Контрольную группу дано внутри-перитонеального (IP), инъекции PBS (100 мкл), в то время как лечение группе задается IP-инъекция AMG102 (100 мкг в 100 мкл PBS).
- Инъекции повторяются каждый второй день в течение 14 дней, всего 6 инъекций (рис. 2).
- После последней инъекции, мышей контролируется на ежедневной основе и весил каждый второй день.
- Когда мыши стали проявлять значительную неврологических нарушений (нарушение баланса, паралич), обезвоживание, или более чем на 10% потери веса или умирающим, они были гуманно euthanised. Эти гуманные конечной точки дней затем были записаны на выживаемости Каплана-Мейера кривой.
5. Оценка терапевтической эффективности
6. Представитель результаты:
Контрольные животные стали проявлять признаки неврологических нарушений и потерю веса 23 дней после первой прививки клеток. Это было значительно задерживается в AMG102 группе терапии до 35 дней. Действительно, по 35-й день, 77% (п = 7 / 9) в контрольной группе были умерщвлены. Выживаемости Каплана-Мейера кривой наглядно демонстрирует значительное увеличение выживаемости в ответ на AMG102 лечения (рис. 3). Днем 70, 88% контрольных мышей были умерщвлены (п = 8 / 9) по сравнению с 37% (п = 3 / 8) из AMG102 группе терапии. Гистологический анализ мозга подтвердило, что все 9 животных в контрольной группе, развились опухоли по сравнению с только 3 из 8 AMG102 мышей (рис. 4).
Рисунок 1: Image () показывает, внутричерепное винт руководства расположены в районе, расположенном непосредственно над хвостатого ядра. Манжетами Гамильтон шприц (с предустановленной клетки) помещают внутрь руководство винт так, чтобы 2 мм игла выходит за рамки руководства и клетки вводят 3,5 мм внутри хвостатого ядра. Шприц позже удален и заменен стилет (B). Автомат инфузии (C) может внедрить до 10 животных одновременно. Здесь показаны пяти одновременных инъекций (D).
Рисунок 2: Схема протокола исследования. Клетки вводили в день 0 лечения начиная с 4-й день. Контрольные животные получали инъекции PBS (100 мкл) IP в то время как лечение группа получала инъекции AMG102 (100 μg/100 мкл) IP. Эти инъекции были даны каждый второй день в течение 10 дней. Всего 6 инъекций дали. Животные были тогда мониторинг в течение 70 дней признаки неврологических и физических нарушений.
Рисунок 3: Каплан-Майера выживания кривой сравнения контроля и AMG102 мышей. Значительные выживания была получена после лечения AMG102 (р = 0,005).
Рисунок 4: Микрофотографии корональные разделы мозга демонстрирующие развитие опухоли у контрольных животных (А) и не опухоль головного мозга развития в AMG102 подопытных животных (B). Шкала бар 1 мм.
Discussion
Внутричерепное метод винт руководство представленные здесь позволяет быстро и воспроизводимые создание внутричерепного ксенотрансплантаты и в руках квалифицированный специалист животных, эта процедура очень легко выполняется без необходимости стереотаксического устройства. Наш метод сочетает в себе использование руководства винт, чтобы безошибочно находить область мозга, наиболее пригодных для развития опухоли в живом организме, и автоматизированные насос инфузий, что позволяет одновременно прививки до 10 животных одновременно. Увеличение руководство винт процедура занимает менее 5 минут для выполнения. Автоматизированные инфузии клеток в 30 мкл / час занимает всего 10 минут на 5 мкл. Это обеспечивает точное дозирование с постоянной скоростью и уменьшает риск клеточной изгнание в экстра-черепной области из-за повышенного внутричерепного давления. Мы также выполнили эту процедуру с 10 мкл объемы и не наблюдали каких-либо дополнительных черепно-рост опухоли из-за сотового рефлюкса. Как автоматизированные насос вливания также позволяет несколько животных, чтобы быть одновременно прививку можно вводить до 60 животных в час по сравнению с стереотаксической процедура, которая ограничена примерно 15 животных в час.
Наиболее критичным этапом в этой процедуре является расположение руководства винт в черепе, как ее положение определяет конечную расположения опухоли навалом. Если руководство винт слишком центральных, клетки будут вводится в область между двумя полушариями мозга в то время как, если руководство находится в далеко вперед, клетки не будет выведена на мозг на всех. Поэтому крайне важно, чтобы быть как можно более точным в поиске руководства 2,5 мм боковые и 1 мм впереди брегмы 1. В данном исследовании мы использовали винт сталь руководство, хотя пластиковые винты руководство также доступны для тех исследований, которые требуют визуализации головного мозга, таких как МРТ или ПЭТ 6. Даже если автоматизированные насос настой сопряжено с запретом для некоторых групп, клетки все еще может быть введен вручную быстрее, чем стереотаксической подходы. В целом, это быстрый, точный и воспроизводимый метод может быть использован для изучения глиомы, медуллобластомой и опухоли ствола головного мозга 7. Эта процедура была выполнена на более чем 500 мышей между двумя нашими лабораториями с смертей от непредвиденной реакции анестезии (<1%). Мыши, которые были болтами с гидом винт, а затем придают с клетки не умирают или страдают какой-либо неврологических осложнений в результате процедуры. Животные выжили последние 100 дней без каких-либо осложнений. Хотя мы предпочли использовать голые мыши, с ослабленным иммунитетом мышь с волосами, как SCID будет только по мере необходимости при условии, череп волосами был удален до операции для поддержания сайта чистым и не допустить вмешательства в волосах руководство винт.
Есть несколько новых терапии в настоящее время разрабатываются для лечения глиомы 8-10. Недавно мы показали, что подкожный U87MG глиомы ксенотрансплантаты может быть запрещена путем обработки AMG102 3; гуманизированные антитела, направленные на HGF в настоящее время проходит клинические оценки в глиомы 5. Мы использовали метод описывать здесь, чтобы установить внутричерепного U87MG опухолей в мозге голым мышам. Наше исследование ясно показывает полезность метода и демонстрирует, что AMG102 достоверно тормозит рост ортотопической ксенотрансплантаты U87MG. Мы будем продолжать использовать эту модель, чтобы определить, какие другие терапии может быть использован в сочетании с AMG102 получить более эффективное ингибирование роста опухоли.
Disclosures
Эта работа была поддержана Исследовательский грант Amgen Инк
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Verlene Генри Холмс и Линдсей за помощь в разработке этой модели. Эта работа частично финансировалась Джеймс С. McDonnell Foundation (# 220020173).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | |
| FCS | Bovogen | SFBS | |
| Trypsin | Invitrogen | 15050065 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Balb/c nu/nu mice | ARC Perth | ||
| Screw Holder | Plastics One | SD-1 | |
| Drill Holder | Plastics One | DH-1 | |
| Drill Bit | Plastics One | D#60 | |
| Screw guide (metal) | Plastics One | C212SG | |
| Screw Dummy (stylus) | Plastics One | C212SD | |
| Hamilton Syringe (10 μl 26g cemented needle) | Grace Division Discovery Science | 80075 | |
| PHD 22/2000 infusion pump | Harvard Apparatus | 70-2003 | Optional |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Thermo pad | Harvard Apparatus | 340390 |
References
- Lal, S. An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals. J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).
- Jun, H. T. AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts. Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).
- Pillay, V. The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases. Neoplasia. 11, 448-458 (2009).
- Buchanan, I. M. Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102. J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).
- Wen, P. Y. A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma. Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).
- Caretti, V. Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model. Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).
- Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization. Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).
- Johns, T. G. The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization. Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).
- Scott, A. M. A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).
- Niyazi, M. Therapeutic options for recurrent malignant glioma. Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).
