Summary
Protocol
- تعد قناة ميكروفلويديك مع سطح CD4 + المضادة للbiotinlayted.
- ضخ 10 مليلتر من الدم في العينة 5 مل / دقيقة في قناة ميكروفلويديك مع ضخ حقنة.
- اخراج الدم في 20 مل / دقيقة لمدة 20 دقيقة مع برنامج تلفزيوني.
- حقن محلول مخفف FACS lysing (مخفف إلى 10 ٪ من الأسهم مع حل PBS) في 5ul/min لمدة 15 دقيقة.
- احتضان لمدة 15 دقيقة.
- حقن CD3 الابتدائي + الحل الأضداد (مخفف إلى 10 ٪ من الأسهم مع حل PBS) في 5 مل / دقيقة لمدة 20 دقيقة.
- احتضان لمدة 2 ساعة.
- طرد قناة مع برنامج تلفزيوني في 5 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
- ضخ 20 ٪ AF488 CD4 + الأضداد ، و 0.2 ٪ محلول المخزون دابي ، و 10 ٪ CD3 الثانوية في الضد + 5 مل / دقيقة لمدة 20 دقيقة في نفس الوقت.
- احتضان لمدة 20 دقيقة.
- طرد قناة مع برنامج تلفزيوني في 5 مل / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
- عدد الخلايا تحت المجهر الفلورسنت :
- أبيض (بصري) -- الأسود والأبيض : خلية والغبار
- الأشعة فوق البنفسجية (دابي) -- أزرق : الخلية فقط
- الأزرق (CD4 +) -- الأخضر : T - اللمفاويات والوحيدات
- الأخضر (CD3 +) -- الأحمر : T - اللمفاويات فقط
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS microchannel | Fabricated by SU-8 mold | |||
| Blood | Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital. | |||
| PBS | Buffer | Invitrogen | 14190 | 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline. |
| FACS lysing solution | BD Biosciences | 349202 | Diluted to 10% from stock solution with PBS. | |
| Anti-CD4+ biotinlayted Ab | Beckman Coulter Inc. | IM0704 | Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water. | |
| goat anti-hCD3delta | pAB | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-1128 | Diluted to 10% from stock solution with PBS |
| rabbit anti-goat IgG PE | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-3755 | Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS | |
| anti-human CD4+ | BD Biosciences | 557695 | Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS. | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS. |
